为什么要先构建克隆载体再用表达载体
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
）其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3 —9bp组成的序列。
这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。
(整理)克隆载体与表达载体
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
2022年吉林农业科技学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年吉林农业科技学院食品科学与工程专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、放线菌的代表属有______、______、______、______等。
2、亚病毒包括______、______、______和______。
3、化能自养微生物例如______，它们的生物氧化和产能代谢等生理活动很难研究，其客观原因是它们的______效率低，______速率低，以及 ______得率低。
4、营养物质进入细胞的主要影响因素是______、______和______。
5、酵母菌的无性繁殖方式主要有______和______。
6、微生物学发展史上发展期的实质为______水平研究，其主要特征是：① ______，②______，③ ______，④ ______，⑤ ______。
7、消毒和灭菌的区别是______。
8、微生物寄生于其他微生物的例子如______、______；微生物寄生于植物的例子如______；微生物寄生于动物的例子如______。
9、普通性转导的基本要求是______，它可能出现的三种后果是______、______和______。
10、抗原与抗体间有八类主要反应，例如______、______、______和______等。
二、判断题11、支原体是已知的可以自由生活的最小的原核微生物。
（）12、有些假单胞菌可以利用多达90种以上的碳源物质。
（）13、反硝化作用是化能自养微生物以硝酸或亚硝酸盐为电子受体进行的无氧呼吸。
（）14、朊病毒（奇异病毒）是只含有侵染性蛋白质的病毒。
（）15、赤霉菌在分生孢子梗上可产生大小两种分生孢子，大分生孢子镰刀形，有3～5个横隔，它们通常单生或丛生在分生孢子梗顶端。
（）16、菌株的概念与克隆的概念相差甚远。
（）17、微生物在发酵罐内培养过程中，发生了培养基逐渐变酸而妨碍其代谢产物累积的现象，这时最好的措施就是不断地从外界加入NaOH或Na2CO3溶液去中和它。
2022年汕头大学生物技术专业《微生物学》期末试卷A(有答案)
2022年汕头大学生物技术专业《微生物学》期末试卷A(有答案）一、填空题1、Anabaena azotica的异型胞通常是______生，在光学显微镜下它是______的，细胞两端有______。
它能控制______的进入，保持异型胞内______，以利于______。
2、病毒没有细胞构造，其主要成分为______和______两种，故又称“分子生物”。
3、面包酵母对游离葡萄糖非常敏感，高浓度葡萄糖抑制酵母的呼吸，导致酒精和有机酸生成，严重影响______，低浓度葡萄糖则可使酵母细胞产量明显增加，因而连续补加______就可控制发酵方向，高产出大量面包酵母。
4、微生物培养基中各营养要素的量有一定的比例，从含量最多的______开始，其他成分的次序是______、______、______、______和______。
5、酵母菌有性繁殖一般通过邻近的两个形态相同而性别不同的细胞各自伸出一根管状的原生质突起相互接触、局部融合并形成一条通道，再通过______、______和______形成四个或八个子核，然后它们各自与周围的原生质结合在一起，再在其表面形成一层孢子壁，这样一个个子囊孢子就成熟了，而原有的营养细胞则成了子囊。
6、微生物学的发展简史可分为______、______、______，现处于______。
7、在微生物培养过程中，会发生不利于其继续生长的pH变化，一般可采取两类方法作外源调节：① ______，过酸时可加入______或______ 等调节；过碱时，可加入______或______等调节；② ______，过酸时可通过______或______调节，过碱时可通过______或______调节。
8、磷的生物地球化学循环包括3种基本过程：______、______、______。
9、典型质粒的核酸分子是______，存在于质粒上的特定基因，使微生物获得了若干特殊功能，如______、______、______、______、______ 或______等。
2022年兰州大学生物技术专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年兰州大学生物技术专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、支原体是一类______、介于______和______之间的最小型原核生物，其中有一类专门感染植物的支原体，称为______。
2、温和噬菌体的存在形式有三种，即______、______和______。
3、光能自养微生物有产氧与不产氧两大类，前者如______等，后者如______等。
4、生长因子主要包括______、______和______，它们对微生物所起的作用分别是______、______和______。
