克隆载体与表达载体
基因克隆载体有什么用途
基因克隆载体有什么用途
1.基因表达载体：基因克隆载体被用来将感兴趣的基因克隆到表达主
机中。
通过将基因与适当的调控序列结合，如启动子、增强子和终止子等，可以实现对基因的调控和表达。
这种表达基因的载体在生物制药、蛋白质
生产以及基因治疗等领域有广泛的应用。
2.基因敲除载体：基因克隆载体可以用于基因敲除研究，即通过将目
标基因的编码序列替换或删除，实现对基因功能的研究和破坏。
这种方法
可以用来揭示基因在生物发育、生理过程和疾病发生中的作用和机制。
4. RNAi载体：基因克隆载体还可用于RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术研究。
通过将特定的RNA序列克隆到载体中，可以实现对目标
基因的特异性抑制，进而揭示基因功能和信号传导途径。
5.DNA库构建：基因克隆载体也可以用于构建DNA库，即将一组基因（如全基因组）克隆到载体中形成文库。
这种文库可以用来筛选和分析目
标基因，加快新基因发现和功能研究的进程。
此外，基因克隆载体还可以用于分子标记和荧光报告基因的构建，以
及基因转导、基因传递和转基因生物的制备等方面。
总的来说，基因克隆
载体是基因工程研究中的重要工具，可以实现对基因的调控、研究和应用，对生物学研究、生物技术开发和医学治疗等领域具有重要的推动作用。
(整理)克隆载体与表达载体
一部分：概念解析二部分：问题解答克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
) 其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体与表达载体
克隆载体与表达载体
1. T载体是克隆载体，你的基因通过TA克隆法插入载体，这一步的目的是扩增基因，得到大量你要的目的基因片段，以便进行下一步表达载体的构建；DH5α是克隆菌株，不能用来做表达；
2. 欲在大肠杆菌中表达外源基因，需要首先构建原核表达载体，如可将构建至T 载体的目的通过双酶切切下来然后连接到表达载体上，如PET系列的载体等，构建成原核表达载体后，可将此载体转化表达菌株，如BL21(DE3,)等，如果你的目的基因含有稀有密码子，也可以转化Rosetta系列的表达菌株。
最后将构建成功的基因工程菌进行诱导表达。
1、T载体常用于克隆，一般来讲都会再把目的基因亚克隆到表达载体上。
但是并非T载体不能用来表达。
常见的pMD18-T，含有lacZ操纵子，可以IPTG诱导表达。
pGEM-T则含有T7和SP6启动子。
2、为了能够顺利地使用T7系统来表达蛋白，在如BL21（DE3）一类的大肠杆菌菌株中，编码T7RNA聚合酶的基因被整合到其染色体上，并位于lacUV5启动子的下游，受乳糖操纵子调控。
而目标蛋白的编码序列则被构建到含T7启动子序列的质粒上，并受T7RNA聚合酶调控转录。
3、构建质粒、基因表达看似比较成熟，也比较简单。
其实这里面大有学问。
学会看菌株和质粒的相关文档，答案就在其中。
克隆载体与表达载体
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体与表达载体教程文件
克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体(Cloning vector )：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
(这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA 分子。
)其中，为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3—9bp组成的序列。
这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。
克隆载体
青霉素抗性检测、蓝白斑筛选(重组表型检测标记)
15
三个显著区别：
1. 分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更 高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）
2. 含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZα，可利 用-互补原理进行蓝白筛选
3. 多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成
第一节 载体简介 第二节 克隆载体* 第三节 人工染色体载体 第四节 表达载体
概念：携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和 表达的工具称载体（Vector）;即用于克隆、运载和转移目的基 因并能自我复制的DNA分子
一个DNA片段只有与合适的载体DNA连接构成重组 DNA后，才能高效地进入宿主细胞，并在其中复制、扩增
3. 加入选择性标记：通过质粒间的重组使质粒携带合适标 记，常用的有抗生素抗性标记。如：氨苄青霉素抗性标 记、四环素抗性标记、卡那霉素抗性标记等
4. 安全性能改造：不能随便转移，以免污染环境 5. 改造或增加基因表达的调控序列：比如加入强启动子
8/4/2019
11
4363bp
8/4/2019
12
Ampr
3. 加装选择标记
如加入lacZ’ 使受体细胞在裂解之后形成蓝色透明圈
8/4/2019
29
B. λ噬菌体载体分类
1. 插入型载体: 仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点，如λgt系列 只能插入较小的外源DNA片段（小于10kb）
cos
cos
LA
RA
EcoRI
2. 替换型载体：具有两个对应的酶切克隆位点
噬菌体还有一大优点，即使它的DNA丢失25％仍不失活， 这部分丢失的空档正好可以装载外源DNA
简述基因克隆载体的主要类型
简述基因克隆载体的主要类型
基因克隆载体是指一类可以携带外源DNA片段并能够被复制的DNA分子。
常用于基因工程中，将特定基因序列克隆到载体DNA上，进而进行转化和表达。
根据不同的功能和应用，基因克隆载体可以分为多种类型，以下是主要的几种：
1. 质粒（Plasmid）：质粒是最常用的基因克隆载体之一，通常起源于细菌，具有自主复制的能力，易于操作和扩增。
