第四章 克隆载体的特征及类型
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第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
2、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测； 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因 插入；
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
生物基因克隆载体的种类和特征
4、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启 动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒， 并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。
生物基因克隆载体的种类和特征
• 除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所 有的质粒都是DNA质粒。质粒DNA的大小：文献中有3种 说法： 小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD
生物基因克隆载体的种类和特征
1、质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
抑制蛋白 ↘
Cop
起始蛋白
↘ Rep
Pcop cop
P/Orep rep
ori
生物基因克隆载体的种类和特征
质粒复制控制的分子模型： • *抑制蛋白质稀释模型(Inhibitor dilution model)
③：注意：只有当有确切的证据表明第二种B质粒已经进入含有A质粒 的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但 这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和 B是不亲和的质粒。
④：不亲和群的概念： 彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。
两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）：质粒的复制受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以低拷 贝数量形式存在， 1 - 3 拷贝。（低拷贝数质粒） 松弛型复制控制的质粒（relaxed plasmid）：质粒的复制不受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以高拷 贝数量形式存在，10 - 60 拷贝。（高拷贝数质粒）
生物基因克隆载体的种类和特征
• 除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所 有的质粒都是DNA质粒。质粒DNA的大小：文献中有3种 说法： 小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD
生物基因克隆载体的种类和特征
1、质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
抑制蛋白 ↘
Cop
起始蛋白
↘ Rep
Pcop cop
P/Orep rep
ori
生物基因克隆载体的种类和特征
质粒复制控制的分子模型： • *抑制蛋白质稀释模型(Inhibitor dilution model)
③：注意：只有当有确切的证据表明第二种B质粒已经进入含有A质粒 的寄主细胞，而且它的DNA不受寄主细胞限制体系的降解作用，但 这两种细胞却不能长期共存，只有在这种情况下，我们才能说A和 B是不亲和的质粒。
④：不亲和群的概念： 彼此之间互不相容的质粒，属于同一不亲和群(incompatibility group)。
两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）：质粒的复制受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以低拷 贝数量形式存在， 1 - 3 拷贝。（低拷贝数质粒） 松弛型复制控制的质粒（relaxed plasmid）：质粒的复制不受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以高拷 贝数量形式存在，10 - 60 拷贝。（高拷贝数质粒）
动物基因工程—基因克隆载体
源DNA片段插人必需区
B、在非必需区组入选择标记基因
C、构建的λDNA载体不应小于36.4kb
基因工程载体构建
③用λDNA作载体比用质粒作载体的优点：
A、可容纳较大的外源DNA片段（15－23kb，质粒一般<10kb）
B、λDNA进入细菌细胞容易，不象质粒载体那样需要采用化学介导
法才能进入细菌细胞
物细胞（或蓝藻细胞）中进行高效表达。
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
构建植物病毒克隆载体的基本策略是：
对病毒DNA（包括RNA反转录的DNA）进行加工，消除其对植物的致
病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因导
入植物细胞。
目前应用最多的植物病毒克隆载体是：利用CaMV（花椰菜花叶病毒）
TGMV）、非洲木薯花叶病毒（ACMV）、玉米线条病毒（MSV）、小麦矮缩病毒
（WDV）
RNA病毒：雀麦草花叶病毒（BMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）、蕃茄丛矮病
毒（TBSV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草蚀刻病毒（
TEV）、李痘病毒（PPV）等
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
根据这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体，把
感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌体载体 。
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
（1）λ噬菌体克隆载体
①λDNA构建克隆载体的依据：
A、λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感
动 物 生 物 技 术
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
B、在非必需区组入选择标记基因
C、构建的λDNA载体不应小于36.4kb
基因工程载体构建
③用λDNA作载体比用质粒作载体的优点：
A、可容纳较大的外源DNA片段（15－23kb，质粒一般<10kb）
B、λDNA进入细菌细胞容易，不象质粒载体那样需要采用化学介导
法才能进入细菌细胞
物细胞（或蓝藻细胞）中进行高效表达。
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
构建植物病毒克隆载体的基本策略是：
对病毒DNA（包括RNA反转录的DNA）进行加工，消除其对植物的致
病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因导
入植物细胞。
目前应用最多的植物病毒克隆载体是：利用CaMV（花椰菜花叶病毒）
TGMV）、非洲木薯花叶病毒（ACMV）、玉米线条病毒（MSV）、小麦矮缩病毒
（WDV）
RNA病毒：雀麦草花叶病毒（BMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）、蕃茄丛矮病
毒（TBSV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草蚀刻病毒（
TEV）、李痘病毒（PPV）等
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
根据这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体，把
感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌体载体 。
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
（1）λ噬菌体克隆载体
①λDNA构建克隆载体的依据：
A、λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感
动 物 生 物 技 术
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因克隆的载体 PPT课件
基因克隆的载体
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
克隆载体
移到M13mp载体，进行DNA 移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究 M13mp载体 DNA测序和体外突变等研究
2011-122011-12-9
16
蓝白斑筛选原理
pUC18/pUC19上含有一个LacZ基因的调控序列和编码β-半乳糖苷 基因的调控序列和编码β
酶N端146个氨基酸的序列（α-互补肽）的DNA序列（标记为lacZ’ 146个氨基酸的序列（ 个氨基酸的序列 互补肽） DNA序列（ 序列 ），多克隆位点就存在于lacZ’上 多克隆位点就存在于lacZ β-半乳糖苷酶的C端编码基因却位于相应的宿主菌上 半乳糖苷酶的C 只有当这两个部分基因产物（缺陷型β-半乳糖苷酶）结合才会形 只有当这两个部分基因产物（缺陷型β 半乳糖苷酶） 成一个有活性的β 半乳糖苷酶。这种机制称为α 成一个有活性的β-半乳糖苷酶。这种机制称为α-互补作用 比如pUC18/pUC19转化到含部分β-半乳糖苷酶基因的细菌细胞中 转化到含部分β ，就可以产生有活性的β-半乳糖苷酶 就可以产生有活性的β
一种由质粒和λ噬菌体cos 一种由质粒和λ噬菌体cos尾巴构建复合载体 cos尾巴构建复合载体
4.
