克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
）其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3 —9bp组成的序列。
这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。
最新为什么要先构建克隆载体再用表达载体备课讲稿
最新为什么要先构建克隆载体再⽤表达载体备课讲稿为什么要先构建克隆载体再⽤表达载体构建克隆载体是⼤量扩增DNA⽚段，⽤以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是⼤量得到翻译产物——蛋⽩质。
为什么要先构建克隆载体，再⽤表达载体，我猜是因为：①得到⼤量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做⼀次常规的PCR，⽽且每次都要重新提DNA和RNA才⾏，⽽且，PCR反应的试剂盒⼜不便宜，⽤PCR来制备⼤量DNA有点得不偿失。
尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极⾼，⽽且还要筛选，但⼀旦你重组成功并转⼊了⼤肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候⽤，摇个菌，就可以制备到⼤量的DNA。
②测序需要。
你想转表达，你⾸先得确定你扩增的⽬的⽚段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark 的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。
扩增出的基因⽚段保险起见或者经费允许，要拿去测序，⽽⼀般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上⼀般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。
你要写论⽂必须要给⼈真凭实据。
先构建克隆载体再构建表达载体并不是⼀个必须的选择，如果你的扩增PCR⽬的条带很亮，⽽且单⼀性很好，我建议你可以直接克隆进⼊表达载体。
很多⼈选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时⽬的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进⾏测序，增加测序的准确度，从⽽确认⾃⼰克隆基因序列的正确性。
单纯的PCR产物往往是⼀些各种PCR⽚段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。
同时保存的PCR⽚段⽐较容易降解，⽽构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。
先构建克隆载体，⼀是为了便于测序，确认克隆序列正确，⼆是为了便于基因PCR⽚段的保存。
怎么构建克隆载体和表达载体？⾸先根据你的实验需要选择相应的载体。
(整理)克隆载体与表达载体
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体表达载体构建详细版
克隆载体表达载体构建详细版一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
酵母基因克隆与表达载体
Gal4蛋白有一个非常突出的特性，它的二个结构域在其适当的连接区被打断后仍具有各自的功能，而且这两个不同的结构域可以重建继续发挥转录激活作用。这一特性使得研究者可以构建两个载体来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。具体方法是：将A基因与DB融合构建一个表达质粒（通常带Trp标志基因，以下简称Trp质粒）在酵母中表达Gal4-BD-A，将B基因与AD融合构建另一个表达质粒（通常带Leu标志基因）表达Gal4-AD-B，然后将者两个质粒转化酵母，在泛基诺SD/-Trp-Leu双缺培养基上筛选转化克隆（备注：两个质粒共转化的效率一般很低，也可先后逐个转化，即先转化Trp质粒，在泛基诺SD/-Trp的培养平皿中筛选阳性克隆后再转化Leu质粒。如果A蛋白和B蛋白之间存在相互作用，那么Gal4-BD和Gal4-AD通过A和B的桥接作用被聚集在一起而重建转录因子的活性，启动下游报告基因的转录。早期的报告基因选用LacZ，后来为减少非特异性激活而产生的假阳性，增加了双报告基因和三报告基因(LacZ,His3,Ade2)。
此类质粒在细胞内以附加体的形式高度复制, 每个细胞高达200-400个拷贝贝
用途: 用于外源基因的表达
(二). 表达载体
1、GAL1启动子表达载体-----半乳糖诱导的表达载体
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
此类质粒在细胞内可自主复制,且由于含有中心粒复制序列,因此每个细胞近乎只有一个拷贝。
用途: 由于每个细胞平均只有一个拷贝,避免了目的基因的盈余表达,因而特别适用于基因功能的研究
3、酵母附加体质粒(Yeast episomal plasmid, YEP)
(1).Trp筛选标志 (2).Ura筛选标志 (3).Leu筛选标志 (4).His筛选标志 (5).G418筛选标志
克隆载体与表达载体教程文件
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
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列和质粒复制子的的特 DNA 包 装 到 噬 菌 体 颗 粒 中 所 需 的 有 cos 位点的任何 DNA 分子只要在长度相当于噬菌
殊 类 型 载 体 。 能 像 DNA 序列。黏粒的组成包括质粒复制 体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似
-DNA 那样进行体外包 起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 噬菌体λ的颗粒。因此，插入柯斯质粒的外源 DNA
点制约的，不存在包装 实施改造、构建人工载体的重点区域。
限制。只感染雄性大肠 ② IG 区只有一个 Bsu I 切点。（2）加
杆菌
入酶切位点，在 IG 区加入单一切酶位
点。M13mp1 在 IG 区插入一个大肠杆
1) 通过裂解过程增殖载体 2)载体与外源 DNA 的酶 切 3) 外源 DNA 与载体的连接 4)重组噬菌体的体外 包装 5) 包装噬菌体颗粒的感染 6)筛选（λ 噬菌体 载体的克隆原理）
（10 kb 通过克隆双链 它具有质粒的复制起点、选择性标记、 肠杆菌 lacZ 基因的 5’-端编码区，可按照 IPTG 显
DNA 能获得同等长度 多克隆位点等，方便 DNA 的操作，可 色反应试验筛选 6. lacZ 基因是置于 lac 启动子的控
Word 资料
.
