2第二章基因克隆载体的种类和特性 (1)分解
《基因克隆载体》PPT课件
Ｒ质粒：含有氨苄青霉素Ap、氯霉素Cm、
卡那霉素Km、四环素Tc、链霉素Sm等药物的 抗性基因，可作为选择标记。
Col质粒 Ｆ质粒 降解质粒 Ｔi质粒
隐蔽质粒 蓝藻内源质粒
二、 质粒克隆载体构建的基本策略
１、能进行有效复制——复制起始位点（最好是多拷贝） ２、克隆位点——组装MCS连杆 ３、选择标记基因——抗性基因，Lac Z’基因 ４、分子尽可能小（转化率高），＞15kb，转化率↓↓ ５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等
酵母染色体URA3基因→HindⅢ酶切
pBR322质粒
YEp24 （图3-11）
特征 （1）保留了pBR322的Ａｐｒ和Ｔｃｒ——筛选大肠杆菌克隆子 （2）含URA3标记——筛选酵母菌克隆子 （3）URA3基因——补偿酵母菌ura3突变
优点 （1）是一种穿梭质粒，可在酵母菌和大肠杆菌中复制 （2）转化率高，1μgDNA可获得约104～105个克隆子 （3）稳定高拷贝复制
3．2 病毒（噬菌体）克隆载体
病毒基本结构：
DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。
分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒：
溶原性增殖→构建病毒载体
烈性病毒：
溶菌性增殖→改造后
一、λ噬菌体克隆载体
（一） λ噬菌体性质
λDNA + 外壳蛋白 1、λDNA (48.5kb) 噬菌体中：线性 宿主细胞：环状(cos位点)
λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)， 且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点
（三）构建的基本策略与技术路线
策略: 切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位 点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
动物基因工程—基因克隆载体
B、在非必需区组入选择标记基因
C、构建的λDNA载体不应小于36.4kb
基因工程载体构建
③用λDNA作载体比用质粒作载体的优点：
A、可容纳较大的外源DNA片段（15－23kb，质粒一般<10kb）
B、λDNA进入细菌细胞容易，不象质粒载体那样需要采用化学介导
法才能进入细菌细胞
物细胞（或蓝藻细胞）中进行高效表达。
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
构建植物病毒克隆载体的基本策略是：
对病毒DNA（包括RNA反转录的DNA）进行加工，消除其对植物的致
病性，保留其通过转导或转染能进入植物细胞的特性，使携带的目的基因导
入植物细胞。
目前应用最多的植物病毒克隆载体是：利用CaMV（花椰菜花叶病毒）
TGMV）、非洲木薯花叶病毒（ACMV）、玉米线条病毒（MSV）、小麦矮缩病毒
（WDV）
RNA病毒：雀麦草花叶病毒（BMV）、大麦条纹花叶病毒（BSMV）、蕃茄丛矮病
毒（TBSV）、马铃薯X病毒（PVX）、烟草花叶病毒（TMV）、烟草蚀刻病毒（
TEV）、李痘病毒（PPV）等
基因工程载体构建
2、植物病毒克隆载体
根据这些性质构建了一系列分别适用于不同生物的病毒克隆载体，把
感染细菌的病毒专门称为噬菌体，由此构建的载体则称为噬菌体载体 。
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
（1）λ噬菌体克隆载体
①λDNA构建克隆载体的依据：
A、λ噬菌体由DNA（λDNA）和外壳蛋白组成，对大肠杆菌具有很高的感
动 物 生 物 技 术
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因工程载体构建
基因克隆的载体(共82张PPT)
质粒（plasmid）
是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA 分子。大小约为 数千碱基对。常 有1 ～ 3个抗药 性基因，以利于 筛选。
质粒载体
1. 克隆的质粒载体
2. 允许外源的DNA插入，储存。主要是DNA水 平上的操作。
2. 基因表达的质粒载体 3. 允许外源DNA的插入、储存和表达。
1.1质粒的生物学特性：
质粒DNA之后，迅速除去污染的核酸酶。
2）、质粒的拷贝数及分子的大小
插入分子量大的外源DNA会引起质粒拷贝数的下 降。
1.3 质粒载体的构建与类型
天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造
的质粒。
在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有EolE1 、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。
有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄 主细胞的正常新陈代谢活动。
编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代 谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节 蛋白质编码基因等。
(1)失控的质粒载体
复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。
Example：
pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄主细胞只含有适量的
高拷贝的质粒（10~60）：松弛型复制控制的质粒（非接合型）
7、质粒的不亲合性
在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为 质粒的不相容性:
是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够 在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。
质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相 互干扰造成的。
在PH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环 状质粒DNA却不会被变性。
基因克隆的载体 PPT课件
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
基因工程载体的分类及其特性
基因工程载体的分类及其特性田文晓 1343001125按照来源和性质分类1、质粒载体①复制：通常情况下一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式不同，有的可决定复制的方式，例如滚环复制和θ复制；在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
②拷贝数：质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数大约为1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
③不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
④转移性：指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
2、噬菌体载体（包括λ噬菌体、M13噬菌体载体）1)λ噬菌体载体：大的外援插入片段在质粒中不稳定，转导是比转化效率更高的过程，避免出现无插入片段的空载体。
2)M13噬菌体载体：可以对任意克隆基因进行DNA进行诱变，测序方便，可以制备单链测序模板；含有噬菌体DNA的噬菌体颗粒从转化细胞中分泌出来后，可以在生长平板上收集。
①超感染免疫性：溶原性细菌在被噬菌体感染并溶原化后，不会被同种噬菌体再次感染。
②经过若干世代后，溶原性细菌会开始进入溶菌周期，即溶原性细菌的诱发。
此时，原噬菌体从宿主基因组上切离下来进行增殖。
3、粘粒载体（柯斯质粒）①具有λ噬菌体的特性。
柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
基因克隆载体名词解释
有关“基因克隆载体”的意思解释
有关“基因克隆载体”的意思解释如下：
基因克隆载体是指用来进行基因组克隆、cDNA克隆或亚克隆的DNA分子。
基因克隆载体能够承载外源DNA片段（目的基因）并将其带入受体细胞，帮助目的基因在受体细胞中稳定遗传和表达。
基因克隆载体的基本元件包括启动子、编码区和终止子等，这些元件能够控制基因的表达。
基因克隆载体通常具有松弛的复制子，能够带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。
除了基因克隆载体，还有一种表达载体，其除了具有基因克隆载体的基本元件外，还应具有转录/翻译所必需的DNA顺序，如转录因子、转录激活蛋白等，以实现目的基因的有效转录和翻译。
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
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质粒常见于原核细菌和真菌中
质粒的发展概况
1. 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如
pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322 (1977, Bolivar et al)
2. 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和
新的遗传标记基因。如pUC系列载体。
3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，
如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种 探针型载体。
质粒载体是上世纪70年代实验室普遍使用的基因克隆载体。
（一）质粒的生物学特点
• 1、自主复制性(Self-replication)： • 2、相容性和不相容性(incompatibility) ： • 3、可转移性(transferability or transitivity)：
• （3）酵母人工染色体载体（YAC） • （4）细菌人工染色体载体（BAC） • （5）其他载体
4、载体的要求
• 独立复制 • 可插入外源片段 • 易分离，易操作
二、质粒（plasmid)
1、质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、 闭合、环状双链DNA分子（Covalently closed circular DNA, ccc DNA)，质粒是一类引人注目的亚细胞有机体，其结构比病毒还 要简单，既无蛋白质外壳，也无细胞外生命周期，只能在寄主细 胞内增殖，并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。
