第四章基因克隆的载体
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基因工程载体
二、噬菌体载体 （一）、λ噬菌体载体
1、λ噬菌体载体的特征
λ噬菌体颗粒中DNA为线状双链DNA分子，全长48502bp， 两端各有一段长度为12个核苷酸的互补单链（粘端），称 为cos位点。λ 噬菌体有61个基因，其中有1/3的区域是其 裂解性生长的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中 插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这就是λ 噬菌体 可作为基因载体的依据 。
第一节
微生物基因工程载体
克隆载体（cloning vecto载体（expression vector）：能使目的基因在宿 主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子， 更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细 胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ 质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。
共同的特点：
①含有E.coli质粒的复制起始序列，这样在外源基因转到酵 母细胞前可先在大肠杆菌中扩增。
外源基因的插入：
PstI Amp r Tet r Amp s Tet r
重组体的筛选
. .. . . . . .
涂布有Tet的培养基
.. .. . .
涂布有Amp的培养基
3、pUC系列质粒载体
（1）特点 具有更小的分子 量（2686bp）和 更高的拷贝数。 具有多克隆位点
可用组化方法鉴别：
含有一个来自于大肠杆菌的经过加工的LacZ基因 （LacZ′），它编码β -半乳糖苷酶氨基端146个氨基酸 ， 可以和β -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现基因内互补， 即α —互补 ，恢复分解乳糖的能力。 X-gal也是β -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴 氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无β -半乳糖苷酶时， X-gal不被分解，菌落呈白色。 当外源基因插入到pUC质 粒的LacZ′基因内部，则LacZ′基因受到破坏，便不能 再和缺陷型受体菌中生成有活性的β -半乳糖苷酶，因此， 菌落呈白色。 反之，非重组体为蓝色菌落。 可通过插入失活法进行筛选
基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
第四章 基因工程的质粒载体
（a）表示位于F-细胞中的ColE1质粒的状，它的mob基因进行了转录，其产物 使bom位点发生单链断裂而出现缺口，于是ColE1 DNA 便从超盘旋的的结构 转变成为缺口环状的构型。但ColE1质粒缺乏形成性须的能力，无力进行结合 配对，所以它的DNA也就不能从一个细胞转移到另一个细胞。正是由于不能 够发生转移，这种从超盘旋到缺口环状的构型转变过程，就有可能被回复， 所以就出现这两种构型之间的平衡状态。
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
(1)高拷贝数的质粒载体 - 西北师范大学
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基因工程
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高拷贝数：自身基因功能控制，与寄主无关
低拷贝数：自身与寄主共同控制，与寄主染色体同步复制
失控：一些低拷贝数的质粒，其复制控制是温度敏感型的。 例如 POU71质粒，在低于 37C下培养，每条染色体平均只有一个拷贝， 但当温度上升到42 C时，其拷贝数可增加到1000个以上。在这种高温环 境下，细胞的生长及蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。这期 间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了
基因工程
第四章 基因工程质粒载体 返回第四章
4.2.2 质粒拷贝数控制
常用的定义是指，生长在标准的培养基条件下，每个细菌细 胞中所含有的质粒DNA分子的数目. •10~100个拷贝，称为高拷贝数质粒，松弛型 •1~4个拷贝，为低拷贝数质粒，严紧型 •质粒最多可以占到细菌总DNA的0.1％ ~ 5％。
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4.4.3 质粒载体的选择记号
素抗性等多种。
包括有新陈代谢特性、对大肠杆菌素EI的免疫性，以及抗菌
绝大多数的质粒载体都是使用抗菌素抗性记号，而且主要集 中在四环素抗性、氨节青霉素抗性、链霉素抗性、卡那霉素 抗性等少数几种抗菌素抗性记号上。 一方面是由于许多质粒本身就是带有抗菌素抗性基因的抗药
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基因工程
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4.1.3 质粒的转移
4.1.3.1 按结合方式分类类型：结合型和非结合型 雌一雄细胞配对过程为细菌的接合作用。
分类 主要基因
按抗性记 号分类 Col质粒 R质粒 F质粒 Col质粒 R质粒 Col质粒
第四章克隆载体的特征及类型
吸附
LamB受体 注入
复制
包装
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。
Amp Tet
pBR322
插入片段
Tet平板
Amp平板
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
质粒的基本特征
质粒
质粒的不相容性：分子机制
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒) 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性
质粒
由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒的基本特征
质粒
5. 携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
2、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测； 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因 插入；
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
第4章 载体的选择与构建
大多数自主转移质粒都有tra基因和oriT位点，它们在质粒 自主转移过程中起着重要作用。
tra 基因：大多数 tra 基因的产物与性菌毛的形成 (F 、 RP4 和 pKMl01 都 编码一根性菌毛 )、杂交对的形成有关；有些 tra基因编码作用于 oriT位 点的内切酶，使质粒中的一条 DNA链产生切口，从而开始转移；有些 tra基因则与质粒转移调控等有关。
pMB1, colE1 replicon 修饰的pMB1 replicon pSC101 pUB110 pE194 replicon
拷贝数15～20
宿主范围小：肠细菌
拷贝数500～700 宿主范围小：肠细菌（pUC系列) 拷贝数5 50 5 宿主范围广 多种革兰氏阴性菌 广 多种革兰氏阳性菌 广 多种革兰氏阳性菌
pSC101 replicon
1.4 质粒的不稳定性 ★
分离不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒 DNΑ
拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体；
结构不稳定性：由转位作用和重组作用所引起的质粒 DNA的重排与缺失
质粒的分配方式： 主动分配 平均分配:每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝 配对位点分配:只有一对质粒呈主动分配，其余的是随机分配。 主动分配存在着有效的质粒拷贝数控制系统，从而保证了质粒的高度稳 定性 随机分配 分配不稳定，部分子细胞没有质粒，并在生长过程中具有优势而逐渐使 含质粒细胞比例越来越少
RBS，融合tag） 基因敲除质粒（筛选系统，目的基因的 同源片段） 辅助性质粒（例如提供位点特异性重组酶）
1.3 质粒的复制 ★
1.3.1 复制子(replicon) 包括复制起点(ori)、复制控制元件、复制蛋白编码基因的遗 传单元
基因工程-第四章
（4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。
抗菌素抗性
外源DNA 无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体（Direct selection vectors）
直接选择转化后的细胞。只有带有选择标记基因的转化 菌细胞才能在选择培养基上生长。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正选择载体。
各类载体
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
pBR322 外源基因Pst I
Tet中存活 但在Amp中死亡
外源基因BamH I Amp中存活 但在Tet中死亡
3. pUC系列
•University of California 的 J. Messing 和 J. Vieria 于1978年，在pBR322 的基础上改造而成，如 pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、 pUC19。 • 元件来源
• 质粒空间构型与电泳速率
分子量相同的，scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最 慢。
OC L
SC
质粒的生物学基本特性
1.自主复制性
• 质粒复制子是质粒 DNA 中能自主复制并维持正常拷贝数的 一段最小的核酸序列单位。
• 两部分组成：复制起始区（ori）及其相关的调控元件。 • 质粒能利用寄主细胞的 DNA 复制系统进行自主复制。 • 质粒 DNA 上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系
必要的条件能力。
理想载体至少必备的条件
① 能在宿主细胞中自主复制 ②容易进入宿主细胞 ③ 容易插入外来核酸片段 ④ 容易从宿主细胞中分离纯化，便于重组操作 ⑤ 具有合适的筛选标记 ⑥ 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性
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第二节 噬菌体载体
（Bacteriophage，简称phage）
一、λ噬菌体载体
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genome
溶源阶段
(整合到寄主染色体上)
溶菌阶段
(复制和释放)
The phage cos ends(cohesive-end site )
Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段 引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活 后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。
λgt 10
LA 32.7
cI EcoR I
RA10.6
Charon 16A
LA 19.9
lac Z EcoR I
RA21.9
λ 替换型载体（取代型载体）
MCS
M13mp19
MCS
EcoRI BamHI HindIII PstI BglI
BglI PstI HindIII BamHI EcoRI BamHI & PstI
B P
P B
B
P
B
P
B
P
M13克隆 载体分子 结构图
单链DNA噬菌体载体
M13、f1、fd 优越性： 1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这 种复制形式的DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多少制约的， 不存在包装限制问题； 4. 容易测定外源DNA片断的插入取向； 5. 可产生含外源片断的单链DNA分子。
1.酶切 3.组装
2.连接
4.侵染
体外包装
λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装， 然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细 胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达 106～108/μgDNA，而以转染（translation）的方式 导入的频率仅为103～105/ μgDNA。 λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%-105%。
EMBL3、DASH 外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感 染和复制非必要的片段 (～20 kb)
高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA, 比 质粒高 100倍)
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体 外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。 spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当臵换型载 体的可臵换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了臵换片 段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就不能 正常生长。 替换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。
7. 含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基 因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子
8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中， 可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；
9. 在pUC118和pUC119这两 个载体中，多克隆位点 区的核苷酸序列取向是 彼此相反的，于是它们 当中的一个可转录克隆 基因的正链DNA，另一个 则可转录出负链DNA； 10. 可以直接对克隆的DNA 片断进行核苷酸的序列 测定，免去了从质粒载 体到噬菌体的这一烦琐 的亚克隆步骤。
λ phage
Protein coat DNA
Long (left) arm
short (right) arm Nonessential region
cos
12bp
cos
Exogenous DNA (~20-23 kb)
λ phage
• Viruses that can infect bacteria.