5、真核生物的细胞核由______、______、______和______4部分组成。
6、要加速发展我国的微生物学，应努力从以下几个方面人手： ______；______；______；______等。
7、最常见的厌氧菌有① ______，② ______，③ ______，④ ______，⑤ ______，⑥ ______等。
8、在生命科学研究领域中，从宏观到微观一般可分10个层次，即______、______、______、______、______、______、______、______、______和______，其中前4个层次是生态学的研究范围。
9、外源DNA导入原核细胞可以采用以下3种方法：______方法，即重组质粒载体导入感受态细胞；______方法，即重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒导入感受态细胞；______方法，即外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒导入宿主细胞。
10、生物制品的内容可分四大类，即______，______，______和______。
二、判断题11、异染粒的化学成分是PHB。
（）12、细胞中的四种有机元素的干重占细胞干重的95%以上。
（）13、凡能进行硝酸盐呼吸的细菌，都存在着一条完整的呼吸链。
（）14、朊病毒（奇异病毒）是只含有侵染性蛋白质的病毒。
（）15、菌核和子实体都是由菌丝形成的。
克隆载体与表达载体
分类
结构组成及表达兀件
特点或优点
备注
质 粒 表 达 载 体
原核表达载 体
1启动子、
2转录终止子（防止克隆的外源基因表达干
扰载体的稳定性）
（1）基因组大小；去除非必需区，建立 外源DNA片段的克隆或替换位点（2） 在DNA的非必需区插入选择标记：lacZ基因；基因cl失活（cl基因：溶源 过程控制基因）；Spi筛选（野生型人 噬菌体在带有P2原噬菌体的溶源性E.coli中的生长会受到限制的表型， 称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏 感）
YAC的构建有比在细菌中克隆的一些优点，因为某些真核 细胞的序列，特别是重复序列是难以甚至不可能在细菌中 繁殖的，酵母细胞却具有这样的能力
5
色
体
细菌人工染色体 载体
BAC
是基于大肠杆菌 的F质粒构建 的，高通量低拷 贝的质粒载体
每个环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标 记，一个来源于大肠杆菌F因子（致育因子） 的严谨型控制的复制子oriS（Shizuya et al.
主要使用EcoR I
ColEl
天然质粒，属松弛型多拷贝型
6.3 kb
大肠杆菌素（colicin） E1和对E1免疫的 基因（immE1）
EcoR I位于E1内部，插入外源DNA会导致E1失活，使受体菌不能合成E1 （ColE1-），但仍然 表现出对E1免疫型（皿1^1+）
pBR322
兀件来源①复制起点orip
酵母人工染 色体载体YAC细菌人工染 色体载体BAC
P1噬菌体人 工染色体载 体PAC
质粒载体总结
质 粒 载 体
类型
长度
选择标记
克隆位点
pSC101
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为什么要先构建克隆载体再用表达载体
构建克隆载体是大量扩增DNA片段，用以测序、酶切和改造等对DNA实施的后续操作，构建表达载体是大量得到翻译产物——蛋白质。
为什么要先构建克隆载体，再用表达载体，我猜是因为：
①得到大量的DNA，虽然PCR也可以，但PCR扩增有出错率、但你每做一次常规的PCR，而且每次都要重新提DNA和RNA才行，而且，PCR反应的试剂盒又不便宜，用PCR来制备大量DNA有点得不偿失。
尽管构建克隆载体也存在操作复杂（相对于PCR），成功率不是极高，而且还要筛选，但一旦你重组成功并转入了大肠杆菌，你就可以保存了，你想什么时候用，摇个菌，就可以制备到大量的DNA。
②测序需要。
你想转表达，你首先得确定你扩增的目的片段是不是你要的，不要以为你设计了个特异性引物，然后跟你mark的长度就可以确定了，这也只是推测，在科学上不严谨。
扩增出的基因片段保险起见或者经费允许，要拿去测序，而一般送测的序列都是构建到载体上的序列，克隆载体上一般也都带有测序引物，已确定这就是你要的那条序列。
你要写论文必须要给人真凭实据。
先构建克隆载体再构建表达载体并不是一个必须的选择，如果你的扩增PCR目的条带很亮，而且单一性很好，我建议你可以直接克隆进入表达载体。
很多人选择先构建克隆载体，是因为在扩增基因时目的条带模糊，特异性不好，这样将基因连接到克隆载体上就可以便于挑去单克隆进行测序，增加测序的准确度，从而确认自己克隆基因序列的正确性。
单纯的PCR产物往往是一些各种PCR片段的混合物，直接送过去测序，往往导致测序信号峰很杂，有时候并不能测出想要的信号序列。
同时保存的PCR片段比较容易降解，而构建好克隆载体后形成的质粒是很容易扩增和保存的。
先构建克隆载体，一是为了便于测序，确认克隆序列正确，二是为了便于基因PCR片段的保存。
怎么构建克隆载体和表达载体？
首先根据你的实验需要选择相应的载体。
其次分析你的基因序列以及载体序列上的酶切位点，切记在载体上所选择的酶切位点要和你
的基因序列上相一致，并且这两个酶切位点在你的基因序列中并不存在，否则会将基因切断再次就是对基因和载体进行酶切了，基因要是直接用带有酶切位点的引物进行PCR的话就不用再酶切了。
酶切之后进行连接，一般都有连接试剂盒的。
最后的重组质粒要转化至大肠杆菌中进行扩增，然后提取这个质粒进行酶切鉴定。