第四章 基因克隆载体1
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基因工程第四章载体
（4） 插入失活型质粒载体
载体的克隆位点位于其某一个选择性 标记基因内部。
如pDF41、pDF42、pBR329。
外源DNA
抗菌素抗性
无抗菌素抗性
（5）正选择的质粒载体 Direct selection vectors
直接选择转化后的细胞。
只有带有选择标记基因的转化菌细胞才 能在选择培养基上生长。
如pUR2、pTR262等。
目前通用的绝大部分质粒载体都是正 选择载体。
（6） 表达型质粒载体
主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。
注意启动子的性质，终止子、起始 密码、终止密码的阅读正确。
如果在大肠杆菌里表达，必须把所克隆的 真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻 译信号控制之下。
表达载体的结构
1）普通载体元件
b）细菌抗性原理 Ampr基因编码-内酰胺酶，特异地 切割氨苄青霉素的-内酰胺环。
ii）氯霉素（chloramphenicol，Cml）
a）抑菌原理 通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死 生长的细菌。
b）细菌抗性原理
Cmlr 编码乙酰转移酶，特异地使氯霉 素乙酰化而失活。
（2）长度 6.3 kb。
（3）选择标记
大肠杆菌素（colicin）E1和对E1免疫 的基因（immE1）
① colicin E1基因的结构
cea 结构基因
imm
kil
免疫基因 溶菌基因
② 杀死不含有ColE1细菌的原因 cea + kil基因产物
③ 不被其他细菌的colicin E1所杀死的原因 imm基因
① 双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞 在Amp或Tet中都死亡。
4第四章 基因克隆的载体-1质粒
2、具有合适的选择标记，便于重组DNA分子的检测； 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，便于外源基因 插入；
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
4、载体分子中有一段不影响它们扩增的非必须区域， 插入其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行 复制和扩增； 5、具有较好的安全性，不能任意转移，避免基因非控 制性扩增。
载体的种类和特征
（二）根据质粒自身传递的性质分为两大类： 1、结合型质粒：能自我复制，含转移基 因组，可自我控制质粒从一个寄主细胞传到 另一个寄主细胞。 如：F质粒，部分R质粒、Col质粒。 2、非结合型质粒：能自我复制，不含转 移基因组，不能自主在细胞间传递。 如：R质粒、Col质粒
（三）根据质粒的复制特性分为两大类： 1、严紧型质粒：是一类低拷贝数的质粒， 每个细胞中仅含有一个或几个质粒； 拷贝（数）是指一种质粒在一个寄主细 胞中存在的数目。 2、松弛型质粒：是高拷贝数的质粒， >20拷贝/细胞。该类基因工程中常用。
Example: a. 在pBR322质粒的BamHⅠ或SalⅠ位点 插入外源DNA片断，切断了tetr基因编码 序列的连续性，使之失去活性，产生出 AmprTets表型的重组pBR322质粒，转化 入AmpsTets的大肠杆菌细胞。先涂布在 含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出 具Ampr菌落，再将它们涂布于含四环素 的选择性培养基上。插入外源片断的重 组质粒不能在这种培养基上生长。
它的分子量为4363bp。克隆载体的大小不要超 过10kb。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的
选择记号。
共有24种核酸内切酶识别位点（单一的）。其中7种 内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，2种识 别位点在于这个基因的启动区内，所以9个限制酶 切位点插入外源片断可以导致Tetr 基因的失活； 另外有3种限制酶在氨苄青霉素抗性基因Ampr有单一 的识别位点，
第04讲 基因克隆的载体与受体
b）细菌抗性原理 Tetr 编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，阻止四环 素通过细胞膜进入细菌细胞内。
（2）抗菌素选择原理
不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基 （选择培养基）中生长。
当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生 长。
抗性基因
死
抗菌素
活
4. 人工构建的质粒载体的类型
呈超螺旋（SC）（super coil）
② 开环DNA（ open circular， ocDNA）
一条链上有一至数个缺口。
③ 线形DNA （ linear ，lDNA）
（5）质粒空间构型与电泳速率
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同： 超螺旋（sc)最快、线形（l ）次之、开环（oc）最慢。
原核表达载体的重要调控元件
1．启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成 的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动 子，基因就不能转录。 由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核 表达载体所用的启动子必须是原核启动子。 原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动 子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、 T7噬菌体启动子等。
2. 质粒载体必须具备的基本条件
（1） 具有复制起点（ORI） （2）具有抗菌素抗性基因 （3）若干限制性内切酶的单一位点： 用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。 （4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。 是筛选的标志。
3. 质粒的选择标记及其工作原理：
（1）选择标记 ① 抗菌素抗性 绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记： 氨苄青霉素抗性（Ampr） 卡那霉素抗性 （Kanr） 四环素抗性 （Tetr） 链霉素抗性 （Strr） 氯霉素抗性 （Cmlr）
基因克隆的载体
3.常用的质粒载体
第二节 噬菌体载体（phage vectors）
噬菌体的生物学特性 噬菌体载体构建 M13噬菌体的生物学特性
M13噬菌体载体
1. 噬菌体的生物学特性
溶菌周期(lytic cycle)：
噬菌体将DNA注入 寄主细胞后很快环 化，然后进行自我 复制、蛋白衣壳合 成和新噬菌体颗粒 的组装，最后使寄 主细胞破裂而释放 出大量的子代噬菌 体。
基因克隆的载体
引 言（introduction） 第一节 质粒载体（plasimid vectors） 第二节 噬菌体载体（phage vectors） 第三节 柯斯质粒载体（cosmid vectors） 第四节 人工染色体载体（B/Y/HAC）
引
一、基因克隆的本质
言
是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，
三个确保低拷贝质粒精确分
配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , ibrary）