质粒通常被用于基因表达、基因敲除和基因突变等领域。
2. 病毒载体（Viral Vector）：病毒载体是一类通过改造病毒而成的基因克隆载体，具有高度的转染效率和生物安全性。
病毒载体通常被用于基因治疗、免疫治疗和癌症治疗等领域。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）：人工染色体是一种可以模拟天然染色体结构和功能的基因克隆载体，通常具有高度的稳定性和扩增性能。
人工染色体通常被用于基因组学研究和治疗复杂遗传病等领域。
4. 原核表达载体（Prokaryotic Expression Vector）：原核表达载体是一类专门用于大肠杆菌等原核生物中进行基因表达的基因克隆载体。
原核表达载体通常具有高度的表达效率和易于操作的特点，被广泛应用于蛋白质制备和生物技术研究等领域。
质粒载体种类
质粒载体种类
质粒载体种类繁多，可以根据其功能和用途进行分类。
以下是一些常见的质粒载体类型：
1. 克隆载体：这种类型的质粒主要用于克隆和扩增DNA片段。
它们通常具有易于克隆的限制性酶切位点，以及细菌选择标记和多克隆位点。
2. 表达载体：表达载体用于在宿主细胞中表达目的基因。
这些载体包含可调控的启动子和终止子，以及选择标记和目的基因的克隆位点。
3. 干扰基因表达载体：这种载体主要用于抑制目标基因的表达。
它们通常包含干扰RNA（RNAi）的序列，以沉默特定基因的表达。
4. 病毒载体：病毒载体可以利用病毒的特性来传递遗传物质。
它们可以携带治疗性基因或用于基因编辑，并通过感染宿主细胞来传递这些基因。
此外，还可以根据质粒的拷贝数、复制起始区、选择标记基因区、多克隆位点等特征对质粒载体进行进一步分类。
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克隆载体：大多是高拷贝的载体，一般是原核细菌，将需要克隆的基因与克隆载体的质粒相连接，再导入原核细菌内，质粒会在原核细菌内大量复制，形成大量的基因克隆，被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。
克隆载体只是为了保存基因片段，这样细胞内不会有很多表达的蛋白质而影响别的工作。
克隆载体（Cloning vector ）：携带插入外源片段的质粒或噬菌体，从而产生更多物质或蛋白质产物。
（这是为携带”感兴趣的外源DNA实现外源DNA勺无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
）
其中，为使插入的外源 DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。
是否含有表达系统元件，即启动子 -- 核糖体结合位点 -- 克隆位点 -- 转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。
表达载体：有的是高拷贝的，有的是低拷贝的，各有各的用处，是一些用于工程生产的细菌，被导入的目标基因会在此类细菌中得到表达，生产出我们需要的产物，导入的基因是由克隆载体产出的。
表达载体具有较高的蛋白质表达效率，一般因为具有强的启动子。
表达载体（ Expression vectors ）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。
如表达载体 pKK223-3 是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。
其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一
个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
（RBS位点：1974年Shine和Dalgarno首先发现，原核生物，在 mRNAk有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3〜10 bp处的由3 —9bp组成的序列。
这段序列富含嘌吟核苷酸，刚好与16S rRNA 3，末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体 RNA的识另U与结合位点。
根据发现者的名字，命名为 Shine-Dalgarno 序列，简称 S-D 序列。
由于它正好与30S小亚基中的16s rRNA3 '端一部分序列互补，因此 S-D序列也叫做核糖体结合序列。
真核生物存在于真核生物mRNA勺一段序列，其在翻译的起始中有重要作用。
加Kozark
sequence（GCCACC）, Kozak sequence 是用来增强真核基因的翻译效率的。
是最优化的ATG环境，
避免 ribosome 出现 leaky scan ）
克隆载体目的在于复制足够多的目标质粒，所以常带有较强的自我复制元件，如复制起始位点等，往往在菌体内存在多拷贝，所以抽质粒会抽出一大堆。
但不具备表达元件。
而表达质粒有复杂的构成，为的是控制目标蛋白的表达，如各种启动子（T7），调节子（LacZ）等，而且以pET为代表的表达载体在菌体内
都是低拷贝的，防止渗漏表达。
克隆载体只是把你要的基因片段拿到就可以了，不管读码框什么的，但是表达载体是不但要你的目的基因连在上面，而且要表达蛋白，所以就要求你的读码框不能乱了，否则就不能得到你想到的表达产物。
1. 载体即要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细
胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector ）。
2. 载体的分类
按功能分成：（ 1）克隆载体 : 都有一个松弛的复制子，能带动外源基因，在宿主细胞中复制扩增。
它是用来克隆和扩增DNA片段（基因）的载体。
（2）表达载体：具有克隆载体的基本元件（ori,Ampr,Mcs等）还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。
按进入受体细胞类型分：（ 1 ）原核载体（ 2）真核载体（ 3）穿梭载体（ sbuttle vector ）指在两种宿
主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间）.
