(整理)克隆载体与表达载体
克隆载体
谢谢
载体的分类
pBR322质粒载体
重组体的筛选
通过由转化子所显示出的抗生素抗性来鉴定出重组体，需要 用到阴影平板培养。
表达载体及其必须具备的条件：
1.载体能够独立的复制； 2.应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外 源基因的克隆、鉴定和筛选； 3.应具有很强的启动子，能被RNA聚合酶所识别； 4.应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才 能进行转录； 5.应具有很强的终止子，以使RNA聚合酶集中力量转录 克隆的外源基因，同时使很强的终止子所产生的mRNA 较为稳定；
突变的类型
(3) 倒位 (inversion) 或转位（translocation）
DNA重组使其中一段核苷酸倒置，或从一处迁移到另一处。
倒位或转位（transposition） 指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。
克隆载体
质粒载体的设计 噬菌体载体
克隆载体（Cloning Vector）
M13噬菌体载体
概念：M13噬菌体是一种丝状噬菌体，内有一个环状单链DNA分子，长6.7kb的核 苷酸，含DNA复制和噬菌体增殖所需的遗传信息。
功能：该类噬菌体作为克隆载体，可以通过质粒提取技术在细菌培养物中获取。M13噬 菌体主要用于克隆单链DNA。
侵染对象： 只感染F+（含F质粒，能产生性菌毛）的大肠杆菌。 克隆特点：感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ， 用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA 。 目的片段插入RFDNA→感染感受态大肠杆菌细胞→从培养液中获得纯的噬菌体颗粒
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
）其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3 —9bp组成的序列。
这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。
基因工程主要知识点整理
第一章基因克隆基因工程的基本技术有哪些？答：对核算分子的分离、纯化、回收、分析和检测、切割、连接和修饰，以及序列测定、诱变、扩增和转移等基因操作技术。
构建基因文库一般使用什么作为载体？答：一般使用大肠杆菌作为载体克隆与亚克隆？答：克隆在一等程度上等同于基因的分离。
亚克隆是将目的基因所对应的小段的DNA片段找出来。
PCR对基因克隆有什么作用？答：现在基因克隆可以不用通过构建基因文库来实现，可以通过理性设计和PCR扩增获得大多数所需要的基因。
但是尽管如此，在不知道基因序列的情况下，如相互作用的基因，表达调控因子，新基因等，还需要构建基因文库来进行基因克隆。
第二章分子克隆工具酶限制与修饰系统？答：限制系统可以排除外来DNA。
限制的作用实际就是降解外源DNA，维护宿主稳定的保护机制。
甲基化是常见的修饰作用，宿主通过甲基化来达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的作用。
并且能够保证自身的DNA不被降解。
使用最广泛的限制酶？答：EcoR I是应用最广泛的限制性内切酶限制性内切酶的命名？答：宿主属名第一字母、种名头两个字母、菌株号+序列号。
如：HindIII限制与修饰系统分类？答：至少可分为3类。
II类所占比例最大，其酶分子为内切酶与甲基化分子不在一起，识别位点为4-6bp的回文序列，切割位点为识别位点中或者靠近识别位点。
其限制反应与甲基化反应是分开的反应。
不需要ATP的参与。
限制酶识别的序列长度？结构？答：一般为4-6个bp，即每256和每4096个碱基中存在一个识别位点。
回文序列，不对称序列，多种不同序列，间断对称序列限制酶产生的末端？答：1、黏末端2、平末端3、非对称突出末端什么是同裂酶？分类？答：识别相同序列的限制酶称为同裂酶。
但他们的切割位点有可能不同。
分为：1、同位同切酶2、同位异切酶3、同工多位酶4、其他限制性内切酶的作用是什么？它的反酶是什么？答：什么是同尾酶？答：许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相通的，切实对称的，即他们可产生相同的黏性突出末端。
第四章克隆载体的特征及类型
吸附
LamB受体 注入
复制
包装
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。
Amp Tet
pBR322
插入片段
Tet平板
Amp平板
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
质粒的基本特征
质粒
质粒的不相容性：分子机制
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒) 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性
质粒
由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒的基本特征
质粒
5. 携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体表达载体构建详细版
克隆载体表达载体构建详细版一、稀释引物1、4℃，15min、13000转离心（先等离心机降温）2、根据OD值加DD水。
3、静置30min（冰上）4、准备1.5毫升EP管，并加90ulDD水。
5、向EP管中加10ul引物，震荡离心，-20℃保存。
二、跑MIX检测引物（20ul体系）、上引物0.8ul下引物0.8ulMix 10ulDNA（日本晴）1ulDD水7.4ul三跑高保真酶（50ul体系）DNAorCDNA 2ul上引物2ul下引物2ul5*buffer 10uldNTPs 5ulDD水28ulPfu（最后加）1ul四胶回收流程1、在紫外线下切胶，用牙签装入2ml的EP管中。