M13载体 13载体
一类专门用于Sanger法测序的载体 一类专门用于Sanger法测序的载体 Phagemid载体 一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体
5.
2011-122011-12-9
6
I
细菌质粒 载体
去掉不必要的DNA区域, 只保留质粒复制必须部分， 去掉不必要的DNA区域, 只保留质粒复制必须部分，以 DNA区域 提高外源DNA DNA装载量 提高外源DNA装载量 减少质粒内限制性内切酶位点，质粒酶切位点过多，给 减少质粒内限制性内切酶位点，质粒酶切位点过多， 克隆外源DNA DNA造成不便 克隆外源DNA造成不便 加入选择性标记：通过质粒间的重组使质粒携带合适标 加入选择性标记： 常用的有抗生素抗性标记。 记，常用的有抗生素抗性标记。如：氨苄青霉素抗性标 四环素抗性标记、 记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等 安全性能改造：不能随便转移， 安全性能改造：不能随便转移，以免污染环境 改造或增加基因表达的调控序列： 改造或增加基因表达的调控序列：比如加入强启动子
克隆载体的基本特征
克隆载体的基本特征
在基因工程领域中，克隆载体起着至关重要的作用。
克隆载体是将外源DNA序列复制并存在于细胞内的一种工具，它具有多种基本特征，下面就让我们依次来了解一下。
一、线性结构
克隆载体通常采用环状DNA结构，但也可以是线性结构。
线性结构克隆载体的优点在于可以很好地进行基因编辑和引导组装，因为我们可以精确地将某个基因插入到DNA链中的任何一个点。
二、多克隆位点
多克隆位点是指克隆载体上多个限制酶切位点，它使得我们可以对载体进行切割和连接操作，使得新的DNA序列可以仿佛“搭积木”一样拼接在载体上，便于我们对其进行进一步的操作。
三、选择标记
克隆载体拥有选择标记，这是一种特殊的DNA序列，它可以帮助我们筛选特定类型的细胞，在细胞培养过程中对于有选择地优异细胞进行筛选。
一般选择标记的方法有抗生素抗性，酵母元素和抑制素敏感性等。
四、维护元素
维护元素是指克隆载体中的特定DNA序列，在细胞内起着非常重要的
作用。
维护元素可以帮助载体与某些DNA蛋白相互作用，防止修饰酶的降解，避免载体丢失，保持在细胞内的稳定状态。
五、操纵元件
操纵元件是指克隆载体中的特定DNA序列，可以控制表达外源基因的时间和数量，包括启动子、增强子和转录终止序列等，操纵元件的调节对于外源基因的表达水平和时间都有至关重要的影响。
以上就是克隆载体的基本特征，这些特征都是为了更好地进行基因工程和生物学研究所必不可少的。
当然，不同的克隆载体可能具有不同的特征，因此在使用的时候我们需要仔细选择适合自己实验的载体。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
噬菌体再感染。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
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质粒
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性 由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒
质粒的基本特征
5. 携带特殊的遗传标记 野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这 使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性 物质合成 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 抗生素、细菌毒素、有机碱
质粒
质粒的构建 天然存在的两种质粒 宿主细菌大肠杆菌， 20colE1宿主细菌大肠杆菌 6.5kb，松弛型复制20 colE1宿主细菌大肠杆菌，6.5kb，松弛型复制2030/cell pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell pSC101宿主细菌沙门氏菌，8.8kb，严谨型复制5/cell 宿主细菌沙门氏菌 ，标记基因为Tcr 标记基因为Tc
第二节 质粒
质粒的基本特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并 被稳定遗传的一类核酸分子；绝大多数的质粒是DNA型
质粒常见于原核细菌和真菌中
质粒DNA的分子量范围：1 - 200 kb
天然DNA质粒具有3种构型：共价闭合环状(cccDNA)、开环 (ocDNA)和线性(lDNA)构型。 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构， 即cccDNA Plasmid chromosome
在重组的 pGEM3Z载体中 pGEM3Z载体中 加入相应的RNA 加入相应的RNA 聚合酶， 聚合酶，可以 发生外源基因 转录。 转录。
质粒载体总体评价
操作简便 克隆容量有限（< 10kb）
质粒
质粒的基本特征
质粒的不相容性：分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒) 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pGEM-3Z： 多拷贝 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 装有两个噬菌体的强启动子 用于外源基因的高效表达
ori Apr pGEM-3E 2743 bp lacZ’ PT7 MCS PSP6
注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合 酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如： E.coli BL21（DE3）等
Tet平板 Tet平板
Amp Tet 插入片段
pBR322
Amp平板 Amp平板
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pUC18 / 19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 396 452
拷贝数 2000 - 3000 / cell 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ’ 用于基因克隆和测序
lacZ'
pUC18
2686 bp Apr
ori
pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基 因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ 基因内的一个小片段上。 pUC18的优点： 1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。 2) 重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal, IPTG，节约了一半的时间。 3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不 必连接linker。 4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插 入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和 体外定点突变。