克隆载体顾名思义就是质粒拷贝数比较高 , 在做上游克隆时比较方便 , 其重点在于质粒的复制 .
问题：
基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目的蛋白，那么实际应用中，我们的最终目的是要得到目的蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？还是说利用克隆载体实现目的基因的大量复制后，再将其转移到表达载体中实现表达？它是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能？构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难？
1.克隆的目的比较单一，就是将你感兴趣的DNA片段，重组进入载体，然后于
宿主细胞中大量繁殖，主要用于各种文库的建立，比如人类基因组计划；同时由于载体所能容纳的目的片段的长度是有限的，而克隆载体没有表达所需的各种片段，所以可以容纳更长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更高。
2.重组DN箱要使用限制性内切酶，因此待克隆的目的片段两端必需有其识别位点，现在的T/A克隆载体可以直接克隆PCF产物，省去了两端加装识别位点的设计，PCF 效率就更高。
3.表达载体的目的是多样化的，为了实现实际工作中的需要，不同的目的就要设计不同的载体，用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂。
4.细菌摄取能量的能力是一定的，如果用来合成大量蛋白质，合成核酸就会少。
5.细菌承受的工作负荷也是有限的，给它的工作太多，效率必然低下，这和我们日常生活是一个道理。
原因很简单，不是不能，是完全可以，但是效率会低很多。
所以我们一般的策略是，将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。
回答的不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助。
1) “T/A克隆载体可以直接克隆 PCR产物，省去了两端加装识别位点的设计，PCF效率就
更高。
”是什么意思？
T/A克隆载体是PUC载体的线性化后两端加了 T，而Taq酶有在PCR产物后随机加 A的特性，所以PCR产物直接可以接入 T载体。
而经典的克隆 PCR产物需要限制性内切酶切割后接入载体，所以在设计 PCR引物时两端要加酶的识别位点，而加装的序列与模板不配对，因此 PCR效率会低很多。
2) 克隆载体只是为了得到大量的目的基因，而现在多用PCR就可以达到这个目的。
那这
个目的基因的主要用途是什么？只用来测序吗？表达载体应该兼有克隆与表达的功能
的吧？
嗯，基本是这个意思。
就测序不克隆也可以进行，克隆到载体的CMS中就在基因两端
有了可供你选择的很多限制性酶切位点，方便亚克隆到各种表达载体上。
当然表达载体可以克隆，但是效率低于克隆载体。
一是因为表达载体不能直接克隆PCR产物，必须加装限制性酶切识别序列，上面已经讲过。
二是表达载体的选择相对克隆载体是更加严谨型的质粒，就是每个细菌里的拷贝数较低，能量守恒，细菌摄取能量的能力是一定的，用来合成蛋白质，核酸的合成必然受一定得限制。
3）我要构建一个基因的载体，
1. 我可以将目的基因（ 1.3kb 左右）和表达载体分别作酶切后连接吗？这几天将目的基因做了
一个 T 载体连接，可是不知道下一步怎么利用？
2. 设计引物的时候用了 sac1 和 hind111 ，做 pcr 的时候可以用 pfu 酶吗？ pfu 酶是必须的
吗？
3. 我选择的表达载体上 sac1 和 hind111 的酶切位点只是相差两个碱基，做双酶切的时候能切
开吗？
1. 如果你的目的基因已经在 T 载体上，当然可以分别酶切后连接，但是要注意方向。
2. 如果是T载体连接PCR的引物可以不设计酶切位点。
T载体可以直接连接 PCR产物源
于其末端错加的 A,所以不能使用高保真的 PFU但是你的扩增片段较长，如果用一般
的TAQ酶，合成中可能会出错，用 PFU准确度高，需要设计酶切位点。
如果 PCR产物设计了酶切位点就可以直接克隆进需要的载体，不必借助T载体。
文献上有报道，按 1:1 的比例混合使用 PFU和TAQ效果更好。
3. 应该能切开，因为设计引物时保护碱基也就2到 3个，但是最好稍微距离远一点。
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