克隆载体与表达载体教程文件
克隆载体表达载体构建详细版
一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
(整理)克隆载体与表达载体
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体-精品
转移特征： 分转移性和非转移性两个特征
命名规则： pUC19
“p”表示质粒（plasmid）
“UC”表示发现或构建该质粒的作者或实验室名称
“19”表示该质粒的实验编号
2020/7/2
9
质粒的生物学特性
1. 寄生性，质粒的宿主范围很广 2. 稳定性 3. 自主复制性，质粒的拷贝数多 4. 传递性 5. 表型效应 6. 可消除性 7. 重组性 8. 分子量较小 9. 不相容性，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同
5. Phagemid载体
一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体
2020/7/2
6
I
细菌质粒 载体
II
噬菌体 载体
III
柯斯质粒 载体
2020/7/2
7
I.细菌质粒载体
概念： 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、 能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子
质粒是基因工程中最常用的运载体 而最常用的质粒是大肠杆菌的质粒
质粒的复制能在宿主细胞外完成吗？ 质粒的存在对宿主细胞有无影响？
2020/7/2
8
分类：
F质粒（F因子或性质粒）
R质粒（抗药性因子）
Col质粒（大肠杆菌素因子）
复制类型： “严紧型”的低拷贝复制质粒（拷贝数少，为1-5个） 与“松弛型”高拷贝复制质粒的（拷贝数多，可达10-200个拷 贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
一个寄主细胞系中稳定地共存的现象
质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质 粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的 复制则只能在宿主细胞内完成
2020/7/2
10
质粒载体的修饰改造
克隆载体与表达载体
TA载体构建：
在 般质粒载体的基础上构建。
方法1:先米用限制性内切核酸酶酶切使质粒载体线性化，再通过K1enow片
段将酶切的线性载体末端补平
方法2：利用产生平末端的限制性内切核酸酶酶切产生平末端，最后将线性化 钝末端质粒载体加T反应形成。目前有很多公司推出了TA质粒载体。
1）通过裂解过程增殖载体2）载体与外源DNA的酶
切3）外源DNA与载体的连接4）重组噬菌体的体外 包装5）包装噬菌体颗粒的感染6）筛选（入噬菌体载 体的克隆原理）
插入式载体
置换型载体
（取代型载 体）
M
13噬 菌体 载体
M13噬菌体的基因组 为单链DNA。噬菌体颗 粒的大小受其DNA端 点制约的，不存在包装 限制。只感染雄性大肠 杆菌
入噬菌体载体
入噬
菌体
载体
分类
插入式载体
一种只具有一 个可供外源DNA插入的克 隆位点的派生 载体
入噬菌体载体相对于质粒载体失活：如 入gt10、入NM1149等载体，在cl基因上有EcoRI及Hi ndIII的酶切位点。外源基因 插入后将导致cI基因的失活。cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的 噬菌斑。
（1）基因组大小；去除非必需区，建立外 源DNA片段的克隆或替换位点（2）在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ
基因；基因c1失活（cl基因：溶源 过程控制基因）；Spi筛选（野生型入 噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性
E.coli中 的生长会受到限制的表型， 称 作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感）
BAC
【学习课件】第三章基因克隆与表达的载体
分子量大，拷贝数少，宿主广，不符合基因工程的安全要求
2021/7/9
21
大肠杆菌接合（conjunction）
2021/7/9
22
Donor cell
Conjugative plasmid
Recipient cell
Pilus 菌毛
Plasmid transfer by conjugation between bacterial cells.
colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌。
可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自 发突变出抗colicin E1的细胞…….
