第三章 基因克隆的载体

没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
2. 质粒载体相关知识介绍
（4）pBluescript SK
pBluescript SK is similar to the pGEM vectors except that it also carries an origin of replication for a filamentous phage, f1. f1 uses a single stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
表达型质粒载体
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯 化的元件，主要用来使外源基因表达出 蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因臵于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
1.质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存
在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）, 拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）, 拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在 不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。
基因工程
华中师范大学生命科学学院 陈明清
《基因工程原理》
第一章 导 论
第二章 基因操作的工具酶
第三章 基因克隆的载体
第四章 基因克隆的策略
第五章 克隆基因的表达
第六章 基因工程的基本技术
第三章
引
基因克隆的载体
言（introduction）
第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 噬菌体载体（phage vectors）
can be used to generate ssDNA. If a host cell carrying such a plasmid, superinfection with phage f1 leads to production of phage containing plasmid DNA.
氯霉素扩增之后，每个细胞可达 1000~3000copy
④ 安全
失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。 不能通过接合转移。
pBR322的缺点 保留了转移蛋白（mob）的作用位点。
能够被ColK质粒编码的mob蛋白识别， 如果再有F质粒的参与，就有可能转移！
PBR322的改进 ① 删除mob识别位点 （如质粒pBR327、pAT153等）。 pAT153： 从pBR322上切去HaeII片断，既除 去了mob识别位点，又增加质粒的 拷贝数。
1.质粒的生物学特性
（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能
编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到 200kb。
（3）质粒的生存 在寄主细胞中“友好”地“借
居”，离开了寄主它本身无法复制，它可以赋 予 寄主一些非染色体控制的遗传性状，以 利于寄 主的生存。比如，对抗菌素的抗性，对重金属 的抗性等。
第三章
基因克隆的载体
引 言（introduction） 第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 噬菌体载体（phage vectors）
第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）
② 改造EcoR I 位点 pBR325：
使EcoRI 也成为插入失活型位点。 在pBR322位点上接入一段来自噬菌 体PICm的HaeII酶切片断（带有氯霉 素抗性基因cmlr）。 cmlr上也带一个EcoRI位点。
2. 质粒载体相关知识介绍
（2）pUC
University of California的J. Messing和J. Vieria于 1978年，在pBR322 的基础上改造而成。 属正选择载体。 pUC7、pUC8、 pUC9、pUC10、 pUC11、pUC18、 pUC19
（5）质粒的不亲和性两种亲缘关系密切的不同
质粒不能在同一宿主细胞中稳定共存。已鉴别出25个 以上大肠杆菌质粒的不亲和群，它们之间是相容的。
1.质粒的生物学特性
（6）质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和
线状双螺旋三种，
双螺旋共价闭合 环线状双螺旋 （两个裂口）
质粒空间构型与电泳速率
第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors）
第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）
第一节 质粒载体
（plasimid vectors）
1、质粒的生物学特性
2、质粒载体相关知识介绍
1.质粒的生物学特性
（1）质粒是一种广泛从在于细菌细胞中染色体以
外的能自主的复制
的裸露的环状双链 DNA分子，比病毒更 简单。在霉菌、蓝 藻、酵母和一些动 植物细胞中也发现 了质粒，目前对细 菌的质粒研究得比 较深入，特别是大 肠杆菌的质粒。
（2）长度
4363bp
（3）选择标记 氨苄青霉素和四环素抗性。
（4）克隆位点
24个克隆位点。
其中9个会导致Tetr基因失活（如 BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、 PvuI、Pst I）。
pBR322的优点 ① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择：
选择标记基因：在基
因工程中的一类用于选择 转化细胞（菌）的抗性基 因，通常是一些抗生素抗 性基因，比如对氨苄青霉 素、四环素、氯霉素、卡 那霉素以及潮霉素等具有 抗性的基因。这样，通过 在培养基中加入特定的抗 生素就可以选自得到转化 的细胞（菌）。
2. 质粒载体相关知识介绍
（1）PBR322
加反应液
C. 具备多克隆位点（MCS），而且可携带外源DNA片段的长 度范围较宽。
D. 自身分子量较小，在寄主细胞中的拷贝数高，易于操作和 DNA的制备。
Characteristics of vectors for gene cloning
Foreign gene
MCS
Marker
第三章
基因克隆的载体
引 言（introduction） 第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 噬菌体载体（phage vectors）
连接
pBR322 4363
Tet or Amp
Tet + Amp
CK+
pBR322： F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。 （1）元件来源
① 复制起点 ori pMB1系列（来源于ColE1） 的高拷贝型复制起点 ② Ampr基因 pSP2124质粒的Ampr基因 ③ Tetr基因 pSC101的Tetr 基因。
所以含有这类载体的菌落就很容易在含有底物 XGal和诱导物IPTG的平板上分辨出来。因为这类菌落中
释放出的蓝 色物质可以 将整个菌落 染成蓝色， 非常容易辨 别。
However, Cloning of DNA inserts into one of the unique sites in the polylinker can inactivates the lacZ gene and leads to colourless colonies on XGal/IPTG plates, allowing for ready detection of colonies carrying cloned DNA.
2）大肠杆菌操纵子元件
阻遏基因 I 操纵基因O 启动基因P 核糖体结合位点序列（SD） 转录终止信号区。
2. 质粒载体相关知识介绍
（ 4 ） pET
pET vectors are designed to allow the expression of cloned genes to proteins. pET-5 has a region encoding an eleven amino acid stretch of protein before EcoRI and BamHI restriction sites. Cloning into these sites results in expression of the cloned insert as a fusion protein. Use of NdeI enzyme in cutting vector and insert allows existed codon to be replaced by the initiation codon of the insert, resulting in expression of the insert with no fusion.
同一质粒尽管分子量相同，不同的构 型电泳迁移率不同：
scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。
OC L
SC
1.质粒的生物学特性
质粒的可转移性
革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：
• 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细 胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒 等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生
（1）元件来源 ① 复制起点 ② Ampr 基因 pBR322的 ori pBR322的Ampr基因
但其上失去了克隆位点。 ③ lacZ的启动子 ④ lacZ’基因
大肠杆菌lacZ的-肽链序列， 是LacZ 的氨基端片断。