基因克隆主要载体系统
基因克隆技术的基本步骤
基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。
在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。
本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。
一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。
目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。
质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。
大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。
2. 合适的克隆位点。
载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。
3. 可重复复制。
质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。
二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。
这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。
三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。
方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。
连接成功后，形成了一个混合DNA。
由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。
四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。
大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。
宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。
五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。
常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。
克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。
例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。
第三章 基因克隆载体
（2）中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒载体而构建。 共整合克隆载体系统（T-DNA同源序列、bom 位点） 双元克隆载体系统——微型Ti质粒
（四）乳酸杆菌质粒克隆载体（略）
乳酸杆菌：G+，非致病，益菌生，用于食品和饮料。 质粒宿主范围广泛：可用于其它G+菌及大肠杆菌。 构建： 乳酸杆菌本身对km、Ap抗性较强。 标记基因： 选用lacZ，如有pLJ1复制启始位点的
一、质粒适于载体构建的性质
１、组成与构型 质粒(plasmid)是染色体外裸 露的双链DNA分子（细菌、真 菌、蓝藻、绿藻）
l-DNA 构型： oc-DNA
２、分子大小： 100～102 kb
３、复制 特点：在宿主细胞内进行单向复制。 质粒和宿主细胞双重遗传系统控制复制强度： 拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值） （１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳 定。
BR：两位主要构建者 322：实验编号
ColE1 松驰型 ，筛选系统复杂。衍生的pMB1 为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好 的选择标记基因和克隆位点）。
pSC101（最早用于DNA克隆的载体），严紧 型，含有Tcr 基因。
构建过程(出发质粒：pMB1)
R1（沙门氏菌中分离） 变异 R1drd19
这是Ti质粒用于遗传转化的理论依据。
用野生型Ti质粒获得的转基因植物细胞 只能分裂，不能分化为植株，故不能直接选 育转基因植物。
（2）Vir区
位于T-DNA区上游，其表达产物可激活TDNA的转移，显示致瘤性。
（3）Con区
含有农杆菌之间接合转移有关的基因（tra)， 可受宿主产生的冠瘿碱活化，使Ti质粒在细菌 间转移，也即接合转移基因编码区。
第三章 基因克隆的载体
没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
外源基因Pst I Tet中存活 但在Amp中死亡
② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 >10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。
③ 高拷贝数
2. 质粒载体相关知识介绍
（4）pBluescript SK
pBluescript SK is similar to the pGEM vectors except that it also carries an origin of replication for a filamentous phage, f1. f1 uses a single stranded DNA molecule as a genome and pBluescript KS
表达型质粒载体
装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯 化的元件，主要用来使外源基因表达出 蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。 如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆 的真核生物的基因臵于大肠杆菌的转 录—翻译信号控制之下。
① 表达载体的结构
1）普通载体元件 复制起始点ORI、 选择标记、 多克隆位点MCS
1.质粒的生物学特性
（4）质粒的复制类型 一种质粒在宿主细胞中存
在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为 两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）, 拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）, 拷贝数为10-60。不过，即使是同一质粒，其拷贝数在 不同的寄主细胞间也可能有很大的变化。
(整理)基因克隆的质粒载体
基因克隆的质粒载体在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col 质粒。
①F质粒又叫F因子或性质粒( sex plasmid )。