1、质粒的自主复制性：
• 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 • 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 • 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为
两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid）：质粒的复制受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以低拷 贝数量形式存在， 1 - 3 拷贝。（低拷贝数质粒） 松弛型复制控制的质粒（relaxed plasmid）：质粒的复制不受 寄主细胞染色体DNA和染色体蛋白质的控制，在细胞中以高拷 贝数量形式存在，10 - 60 拷贝。（高拷贝数质粒）
• C 用于核酸操作的工具酶 • D 用于基因转移的受体菌或细胞（宿主细胞）
（能摄取外源重组DNA并使其稳定维持和表达，或有待于实施遗传 改良的细胞）
一、载体的功能、特征及种类
• 载体（vector)： 携带外源基因(或DNA片段)进入受体细胞（复制、整合或表 达）的工具。
使用载体的目的
• 基因的复制扩增 • 基因的表达 • 基因的整合 • 基因的调控 • 其他
（Multiple Cloning Site,即多克隆位点，MCS） • （5）具有合适的选择性标记
3、载体的种类
• （1）质粒（plasmid）载体（又可分为：克隆载体、 中间载体、穿梭载体和表达载体）
• （2）噬菌体（phage）载体 A、λ—噬菌体 B、考斯质粒（粘性质粒）（cosmid) C、M13—DNA（单链丝状噬菌体）
生
命
中
的
螺
旋
精彩
结
人生
构
Байду номын сангаас
螺旋
式上
升
第二章
基因克隆载体的种类和特性
基因工程的基本条件
• A 目的基因
（从特定的生物基因组或cDNA中通过各种方法分离和扩大繁殖获 得足够量的目的基因或cDNA序列）
• B 用于基因克隆的载体
（合适的载体，并对载体DNA进行克隆，制备足够量又达到一定纯 度的载体DNA）
关键论点是：阻遏蛋白质是组成型合成，其 浓度同质粒的拷贝数成正比。 • *自体阻遏蛋白质模型(Autorepressor model) 关键论点是：阻遏蛋白质的合成受负反馈 (Negative feedback)机理调节，而且其浓度是 恒定的。
2、质粒的相容性和不相容性(又称为亲和性与不亲和性)
①：在同一时间内从一个细胞中发现多个不同类型的质粒 ，只有当不 同的质粒是相容的时才能存在于同一个细胞中；
4、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启 动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒， 并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。
• 除了酵母的杀伤质粒(Killer plasmid)是RNA质粒外，所 有的质粒都是DNA质粒。关于质粒DNA的大小, 文献中有多种说法： 小的仅有103KD，仅能编码2-3种蛋白质； 大的可达105KD，两者相差上百倍。 1Kb～200Kb (Sambrok et al.) 5Kb～400Kb (Lehninger) MD(megadaltons)=106D (兆道尔顿) 1.5Kb≈1MD
1、载体的功能
• （1）运送外源基因高效转入受体细胞 • （2）为外源基因提供复制能力或整合能力 • （3）为外源基因的扩增或表达提供条件
2、载体应具备的条件
• （1）具有对受体细胞的可转移性 • （2）具有与特定受体细胞相适应的复制位点
或整合位点 • （3）长度尽可能小，以提高其载装能力 • （4）具有多种单一的核酸内切酶切割位点
②：质粒的不相容性是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密 切的不同质粒，不能够在同一寄主细胞中稳定共存的现象。不相容 的质粒一般都利用同一复制系统，拷贝多的复制更快，结果在细菌 繁殖几代之后，细菌的子细胞中绝大多数都含有占优势的质粒 。
1、质粒的自主复制性：拷贝数的控制机制 – 质粒DNA复制启动控制
控制复制起始因子与复制起始位点（ori）的结合
抑制蛋白 ↘ Cop
起始蛋白 ↘ Rep
Pcop cop
P/Orep rep
ori
质粒复制控制的分子模型： • *抑制蛋白质稀释模型(Inhibitor dilution model)
2、它并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环 境因素不利影响的能力。质粒类型多种多样，有F质粒也叫性质 粒；有编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒，R质粒可将其抗性 转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌 素抗性能力；有产生大肠杆菌毒素的Col质粒等。
3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在 一定的条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复 制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。