2021/7/9
29
2、质粒载体的构建：
（1） 具有复制起始位点（ORI） 一般选择组装松弛型质粒复制起始位点。 （2）具有合适的选择标记基因 是筛选的标志。理想的载体应该有两种选择标记基因
（3）若干限制性内切酶的单一位点（MCS）
用来插入外源DNA片断，且插入后不影响复制功能
2021/7/9
30
2021/7/9
31
（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数
缩短长度－“轻装上阵”，大于15 kb的质 粒的转化率明显下降
2021/7/9
32
3、质粒的选择标记及其工作原理
（1）选择标记
① 抗生素抗性
存在于多种宿主细胞中、独立于染色体以外的可自主复 制的双链闭合环状DNA分子。
存在于细菌、霉菌、蓝藻、酵母等细胞中。
2021/7/9
9
大肠杆菌的质粒
2021/7/9
10
（一）质粒（ Plasmid ）的命名
质粒的命名规则
① 天然存在的质粒：其符号的第一个字 母要大写，并不用斜体字，书写时要 用括号括起来，如（ColE1）。
分子克隆载体 ppt讲义转pdf
UUUU...…
RNApol RNA pol
5¢ 5 ¢ 3¢ 3 ¢ 3¢ 3 ¢ 5¢ 5 ¢
5´pppG 5
茎环结构使转录终止的机理 茎环结构使转录终止的机理
一、pBR322
调控序列
增强子 启动子
结构基因
UAS 酵母
TATA
核糖体结合位点（S-D序列）
mRNA有与核糖体DNA结合的位点S-D 序列 (Shine-Dalgarno)，又称为核糖体结合点。
3’… A CACUAGG…5’ 16sRNA U C U-C-C-U 5’……A G G A PuPuUUUPuPu…AUG mRNA
表达体系的发展
表达体
第一代 原核生物表达体系 第二代 酵母表达体系 第三代 哺乳类细胞表达体系 第四代 基因直接导入
载体
质粒、噬菌体 穿梭质粒 病毒、脂质体 DNA本身
宿主
细菌 酵母 培养细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
基因工程的目的是使目的基因能高效表达。 基因表达受DNA结构、蛋白质因子与核酸相互辨认、结 合等组成的表达体系的调控。 基因表达调控可在转录、转录后修饰、翻译、翻译后修 饰等水平进行 基因工程载体的构建必需应用表达调控的基本理论知 识，应用已知的调控序列进行重组、改造。
P
O
Z Y X
诱导物 诱导物
乳糖(或IPTG)
P O
Z Y X
Am
lacZ
N H 2
COOH
a片段 片段
w片段 片段
lacZ
标志补救（ß-半乳糖苷酶法） ß 半乳糖苷酶法）
基因工程第三章克隆载体-2共32页
6/31
6
（2）λDNA 有56个限制酶识别序列，50个基因， • 左臂，右臂和中央片段，中央片段可以被替代。
right arm left arm
左 臂
7/31
溶菌成熟
Cos
头部合成
晚期控制 DNA合成 阻遏 早期控制
尾部合成
阻遏 重组 删除与结合
中央片段
central stuffer
右 臂
7
10/31
10
（3）插入外源基因（foreign gene） • 可插入20kb的目的基因。
11/31
11
基因组DNA 部分消化
COS
DNA ligase
L
R COS L
Aim gene
12/31
20kb的DNA片段
Aim gene
R COS
12
（4）建立λDNA体外包装系统（packing system）
17
一、定位整合模式
Homologous sequence
Foreign DNA
Homologous sequence
18/31
Vector DNA Genome DNA of receptor cell
Vector DNA
Genome DNA 3
1.1、λ 噬菌体的性质
（1）λDNA： • 线状，双链DNA， 48502bp （linear，double-stranded DNA，dsDNA） • cos位点：λDNA两端各有12bp的粘性末端，
两者互补，进入宿主后可连成环状DNA。
4/31
4
λDNA 头部 尾部 尾丝
5/31
宿主细胞
15/31
何水林版基因工程第三章分子克隆载体PPT演示课件
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
1质粒的基本特性 1.1 质粒DNA的构型
两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构， 称为共价闭合环形DNA（cccDNA），通常 呈现超螺旋的SC构型
只有一条DNA链出现有一至数个缺口，称 为开环DNA（ocDNA），此即OC构型
线性分子DNA（IDNA），称为L构型
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
How many copies can be
? replicated
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
answers
Repressor model: cop factor
Negative control Antisense RNA model: RNAⅠ
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
1.2 质粒DNA分子大小
质粒 pPbs ColE1 ColV2
Ti PV21
F
宿主 蓝藻 大肠杆菌 大肠杆菌 致癌农杆菌 三叶草根瘤菌 大肠杆菌
分子大小/kb 1.5 6.4 140
330左右 700 94
பைடு நூலகம்
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
pBR322 4363 bp
2012年3月
第三章分子克隆载体
湖北民族学院－周毅峰
按功能分类
克隆载体 （cloning vector）对目的基因克隆，建立DNA 和cDNA，其上有复制子即可
表达载体 （expression vector）
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克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)
其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。
由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。
真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。
加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。
是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan）
克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。
但不具备表达元件。
而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。
克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。
1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
2. 载体的分类
按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。
它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。
（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.