它们能够使寄主染色体上的基因和F 质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。
②R质粒通称抗药性因子。
它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。
③Col 质粒即所谓产生大肠杆菌素因子。
它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。
大肠杆菌是一类可以使不带有Col 质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。
第一节质粒的一般生物学特性、质粒DNA细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。
绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子 (图4-1) 。
质粒 DNA 分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状， 但在一定的条件下又 可逆地整合到寄主染色体上， 随着染色体的复制而复制， 并通过细胞分裂传递到 后代。
环形双链的质粒 DNA 分子具有三种不同的构型 ： 1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形 DNA （cccDNA ），这样的 DNA 通常呈现超螺旋的 SC 构型 ；2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现 有一至数个缺口时，称之为开环 DNA （ocDNA ），此即 OC 构型 ；3．若质粒 DNA 经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线 性分子（ IDNA ），通称 L 构型（见图 4-2 ）。
在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒 DNA ，尽管分子量相同，仍具 有不同的电泳迁移就绪。
其中走在最前沿的是 SC DNA ，其后依次是 L DNA 和OCDNA（图4-3 ）。
凡经改建而适于作为基因克隆载体的所有质粒DNA分子，都必定包括如下三种共同的组成部分，即复制基因（replicator ）、选择性记和克隆位点。
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
基因克隆载体
克隆载体的DNA分子必须具备的条 件
作为载体应该具备以下基本条件： 1.具有对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）
2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位 点，较高的遗传稳定性; 3.具有较小的分子量，易于操作，具有较高的外源 DNA的载装能力 4.在非必需区具有多种单一的限制酶酶切位点； 5.外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自 我复制;
低拷贝的质粒，每个寄主细胞中仅含有1-3份拷 贝
松弛型复制控制的质粒 stringent plasmid
高拷贝的质粒，每个寄主细胞中含有10-60 份拷贝
质粒复制控制的分子模型
目前公认的用于阐释质粒DNA复制控制 机理的分子模型有两种：
其一是抑制蛋白质稀释模型(inhibitor dilutionmodel)。
(2)自体阻遏蛋白质模型
在抑制蛋白质稀释模型提出若干年之后， L.Sompayrac和O.Maaloe也提出了另外 一种解释质粒DNA复制机理的自体阻遏蛋 白质模型,这个模型对质粒DNA复制控制机 理的一种解释是，质粒DNA的复制是由一 种叫做起始蛋白质Rep引发的。这种蛋白 质是质粒DNA复制启动作用的限速因子， 它的浓度决定着每个细胞每个世代之质粒 分子的最终复制总数。
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
质粒的类型：按分子特性分成接合型和非接合 型，接合型的质粒，又叫自我转移的质粒，带 有自主复制所必须的遗传信息之外，还带有一 套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。
按表型特性分成F质粒、R质粒、Col质粒。
从理论上讲，任何DNA分子均可以物理渗 透的方式进入生物细胞中，但这种频率极低， 以至于在常规的实验中难以检测到。某些种类 的载体DNA分子本身具有高效转入受体细胞 的特殊生物学效应，因此由外源基因与载体拼 接所形成的DNA重组分子传入受体细胞的机 率比外源DNA片段单独转化提高几个数量级.
基因工程(基因工程的基本条件-载体系统)
(二)质粒载体(Plasmid)
1. 质粒的一般生物学特征
质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而 自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子；
质粒常见于原核细菌和真菌中； 绝大多数的质粒是DNA型的； 绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分
子结构，即cccDNA； 质粒DNA的分子量范围：1-300 kb。
D-DNA ocDNA cccDNA
但变性的线性染色体DNA分子复性时不准确，也不迅 速，因此彼此聚集形成网状结构,通过离心分离便与变 性的蛋白质及RNA一起沉淀下来，而仍滞留在上清液中 的质粒DNA则可用酒精等沉淀收集。
沸水浴法 用含有EDTA和TritonX-100的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 沸水浴40秒钟； 离心，用无菌牙签挑去沉淀物； 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA；
λ噬菌体生物学特性：溶原状态
➢λ噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也 可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上， 并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态； ➢整合主要由λ-DNA上的cI和int两基因的产物所激 活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞 本身的性质； ➢人们可以根据需要改变λ-DNA或宿主细胞的性质， 使噬菌体或处于溶原状态，或处于溶菌状态；
4363 bp
ROI
➢用于基因克隆
ROP Origin of Replication Hind II
Sal I Bal I
pUC18/19：
EcoRI SstI KpnI SmaI BamHI XbaI SalI PstI SphI HindIII
➢分子量2686bp； GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断后 仍能有效的转化给受体细胞,同时低分子量的质粒 对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高 的拷贝数可获得大量的克隆基因
