克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
）其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3 —9bp组成的序列。
这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
最新为什么要先构建克隆载体再用表达载体备课讲稿
最新为什么要先构建克隆载体再⽤表达载体备课讲稿为什么要先构建克隆载体再⽤表达载体构建克隆载体是⼤量扩增DNA⽚段，⽤以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是⼤量得到翻译产物——蛋⽩质。
为什么要先构建克隆载体，再⽤表达载体，我猜是因为：①得到⼤量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做⼀次常规的PCR，⽽且每次都要重新提DNA和RNA才⾏，⽽且，PCR反应的试剂盒⼜不便宜，⽤PCR来制备⼤量DNA有点得不偿失。
尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极⾼，⽽且还要筛选，但⼀旦你重组成功并转⼊了⼤肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候⽤，摇个菌，就可以制备到⼤量的DNA。
②测序需要。
你想转表达，你⾸先得确定你扩增的⽬的⽚段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark 的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。
扩增出的基因⽚段保险起见或者经费允许，要拿去测序，⽽⼀般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上⼀般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。
你要写论⽂必须要给⼈真凭实据。
先构建克隆载体再构建表达载体并不是⼀个必须的选择，如果你的扩增PCR⽬的条带很亮，⽽且单⼀性很好，我建议你可以直接克隆进⼊表达载体。
很多⼈选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时⽬的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进⾏测序，增加测序的准确度，从⽽确认⾃⼰克隆基因序列的正确性。
单纯的PCR产物往往是⼀些各种PCR⽚段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。
同时保存的PCR⽚段⽐较容易降解，⽽构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。
先构建克隆载体，⼀是为了便于测序，确认克隆序列正确，⼆是为了便于基因PCR⽚段的保存。
怎么构建克隆载体和表达载体？⾸先根据你的实验需要选择相应的载体。
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
(整理)克隆载体与表达载体
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
酵母基因克隆与表达载体
Gal4蛋白有一个非常突出的特性，它的二个结构域在其适当的连接区被打断后仍具有各自的功能，而且这两个不同的结构域可以重建继续发挥转录激活作用。这一特性使得研究者可以构建两个载体来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。具体方法是：将A基因与DB融合构建一个表达质粒（通常带Trp标志基因，以下简称Trp质粒）在酵母中表达Gal4-BD-A，将B基因与AD融合构建另一个表达质粒（通常带Leu标志基因）表达Gal4-AD-B，然后将者两个质粒转化酵母，在泛基诺SD/-Trp-Leu双缺培养基上筛选转化克隆（备注：两个质粒共转化的效率一般很低，也可先后逐个转化，即先转化Trp质粒，在泛基诺SD/-Trp的培养平皿中筛选阳性克隆后再转化Leu质粒。如果A蛋白和B蛋白之间存在相互作用，那么Gal4-BD和Gal4-AD通过A和B的桥接作用被聚集在一起而重建转录因子的活性，启动下游报告基因的转录。早期的报告基因选用LacZ，后来为减少非特异性激活而产生的假阳性，增加了双报告基因和三报告基因(LacZ,His3,Ade2)。
此类质粒在细胞内以附加体的形式高度复制, 每个细胞高达200-400个拷贝贝
用途: 用于外源基因的表达
(二). 表达载体
1、GAL1启动子表达载体-----半乳糖诱导的表达载体
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
此类质粒在细胞内可自主复制,且由于含有中心粒复制序列,因此每个细胞近乎只有一个拷贝。
用途: 由于每个细胞平均只有一个拷贝,避免了目的基因的盈余表达,因而特别适用于基因功能的研究
3、酵母附加体质粒(Yeast episomal plasmid, YEP)
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
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能像质粒那样在受体细胞中自主复制能像M13-DNA那样体外包装，并高效转染受体细胞装载量比常规的M13mp系列要大很多（10kb通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA
重组操作简便，筛选容易