2、按量加XP2，放在55℃水浴锅中10min，每2min摇匀1次，涡旋，短离。
3、将液体冷却到室温，转移到平衡住中，离心10000转，1min30s，倒掉滤液。
4、加入xp2 300ul，离心10000r，1min30s，倒掉滤液。
5、加入spw700ul，离心10000r，1min，倒掉滤液（重复一次）6、空转2min，13000r，之后换1.5mlEP管。
7、套上保鲜膜放入37℃烘箱中，30min。
8、加入DD水10ul，静置2min，离心2min，13000r，重复3次，-20℃保存。
五、胶回收产物检测（10ul）体系上引物0.4ul下引物0.4ulMix 5ul回收产物1ulDD水 3.2ul六、构建blunt cloning 载体（克隆载体）（4ul 体系）胶回收产物 3.5ulBlunt cloning 0.5ul混匀后，PCR：25℃15min 盖子温度50℃之后转化1、提前5min从-70℃冰箱中拿出大肠杆菌感受态，冰上解冻5min。
2、将样品（4ul）加入感受态的大肠杆菌中，冰上30min，大约剩5min左右，打开水浴锅预热到42℃，并拿出SDC 培养基解冻（室温解冻）。
3、水浴锅42℃，60-90s迅速转移到冰浴2min，该过程中不要摇动离心管。
克隆载体与表达载体
分类
结构组成及表达兀件
特点或优点
备注
质 粒 表 达 载 体
原核表达载 体
1启动子、
2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干
扰载体的稳定性）
（1）基因组大小；去除非必需区，建立 外源DNA片段的克隆或替换位点（2） 在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ基因；基因cl失活（cl基因：溶源 过程控制基因）；Spi筛选（野生型人 噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型， 称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏 感）
YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核 细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中 繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力
5
色
体
细菌人工染色体 载体
BAC
是基于大肠杆菌 的F质粒构建 的，高通量低拷 贝的质粒载体
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标 记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子） 的严谨型控制的复制子oriS（Shizuya et al.
主要使用EcoR I
ColEl
天然质粒，属松弛型多拷贝型
6.3 kb
大肠杆菌素（colicin） E1和对E1免疫的 基因（immE1）
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1 （ColE1-），但仍然 表现出对E1免疫型（皿1^1+）
pBR322
兀件来源①复制起点orip
酵母人工染 色体载体YAC细菌人工染 色体载体BAC
P1噬菌体人 工染色体载 体PAC
质粒载体总结
质 粒 载 体
类型
长度
选择标记
克隆位点
pSC101
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一部分：概念解析
二部分：问题解答
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔
5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
根据发现者的名字，命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。
由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3’端一部分序列互补，因此S-D序列也叫做核糖体结合序列。
真核生物存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。
加Kozark sequence(GCCACC), Kozak sequence是用来增强真核基因的翻译效率的。
是最优化的ATG环境，避免ribosome出现leaky scan）
克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。
但不具备表达元件。
而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内都是低拷贝的，防止渗漏表达。
克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。
1.载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。
2. 载体的分类
按功能分成：（1）克隆载体: 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。
它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。
（2）表达载体:具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs
等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
按进入受体细胞类型分：（1）原核载体（2）真核载体（3）穿梭载体（sbuttle vector）指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.