将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的 片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入 相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，这些重组
cILytic cycle clear plaques
selecting recombinant phage via insertional inactivation of the cI gene
Replacement vectors(替换型载体)
4.M13噬菌体载体
（1）M13噬菌体增殖
或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’ 端分别加上几个C或G，成为粘性末端。
接上人工接头 粘性末端 末端转移%的mRNA时所需要的克隆数目。
N=
ln (1-p) ln:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的 n 比例 N：所需的重组载体数（克隆数）
基因克隆的载体 PPT课件
基因克隆的载体
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
载体（vector）是由在细胞中能 够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种 遗传成分，通过实验手段可使其它的 ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行 复制，作为基因工程的载体，必须具 备以下几个性能：
1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。
2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。
3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制
主要基因
非接合型质粒 自主复制基因，长生大肠杆菌素基因
按抗性记号分类 Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基因
R质粒(R因子)
自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段 F质粒（ F因子）
自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因 自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因 自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因
流程：
首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠 （SDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。
将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的 大肠杆菌裂解液中，EB会嵌入到DNA链 的碱基中去。
在EB达到饱和时，进行氯化铯密度 梯度离心。
2.碱变性法：
根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体 DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来 的。
酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。
4、有适合的标记，易于选择。
5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达， 并且尽可能是高效的表达。
6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于 在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。
载体
功能
克隆载体: 克隆一个基因或DNA片断
作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适 当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的 质粒载体。
第四章 基因克隆载体1
c) RF-DNA 以-DNA为模板不断合成+链DNA, 与特异性蛋白结合,组装成新的噬菌体颗粒. 释放到细胞外,而不破坏宿主细胞．
第四节 植物病毒载体
1.花椰菜花斑病病毒（Cauliflower Mosaic Virus,
CaMV)．
环状双链DNA病毒，由蚜虫以非持久方式或半持 久方式传播、感染十字花科和少数非十字花科植物
混合载体系统
将CaMV-DNA整合到Ti质粒DNA分子上,使新的载体 同时具有CaMV和Ti载体的特性. 通过根癌农杆菌 转移到植物细胞中.
特点: * 扩大了CaMV的正常宿主范围 * 避免了CaMV突变体之间的基因重组
第五节 动物病毒基因克隆载体
1.猿猴空泡病毒40（ Simian virus 40，SV40)
e)染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector） 基因整合平台系统；ＹＡＣ克隆载体
2.2 按克隆载体的用途分类
a)cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3， b)原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 c)原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）载
e）包装成新的反转录病毒颗粒. f）感染目的宿主细胞（动物细胞），外源基
因导入动物细胞.
3. 腺病毒克隆载体
腺病毒（adenovirus, Ad）是一类无囊膜的20面 体病毒，含有一个线性双链DNA分子。AdDNA两端具有逆向末端重复序列IRT．在每一 条单链DNA的5’端共价结合一种特殊结合蛋白 （5.5 kD）TP，当DNA从病毒颗粒中释放后， 通过该蛋白连接成环状．
* 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) 3) 构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) 4) 构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片
第四节 植物病毒载体
1.花椰菜花斑病病毒（Cauliflower Mosaic Virus,
CaMV)．
环状双链DNA病毒，由蚜虫以非持久方式或半持 久方式传播、感染十字花科和少数非十字花科植物
混合载体系统
将CaMV-DNA整合到Ti质粒DNA分子上,使新的载体 同时具有CaMV和Ti载体的特性. 通过根癌农杆菌 转移到植物细胞中.
特点: * 扩大了CaMV的正常宿主范围 * 避免了CaMV突变体之间的基因重组
第五节 动物病毒基因克隆载体
1.猿猴空泡病毒40（ Simian virus 40，SV40)
e)染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector） 基因整合平台系统；ＹＡＣ克隆载体
2.2 按克隆载体的用途分类
a)cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3， b)原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 c)原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）载
e）包装成新的反转录病毒颗粒. f）感染目的宿主细胞（动物细胞），外源基
因导入动物细胞.