Blue-white selection
M13载体系列的优点
1.在这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷 酶基因片段（ HindⅢ 片段），其中插入了一段 具有密集的多克隆位点的序列； 2.M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的， 可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。
M13mp18
用于体外转录
四、柯斯(cosmid）质粒载体
polylinker
Ampr Cosmid Cos site
CoEⅠ ori
柯斯质粒载体
cosmid载体也称粘粒、柯斯载体。
这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的 cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。 cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及 λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后， 可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染 的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体， 而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。
柯斯质粒载体的特点
1. 2. 3. 4.
具有λ噬菌体的特性； 具有质粒载体的特性； 具有较高容量的克隆能 力； 具有与同源性序列的质 粒进行重组的能力
由于λ噬菌体包装时，当DNA 的长度短于野生型的78%或超过 105%时，噬菌体的活性就急剧 下降。因此只包装它的野生型 DNA（48.5KB）的75% ～ 105% 左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA 和外源DNA长度之和在39～53kb 之间。 插入式载体可携带的外源DNA 片段较替换式为小。
根据体外互补作用研究发现，λ噬菌体的头部 和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了 突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生 了突变的噬菌体则只能形成头部。 将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成 有生物活性的噬菌体颗粒。这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理。
4. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不 经修饰便可直接插入到载体分子上；
5. 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照 IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；
6. lacZ基因是置于lac启 动子的控制之下，这样插 入的外源基因便会以融合 蛋白质的形式表达；
M13噬菌体的特点
1.感染Ecoli后，在 宿主细胞内会形成 双链的复制型DNA （ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒 DNA那样在体外进行 纯化和操作。
2.成熟的噬菌体颗粒仅 能感染E.coli的F+细胞， 这是因为这种噬菌体的 感染位点在性散毛上。 但是无论是RFDNA或 ssDNA都能转染E.coli 的F+或F-细胞。
1. 具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源 DNA片段，并易于进行分离与操作； 2. 编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌 粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中 生长，便于转化子的选择； 3. 拷贝数含量高，每个 寄主可高达500个，所以 只要用少量的大肠杆菌 细胞培养物，便可制备 出大量的载体DNA；
Linear form
通过Cos末端互补单链形成环状 DNA 分子， 在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶作用下，形 成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。
λ噬菌体的基因组结构
已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬 菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一 部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能， 我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。
三、噬菌粒载体
由质粒载体和单链噬菌体 载体结合而成的新型的载体 系列。 它具有质粒的复制起点、 选择性标记、多克隆位点等， 方便DNA的操作，可在细胞内 稳定存在；又具有单链噬菌 体的复制起点，在辅助噬菌 体的存在下，可进行噬菌体 的繁殖，产生单链的子代噬 菌体。
常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119
pBluescript 噬菌粒载体
基本结构： 1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子， 可以定向指导外源基因的转录活动； 2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来 自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取 不同的复制形式，分别合成单链或Байду номын сангаас链的DNA； 3.编码有一个氨苄青霉素抗性基因，供作转化子记号； 4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬 菌粒载体。
3.噬菌体颗粒的大小是受其DNA的 大小制约的，这一点正好与λ噬 菌体相反。所以M13噬菌体并不存 在包装限制的问题。
M13 life cycle
M13载体