人工染色 体
的单一单链 DNA 重组操作简便，筛选容 易
菌体颗粒的形成。
E.coli 中 的生长会受到限制的表型，称
作 Spi+ ，即对 P2 噬菌体的干扰敏
感）
M13 噬 菌 体 的 基 因 组 基因间隔区（intergenic region, IG 区）
为单链 DNA。噬菌体颗 基因 II 与基因 IV 之间存在一段 507bp
粒的大小受其 DNA 端 的基因间隔区，含有复制起始位点，是
噬 黏粒 装，并高效转染受体细 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。 可大于 40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感
菌 载体 胞；能像质粒那样在受 克隆的最大 DNA 片段可达 45kb 。有 染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。
体-
体细胞中自主复制具有 的粘粒载体含有两个 cos 位点，在某种
质
较高容量的克隆能力： 程度上可提高使用效率。
噬菌 粒载 体
M13-DNA 那样体外包 装，并高效转染受体细 胞 装载量比常规的 M13mp 系列要大很多
点、抗生素抗性选择标记和丝状体噬菌 体 DNA 间隔区(含有噬菌体 DNA 复制 起始、终止以及噬菌体颗粒形态发生所 必需的全部顺式作用元件)
个 ampr 基因作为选择记号，便于转化子的选择； 3. 拷贝数含量高 4. 存在着一个多克隆位点区，因 此多种不同类型的外源 DNA 片段，不经修饰便可 直接插入到载体分子上；5.多克隆位点区阻断了大
外，M13 重组分子筛选简便，被 M13 余下的 M13（+）链 DNA 则是从其感染的寄主细胞 的第 13 个核
噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成 的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗 苷酸 G 突变
混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子 粒的。 （M13 噬菌体产生单双链 DNA 的机制） 成 A，产生了
若干限制性切酶的单一位点（4）具有 在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。（抗
较小的分子量和较高的拷贝数。
菌素选择原理）
pSC101 ColE1 pBR322 pUC18 pUC19 TA 载体
噬
克菌
体
隆载
体
载
体
λ噬 菌体
M 13 噬 菌体 载体
其 DNA 两端的 5′末端 (1)基因组大小；去除非必需区，建立外
插入式载体
置换型载体 （取代型载 体）
M13mpn
n 代表系列数
字② 对
M13mp1 的
改进加上常
用的酶切位
点
。
Word 资料
.
菌的 LacZ’（-肽序列)。使克隆的 DNA 的 DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜， M13mp2：
片段以特定单链的形式输出受体细胞 同时基因 V 的蛋白质从（+）DNA 链上脱落下来， LacZ’ 5’端
.
克隆载体
基本性质
基本特征（或载体的构建）
原理机制
常用的载体
质粒载体
质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自 主复制；不相容性；可 转移性（基因工程中采 用非接合性质粒）
（1）具有合适的复制起始位点（ORI） 当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体
（2）具有合适的选择性标记基因（3） 菌才能生长。不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能
各带有 12 个碱基的互补 源 DNA 片段的克隆或替换位点（2）在
单链，即 cos 位点。有 DNA 的非必需区插入选择标记：lacZ
可替代区，即非必需区。 基因；基因 cⅠ 失活（替代 程控制基因）；Spi 筛选（野生型 λ 噬
这个区域，不会影响噬 菌 体 在 带 有 P2 原 噬 菌 体 的 溶 源 性
粒
45kb；具有与同源性序
杂
列的质粒进行重组的能
合
力
载
能像质粒那样在受体细 噬菌粒载体综合了质粒载体和 M13 噬 1. 具有较小分子量基因组 DNA，可克隆 10kb 的外 pUC118 和
体
胞 中 自 主 复 制 能 像 菌体载体优点，含有 ColEl 复制起始位 源 DNA 片段，并易于进行分离与操作；2. 编码一 pUC119
染色体具有复制功能， 利用染色体的复制元件 来驱动外源 DNA 片段 复制的载体称为人工染 色体载体
越大，混浊斑的混浊度亦越大 但
一 个 EcoR I
M13-DNA 载体的最大缺陷是装载量
切点
小，只有 1.5 kb
考斯质粒是一类人工构 粘粒（cosmid）是带有 cos 序列的质粒。 设计构建的柯斯质粒一般长 4～6kb。其上的 cos 位
建的含有 λ-DNA cos 序 cos 序 列 是 噬 菌 体 DNA 中 将 点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具
1、以（+）链 DNA 为摸板，合成互补（－）链， 该双链称复制型 DNA（RFDNA）。2、RFDNA 在宿 主细胞能快速增殖，可增加到每个细胞约 200 个拷 贝。3、单链特异的 DNA 结合蛋白结合在（+）链 上，从而阻断了其互补链，即（－）链的合成，这 样，细胞就会不断的合成（+）链 DNA 4、游离出 来的（+）链 DNA 先与基因 V 的编码产物形成特异