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
Cop
Rep
Pcop
cop
P/Orep
rep
ori
质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
质粒
质粒的基本特征
2. 质粒的不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于 一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质 粒组成不相容性群。 以大肠杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
质粒
质粒的基本特征
质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制 控制复制引物与模板的结合
RNA II 3’ 5’
复制方向
5’ 3’
ori
RNA I
rop （+） ） Rop
E.coli ColE1 plasmid
RNAII是复制的正向调节分子，RNAI是复制的负调节物
质粒
质粒的基本特征
这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义
利用 抗性 基因 进行 重组 子的 筛选
质粒基因编码的特性
Fertility /F质粒：只含有tra基因，除了促进接合转移 外没有其他功能。 Resistance / R质粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因 。如RP4，发现于假单胞杆菌。 Col 质粒：编码大肠菌素，可以杀死其他细菌，如存 在于E. coli 中的CoE1。 降解质粒（Degradative plasmids）:可以降解特殊的分 子如：甲苯，水杨酸。 致瘤质粒（Virulence plasmids）：农杆菌Ti质粒。
pBR322 4363 bp
Sal I
Bal I
优点： 分子量小：4363bp, 容易纯化。 含有2个抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作为选择标记。而 且每一个标记基因都含有单一的酶切位点，可以插入DNA， amp基因内可被 Pst I, Pvu I, Sac I切开，而四环素抗性基 因可被BamH I, Hind III切开，通过插入失活筛选重组子。 受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。
理想的质粒载体应具备的条件
1. 2. 3.
分子量较小。 松驰型，在受体细胞中有较多的拷贝数。 具有一个以上的选择标记基因，形成重组质粒后，至少还要有 一个强的选择标记。 具有允许外源DNA片段克隆的位点，并且位于选择标记基因区 内，插入外源片段不影响质粒的复制功能。 能够导入寄主细胞，具备转化的功能。 操作简单方便，可根据需要加装其它元件，构建不同用途的质 粒载体。
4.
5. 6.
质粒人工构建的目的
天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点 少、遗传标记不理想等缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必 因而不适合用作基因工程的载体， 因而不适合用作基因工程的载体 须对之进行改造构建： 须对之进行改造构建： （1）加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择 ）加入合适的选择标记基因，如两个以上， （2）增加或减少合适的酶切位点，便于重组 ）增加或减少合适的酶切位点， （3）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量 ）缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率， （4）改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 ）改变复制子，变严紧为松弛， （5）根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件 ） 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。 方法就是重组，拼拼接接，挖肉补疮。
第四章 基因克隆的载体
载体的功能及特征 质粒（plasmid） 噬菌体或病毒DNA 粘粒（cosmid）与噬菌粒 人工染色体载体
载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。 能够运载外源DNA片段（目的基因）进入受体细胞，具有自 我复制能力，使外源DNA片段在受体细胞中得到扩增和表 达，不被受体细胞的酶系统所破坏的一类DNA分子。
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
pBR322： 松弛型复制 拷贝数 50 - 100 / cell 氯霉素可扩增 用于基因克隆
ROI ROP Origin of Replication Hind II Pvu I Pst I Apr Tcr EcoR I Cla I Hind III Pst I BamH I
自主复制型载体和附加载体的扩增方式
载体的类型
应用范围：克隆载体、表达载体。 应用对象：原核载体、真核载体（酵母、植物和动物） 、穿梭载体。 构建来源：质粒载体、病毒或噬菌体载体、质粒DNA与 病毒或噬菌体DNA组成的载体、质粒DNA与染色体DNA片 段组成的载体。
克隆载体(cloning vector)
质粒
质粒的基本特征
3. 质粒的可转移性 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到 另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用 如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒 的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和 mob 基因决定
质粒
质粒的基本特征
1. 质粒的自主复制性 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA的复制受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为 两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 1 - 5 拷贝 stringent plasmid 松弛型复制控制的质粒 10 - 60 拷贝 stringent plasmid