克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
问题：
基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目的蛋白，那么实际应用中，我们的最终目的是要得到目的蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？还是说利用克隆载体实现目的基因的大量复制后，再将其转移到表达载体中实现表达？它是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能？构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难？
1.克隆的目的比较单一，就是将你感兴趣的DNA片段，重组进入载体，然后于宿主细胞中大量繁殖，主要用于各种文库的建立，比如人类基因组计划；同时由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的，而克隆载体没有表达所需的各种片段，所以可以容纳更长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更高。
2.重组DNA需要使用限制性内切酶，因此待克隆的目的片段两端必需有其识别位点，现在的T/A克隆载体可以直接克隆PCR产物，省去了两端加装识别位点的设计，PCR效率就更高。
3.表达载体的目的是多样化的，为了实现实际工作中的需要，不同的目的就要设计不同的载体，用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂。
4.细菌摄取能量的能力是一定的，如果用来合成大量蛋白质，合成核酸就会少。
5.细菌承受的工作负荷也是有限的，给它的工作太多，效率必然低下，这和我们日常生活是一个道理。
原因很简单，不是不能，是完全可以，但是效率会低很多。
所以我们一般的策略是，将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。
回答的不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助。
1)
2)“T/A克隆载体可以直接克隆PCR产物，省去了两端加装识别位点的设计，PCR效率就
更高。
”是什么意思？
T/A克隆载体是PUC载体的线性化后两端加了T，而Taq酶有在PCR产物后随机加A的特性，所以PCR产物直接可以接入T载体。
而经典的克隆PCR产物需要限制性内切酶切割后接入载体，所以在设计PCR引物时两端要加酶的识别位点，而加装的序列与模板不配对，因此PCR效率会低很多。
3)
4)克隆载体只是为了得到大量的目的基因，而现在多用PCR就可以达到这个目的。
那这
个目的基因的主要用途是什么？只用来测序吗？表达载体应该兼有克隆与表达的功能的吧？
嗯，基本是这个意思。
就测序不克隆也可以进行，克隆到载体的CMS中就在基因两端有了可供你选择的很多限制性酶切位点，方便亚克隆到各种表达载体上。
当然表达载体可以克隆，但是效率低于克隆载体。
一是因为表达载体不能直接克隆PCR产物，必须加装限制性酶切识别序列，上面已经讲过。
二是表达载体的选择相对克隆载体是更加严谨型的质粒，就是每个细菌里的拷贝数较低，能量守恒，细菌摄取能量的能力是一定的，用来合成蛋白质，核酸的合成必然受一定得限制。
5)我要构建一个基因的载体，
1.我可以将目的基因（1.3kb左右）和表达载体分别作酶切后连接吗？这几天将目的基
因做了一个T载体连接，可是不知道下一步怎么利用？
2.设计引物的时候用了sac1和hind111，做pcr的时候可以用pfu酶吗？pfu酶是必
须的吗？
3.我选择的表达载体上sac1和hind111的酶切位点只是相差两个碱基，做双酶切的时
候能切开吗？
1.如果你的目的基因已经在T载体上，当然可以分别酶切后连接，但是要注意方向。
2.如果是T载体连接PCR的引物可以不设计酶切位点。
T载体可以直接连接PCR产物源
于其末端错加的A，所以不能使用高保真的PFU。
但是你的扩增片段较长，如果用一般的TAQ酶，合成中可能会出错，用PFU准确度高，需要设计酶切位点。
如果PCR产物设计了酶切位点就可以直接克隆进需要的载体，不必借助T载体。
文献上有报道，按1：1的比例混合使用PFU和TAQ效果更好。
3.应该能切开，因为设计引物时保护碱基也就2到3个，但是最好稍微距离远一点。