噬菌粒载体综合了质粒载体和M13噬菌体载体优点，含有ColEl复制起始位点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌体DNA间隔区(含有噬菌体DNA复制起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所必需的全部顺式作用元件)
(1)基因组大小；去除非必需区，建立外源DNA片段的克隆或替换位点（2）在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ基因；基因cⅠ失活（cI基因：溶源过程控制基因）；Spi筛选（野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感）
1)通过裂解过程增殖载体2)载体与外源DNA的酶切3)外源DNA与载体的连接4)重组噬菌体的体外包装5)包装噬菌体颗粒的感染6)筛选（λ噬菌体载体的克隆原理）
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（抗菌素选择原理）
pSC101
ColE1
pBR322
pUC18
pUC19
TA载体
噬菌体载体
λ噬菌体
其DNA两端的5′末端各带有12个碱基的互补单链，即cos位点。有可替代区，即非必需区。用外源DNA片段替代这个区域，不会影响噬菌体颗粒的形成。
克隆载体
基本性质
基本特征（或载体的构建）原理Biblioteka 制常用的载体克隆载体
质粒载体
质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制；不相容性；可转移性（基因工程中采用非接合性质粒）
（1）具有合适的复制起始位点（ORI）（2）具有合适的选择性标记基因（3）若干限制性切酶的单一位点（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。
粘粒（cosmid）是带有cos序列的质粒。cos序列是噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。黏粒的组成包括质粒复制起点（colE1），抗性标记（ampr），cos位点，因而能象质粒一样转化和增殖。克隆的最大DNA片段可达45kb。有的粘粒载体含有两个cos位点，在某种程度上可提高使用效率。
pUC118和pUC119
人工染色体
染色体具有复制功能，利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体称为人工染色体载体
其装载外源DNA的容量比质粒、噬菌体和噬菌体-质粒杂合载体等有很大的拓展，甚至可以跟染色体的大小相媲美。
设计构建的柯斯质粒一般长4～6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。
M13mpn n代表系列数字②对M13mp1的改进加上常用的酶切位点。M13mp2：
LacZ’ 5’端的第13个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoR I切点
噬菌体-质粒杂合载体
黏粒载体
考斯质粒是一类人工构建的含有λ-DNA cos序列和质粒复制子的的特殊类型载体。能像-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制具有较高容量的克隆能力：45kb；具有与同源性序列的质粒进行重组的能力
它具有质粒的复制起点、选择性标记、多克隆位点等，方便DNA的操作，可在细胞稳定存在；又具有单链噬菌体的复制起点，在辅助噬菌体的存在下，可进行噬菌体的繁殖，产生单链的子代噬菌体
1.具有较小分子量基因组DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于进行分离与操作；2.编码一个ampr基因作为选择记号，便于转化子的选择；3.拷贝数含量高4.存在着一个多克隆位点区，因此多种不同类型的外源DNA片段，不经修饰便可直接插入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照IPTG显色反应试验筛选6. lacZ基因是置于lac启动子的控制之下，插入的外源基因便会以融合蛋白质的形式表达；7含有质粒的复制起点，可复制形成大量的双链DNA分子8.带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中，可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；9.；在pUC118和pUC119这两个载体中，多克隆位点区的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它们当中的一个可转录克隆基因的正链DNA，另一个则可转录出负链DNA
1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（－）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主细胞能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。（M13噬菌体产生单双链DNA的机制）
插入式载体
置换型载体（取代型载体）
M
13噬菌体载体
M13噬菌体的基因组为单链DNA。噬菌体颗粒的大小受其DNA端点制约的，不存在包装限制。只感染雄性大肠杆菌
基因间隔区（intergenic region, IG区）基因II与基因IV之间存在一段507bp的基因间隔区，含有复制起始位点，是实施改造、构建人工载体的重点区域。②IG区只有一个BsuI切点。（2）加入酶切位点，在IG区加入单一切酶位点。M13mp1在IG区插入一个大肠杆菌的LacZ’（-肽序列)。使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，M13重组分子筛选简便，被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5 kb