a
11
(三)质粒载体的选择记号
新陈代谢特性； 对大肠杆菌素E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四环素抗性、氨苄青霉素抗性、 链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因； 抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。
a
8
a
9
(一) 质粒载体
质粒载体包括以下两种： 1.克隆的质粒载体
允许外源的DNA插入，储存。主要是 DNA水平上的操作。 2.基因表达的质粒载体 允许外源DNA的插入、储存和表达。
a
10
(二) 质粒载体必须具备的基本条件
(1) 具有复制起点； 自我增值的基本条件，一般具一个复制子。
(2) 具有抗菌素抗性； 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。
具尾部结构的二十面体型、 线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性DNA、双链环形 DNA、 单链环形DNA、单链线形DNA、单链RNA。
a
17
噬菌体的溶菌生命周期
噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期
只具有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。 烈性噬菌体溶菌生长的基本过程： 1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
基因克隆主要载体系统
学 生：张建苓 指导老师：胡廷章
a
1
1、载体定义 载体(vector)：基因工程重组DNA技 术中，将DNA片段（目的基因）转 移至受体细胞的一种能自我复制的 DNA分子。
a
2
2、类型 （1）根据功能可分为：
克隆载体 表达载体 整合载体 （2）根据来源可分为： 质粒载体 噬菌体载体 真核细胞克隆载体
a
18
a
19
噬菌体的分类
根据噬菌体与宿主的关系，将噬菌体分为温和性 噬菌体和烈性噬菌体
▪ 温和性噬菌体：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA与宿主染 色体DNA融合，一起复制和传代，无感染其他细胞的能力
▪ 烈性噬菌体：噬菌体感染宿主细胞后，其DNA不插入宿主 染色体DNA，经过一定的潜伏期，就大量的增殖新颗粒， 使宿主细胞裂解，释放出的噬菌体颗粒又感染其他细胞
1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭
环境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体 系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒
a
16
噬菌体的结构和其核酸类型：
结构：无尾部结构的二十面体型、
a
12
(四) 常用的质粒载体
▪ pSC101质粒载体； ▪ ColE 质粒载体； ▪ pBR322质粒载体； ▪ pUC质粒载体；
▪ T载体
▪ 其它的重要的质粒载体
a
13
二 噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
a
14
a
15
噬菌体的一般生物特性
可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能：
a
3
3 、载体的共同特征（或应具备的条
件）：
①自主复制
②易于扩增分离纯化
③有单一酶切位点（多克隆位点）
单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切 位点
多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单 一酶切位点
④有选择标记基因
⑤表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、 终止子,SD序列）
⑥具有较好的安全性，避免a 基因的非控制扩散
a
6
一 、质粒（plasmid）载体
质粒是一种独立于染色体外的小分子环状 DNA，一般大小约106-108D，可自身复制和表 达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药 性基因，常有1 - 3个抗药性基因，以利于筛选。 所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
〉 1000 kb
举例 pUC18/19 , T-载体
pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列 M13mp系列 pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV Pel oBAC系列
PCYPAC1
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3T质i质粒粒，PBV,5
质粒载体 噬菌体载体 真核细胞的克隆载体
a
20
重要的噬菌体载体
分子生物学中常用的噬菌体载体有： 1.λ噬菌体载体
（1）类型:插入型载体和替换型载体 （2）应用： ①转染作用 转染：由宿主细胞捕获噬菌体或病毒DNA的过程。 转导：以噬菌体为媒介转移遗传物质的过程。 转化：质粒等外源DNA引入细胞的过程。 ②λ DNA的体外包装
a
7
质粒的类型
▪ 传递类型： ①接合型：含有自主转移基因，使质粒从一个细胞转移 到另一个细胞。如： F质粒、部分R、Col质粒 ②非接合型：不含自主转移基因，质粒不能自主从一个 细胞转移到另一个细胞。如部分R、Col质粒
▪ 复制类型： ①严紧型(stringent plamid):低拷贝，1-3个拷贝/菌 ②松弛型(relaxed plasmid):高拷贝，10-60个拷贝/菌
YAC (Yeast Artificial chromosome )
MAC (Mammalian Artificial Chromosome)
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体
动物细胞
穿梭载体
动Hale Waihona Puke 细胞 和细菌环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环a状
≈300 kb 100 - 2000 kb 100 - 2000 kb
4
质粒*
λ噬菌体 丝状噬菌体及噬菌粒
载体的种类和特征
受体细胞
结构
插入片断
E.coli
环状
〈 8*
E.coli
线状
9 - 24kb
E.coli
环状
〈 10 kb
粘粒载体
E.coli
环状
35- 45kb
BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
PAC (P1-derived Artificial chromosome)