具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位 点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择 上更为方便。 可以定向的克隆DNA片段，克隆在M13 RFDNA分子上的双链DNA 片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分 离ＤＮＡ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生 物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋）链，所以 M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子 中的哪条链，则完全取决于外源DNA克隆时的取向。这样一来， 为分别分离外源DNA分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问 题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。
（Bacteriophage，简称phage）
一、λ噬菌体载体
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genome
溶源阶段
(整合到寄主染色体上)
溶菌阶段
(复制和释放)
The phage cos ends(cohesive-end site )
Lac Z基因插入失活：如charon16A载体，在非必须区段 引入lac Z基因，在lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活 后利用X-gal法筛选（兰白筛选）。
λgt 10
LA 32.7
cI EcoR I
RA10.6
Charon 16A
LA 19.9
lac Z EcoR I
RA21.9
λ 替换型载体（取代型载体）
MCS
M13mp19
MCS
EcoRI BamHI HindIII PstI BglI
BglI PstI HindIII BamHI EcoRI BamHI & PstI
B P
P B
B
P
B
P
B
P
M13克隆 载体分子 结构图
单链DNA噬菌体载体
M13、f1、fd 优越性： 1.单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这 种复制形式的DNA简称RFDNA； 2. 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌； 3. 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA的多少制约的， 不存在包装限制问题； 4. 容易测定外源DNA片断的插入取向； 5. 可产生含外源片断的单链DNA分子。
1.酶切 3.组装
2.连接
4.侵染
体外包装
λ噬菌体DNA体外重组后，一般必须经过体外包装， 然后以噬菌体感染的方式将重组DNA导入E.coli细 胞内。这是因为以感染方式导入细胞的频率可达 106～108/μgDNA，而以转染（translation）的方式 导入的频率仅为103～105/ μgDNA。 λ噬菌体的包装限制为野生噬菌体DNA（约48.5 kb）的75%-105%。
EMBL3、DASH 外源DNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体的感 染和复制非必要的片段 (～20 kb)
高感染效率 (109 转化株/ug 载体 DNA, 比 质粒高 100倍)
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体 外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。 spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当臵换型载 体的可臵换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了臵换片 段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就不能 正常生长。 替换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。
7. 含有质粒的复制起点，在没有辅助噬菌体的情况下，克隆的外源基 因可以像质粒一样按常规的方式，复制形成大量的双链DNA分子
8. 带有一个M13噬菌体的复制起点，在有辅助噬菌体感染的寄主细胞中， 可以合成出单DNA拷贝，并包装成噬菌体颗分泌到培养基中；
9. 在pUC118和pUC119这两 个载体中，多克隆位点 区的核苷酸序列取向是 彼此相反的，于是它们 当中的一个可转录克隆 基因的正链DNA，另一个 则可转录出负链DNA； 10. 可以直接对克隆的DNA 片断进行核苷酸的序列 测定，免去了从质粒载 体到噬菌体的这一烦琐 的亚克隆步骤。
λ phage
Protein coat DNA
Long (left) arm
short (right) arm Nonessential region
cos
12bp
cos
Exogenous DNA (~20-23 kb)
λ phage
• Viruses that can infect bacteria.
Blue-white selection
M13载体系列的优点
1.在这类载体的基因组中有一条饰变的β-半乳糖苷 酶基因片段（ HindⅢ 片段），其中插入了一段 具有密集的多克隆位点的序列； 2.M13载体系列是应用基因工程技术成对地构建的， 可有效地克隆双链DNA分子中的每一条链。
M13mp18
用于体外转录
四、柯斯(cosmid）质粒载体
polylinker
Ampr Cosmid Cos site
CoEⅠ ori
柯斯质粒载体
cosmid载体也称粘粒、柯斯载体。
这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的 cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。 cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及 λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后， 可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染 的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体， 而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。
柯斯质粒载体的特点
1. 2. 3. 4.