克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高,在做上游克隆时比较方便, 其重点在于质粒的复制.
问题：
基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目的蛋白，那么实际应用中，我们的最终目的是要得到目的蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？还是说利用克隆载体实现目的基因的大量复制后，再将其转移到表达载体中实现表达？它是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能？构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难？
回答：
1.克隆的目的比较单一，就是将你感兴趣的DNA片段，重组进入载体，然后于宿主细胞中大量繁殖，主要用于各种文库的建立，比如人类基因组计划；同时由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的，而克隆载体没有表达所需的各种片段，所以可以容纳更长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更高。
2.重组DNA需要使用限制性内切酶，因此待克隆的目的片段两端必需有其识别位点，现在的T/A克隆载体可以直接克隆PCR产物，省去了两端加装识别位点的设计，PCR效率就更高。
3.表达载体的目的是多样化的，为了实现实际工作中的需要，不同的目的就要设计不同的载体，用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂。
4.细菌摄取能量的能力是一定的，如果用来合成大量蛋白质，合成核酸就会少。
5.细菌承受的工作负荷也是有限的，给它的工作太多，效率必然低下，这和我们日常生活是一个道理。
原因很简单，不是不能，是完全可以，但是效率会低很多。
所以我们一般的策略是，将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。
回答的不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助。
1)
2)您好！
您博文里得“T/A克隆载体可以直接克隆PCR产物，省去了两端加装识别位
点的设计，PCR效率就更高。
”是什么意思？
博主回复：2009-10-16 09:51:51
T/A克隆载体是PUC载体的线性化后两端加了T，而Taq酶有在PCR产
物后随机加A的特性，所以PCR产物直接可以接入T载体。
而经典的克
隆PCR产物需要限制性内切酶切割后接入载体，所以在设计PCR引物时
两端要加酶的识别位点，而加装的序列与模板不配对，因此PCR效率会低
很多。
3)老师，您好！
您的意思是说克隆载体只是为了得到大量的目的基因，而现在多用PCR就可以达到这个目的。
那这个目的基因的主要用途是什么？只用来测序吗？
表达载体应该兼有克隆与表达的功能的吧？
博主回复：2010-03-20 13:07:05
嗯，基本是这个意思。
就测序不克隆也可以进行，克隆到载体的CMS中
就在基因两端有了可供你选择的很多限制性酶切位点，方便亚克隆到各种
表达载体上。
当然表达载体可以克隆，但是效率低于克隆载体。
一是因为
表达载体不能直接克隆PCR产物，必须加装限制性酶切识别序列，上面已
经讲过。
二是表达载体的选择相对克隆载体是更加严谨型的质粒，就是每
个细菌里的拷贝数较低，能量守恒，细菌摄取能量的能力是一定的，用来
合成蛋白质，核酸的合成必然受一定得限制。
4)老师您好，我要构建一个基因的载体，
1.我可以将目的基因（1.3kb左右）和表达载体分别作酶切后连接吗？这几天将
目的基因做了一个T载体连接，可是不知道下一步怎么利用？
2.设计引物的时候用了sac1和hind111，做pcr的时候可以用pfu酶吗？pfu酶
是必须的吗？
3.我选择的表达载体上sac1和hind111的酶切位点只是相差两个碱基，做双酶
切的时候能切开吗？
回复：
1.如果你的目的基因已经在T载体上，当然可以分别酶切后连接，但是要注意方向。
2.如果是T载体连接PCR的引物可以不设计酶切位点。
T载体可以直接连接PCR 产物源于其末端错加的A，所以不能使用高保真的PFU。
但是你的扩增片段较长，如果用一般的TAQ酶，合成中可能会出错，用PFU准确度高，需要设计酶切位点。
如果PCR产物设计了酶切位点就可以直接克隆进需要的载体，不必借助T载体。
文献上有报道，按1：1的比例混合使用PFU和TAQ效果更好。
3.应该能切开，因为设计引物时保护碱基也就2到3个，但是最好稍微距离远一点。