具有λ噬菌体的特性； 具有质粒载体的特性； 具有较高容量的克隆能 力； 具有与同源性序列的质 粒进行重组的能力
由于λ噬菌体包装时，当DNA 的长度短于野生型的78%或超过 105%时，噬菌体的活性就急剧 下降。因此只包装它的野生型 DNA（48.5KB）的75% ～ 105% 左右的ＤＮＡ，要求λ载体DNA 和外源DNA长度之和在39～53kb 之间。 插入式载体可携带的外源DNA 片段较替换式为小。
根据体外互补作用研究发现，λ噬菌体的头部 和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了 突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生 了突变的噬菌体则只能形成头部。 将这两种不同突变型的噬菌体的提取物混合起来，便能够在体外装配成 有生物活性的噬菌体颗粒。这就是噬菌体体外包装所依据的基本原理。
4. 存在着一个多克隆位点区，因此许多种不同类型的外源DNA片段，不 经修饰便可直接插入到载体分子上；
5. 由于多克隆位点区阻断了大肠杆菌lacZ基因的5’-端编码区，可按照 IPTG组织化学显色反应试验，筛选重组子；
6. lacZ基因是置于lac启 动子的控制之下，这样插 入的外源基因便会以融合 蛋白质的形式表达；
M13噬菌体的特点
1.感染Ecoli后，在 宿主细胞内会形成 双链的复制型DNA （ replication form DNA, RF DNA）。可以象质粒 DNA那样在体外进行 纯化和操作。
2.成熟的噬菌体颗粒仅 能感染E.coli的F+细胞， 这是因为这种噬菌体的 感染位点在性散毛上。 但是无论是RFDNA或 ssDNA都能转染E.coli 的F+或F-细胞。
1. 具有较小分子量的共价、闭合、环形的基因组DNA，可克隆10kb的外源 DNA片段，并易于进行分离与操作； 2. 编码一个ampr基因作为选择记号，因此只有携带pUC118或pUC119噬菌 粒载体的大肠杆菌转化子细胞，才能够在含有氨苄青霉素的培养基中 生长，便于转化子的选择； 3. 拷贝数含量高，每个 寄主可高达500个，所以 只要用少量的大肠杆菌 细胞培养物，便可制备 出大量的载体DNA；
Linear form
通过Cos末端互补单链形成环状 DNA 分子， 在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶作用下，形 成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。
λ噬菌体的基因组结构
已经定位的λ噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬 菌体生命周期的活动，我们称这类基因为λ噬菌体的必要基因；另一 部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能， 我们称这类基因为λ噬菌体的非必要的基因。
三、噬菌粒载体
由质粒载体和单链噬菌体 载体结合而成的新型的载体 系列。 它具有质粒的复制起点、 选择性标记、多克隆位点等， 方便DNA的操作，可在细胞内 稳定存在；又具有单链噬菌 体的复制起点，在辅助噬菌 体的存在下，可进行噬菌体 的繁殖，产生单链的子代噬 菌体。
常用的噬菌粒载体pUC118和pUC119
pBluescript 噬菌粒载体
基本结构： 1.在多克隆位点的两侧，有一对T3和T7噬菌体的启动子， 可以定向指导外源基因的转录活动； 2.同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来 自ColE1质粒的复制起点，在不同的情况下，可以采取 不同的复制形式，分别合成单链或Байду номын сангаас链的DNA； 3.编码有一个氨苄青霉素抗性基因，供作转化子记号； 4.含有lacZ基因，可用Xgal-IPTG组织显色反应法筛选噬 菌粒载体。
3.噬菌体颗粒的大小是受其DNA的 大小制约的，这一点正好与λ噬 菌体相反。所以M13噬菌体并不存 在包装限制的问题。
M13 life cycle
M13载体
具有多克隆位点(MCS)，方便克隆。许多M13载体的多克隆位 点与质粒载体pUC序列的多克隆位点是相同的，在克隆位点选择 上更为方便。 可以定向的克隆DNA片段，克隆在M13 RFDNA分子上的双链DNA 片段，到了子代噬菌体便成了单链的形式。所以如果要同时分 离ＤＮＡ分子中的双链，则需要两种独立的克隆。根据M13的生 物学特性知道，M13子代噬菌体中总是只含有（＋）链，所以 M13载体克隆的外源DNA片段在子代噬菌体中究竟是含有DNA分子 中的哪条链，则完全取决于外源DNA克隆时的取向。这样一来， 为分别分离外源DNA分子的两条链带来一定的麻烦，解决这一问 题的一个行之有效的方法就是定向克隆技术。