3. 腺病毒克隆载体
腺病毒（adenovirus, Ad）是一类无囊膜的20面 体病毒，含有一个线性双链DNA分子。AdDNA两端具有逆向末端重复序列IRT．在每一 条单链DNA的5’端共价结合一种特殊结合蛋白 （5.5 kD）TP，当DNA从病毒颗粒中释放后， 通过该蛋白连接成环状．
* 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) 3) 构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) 4) 构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片
基因克隆载体
植物载体
安阳工学院 生物与食品工程学院
农杆菌
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性 细菌，它能在自然条件下感染大多数双子叶植 物和裸子植物的受伤部位 (受伤处的细胞会分 泌大量糖、氨基酸、酚等化合物,从而使农杆菌 移向这些细胞 )，并诱导产生冠瘿瘤或发状根 农杆菌转化法。
农杆菌含有Ti (Tumour including) 质粒。
农杆菌Ti质粒转化系统的优点
①利用天然的转化载体系统，成功率高 ②机理研究得最清楚，方法最成熟，应用也最 广泛 ③农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单 拷贝为多数，遗传稳定性好，多数符合孟德尔 遗传规律，为育种提供了中间选育材料 ④农杆菌Ti质粒转化系统操作比较容易，需要 的仪器设备简单，易于推广
Ti 质粒的结构
T-DNA区
能转移到植物细胞内的DNA片段 左右两侧20bp对转移不可缺少，中间部分可以 被替换。 T-DNA可以整合到染色体DNA上，随染色体 DNA的复制而复制。
Ti 质粒的结构
土壤农杆菌-植物DNA转移体系步骤
植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用
土壤农杆菌的毒性区基因被激活
T-DNA的切割和T复合物生成
T复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜 进入植物细胞 T-DNA整合到植物染色体上
Ti质粒载体
只要外源DNA组装到T-DNA上的特定位 点，就有可能转入植物细胞，达到转基 因的目的。 但是这种转基因的细胞，只能分裂不能 分化。
Ti质粒的构建
1. 删除 tms 和 tmr基因，恢复植物再生能力。
互补载体系统
由缺陷型CaMV-DNA分子(携带外源目的基因) 和辅助CaMV-DNA分子(携带缺陷型感染所需 的基因) 共同感染植物细胞并表达。
安阳工学院 生物与食品工程学院
农杆菌
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性 细菌，它能在自然条件下感染大多数双子叶植 物和裸子植物的受伤部位 (受伤处的细胞会分 泌大量糖、氨基酸、酚等化合物,从而使农杆菌 移向这些细胞 )，并诱导产生冠瘿瘤或发状根 农杆菌转化法。
农杆菌含有Ti (Tumour including) 质粒。
农杆菌Ti质粒转化系统的优点
①利用天然的转化载体系统，成功率高 ②机理研究得最清楚，方法最成熟，应用也最 广泛 ③农杆菌Ti质粒转化系统转化的外源基因以单 拷贝为多数，遗传稳定性好，多数符合孟德尔 遗传规律，为育种提供了中间选育材料 ④农杆菌Ti质粒转化系统操作比较容易，需要 的仪器设备简单，易于推广
Ti 质粒的结构
T-DNA区
能转移到植物细胞内的DNA片段 左右两侧20bp对转移不可缺少，中间部分可以 被替换。 T-DNA可以整合到染色体DNA上，随染色体 DNA的复制而复制。
Ti 质粒的结构
土壤农杆菌-植物DNA转移体系步骤
植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用
土壤农杆菌的毒性区基因被激活
T-DNA的切割和T复合物生成
T复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜 进入植物细胞 T-DNA整合到植物染色体上
Ti质粒载体
只要外源DNA组装到T-DNA上的特定位 点，就有可能转入植物细胞，达到转基 因的目的。 但是这种转基因的细胞，只能分裂不能 分化。
Ti质粒的构建
1. 删除 tms 和 tmr基因，恢复植物再生能力。
互补载体系统
由缺陷型CaMV-DNA分子(携带外源目的基因) 和辅助CaMV-DNA分子(携带缺陷型感染所需 的基因) 共同感染植物细胞并表达。
基因克隆载体名词解释
有关“基因克隆载体”的意思解释
有关“基因克隆载体”的意思解释如下：
基因克隆载体是指用来进行基因组克隆、cDNA克隆或亚克隆的DNA分子。
基因克隆载体能够承载外源DNA片段（目的基因）并将其带入受体细胞，帮助目的基因在受体细胞中稳定遗传和表达。
基因克隆载体的基本元件包括启动子、编码区和终止子等，这些元件能够控制基因的表达。
基因克隆载体通常具有松弛的复制子，能够带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。
除了基因克隆载体，还有一种表达载体，其除了具有基因克隆载体的基本元件外，还应具有转录/翻译所必需的DNA顺序，如转录因子、转录激活蛋白等，以实现目的基因的有效转录和翻译。
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E）抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr． F）产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）． G）降解基因：降解重金属、有机物和农药等．
H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒．
2 质粒载体的构建
2.1 质粒构建的基本要求
1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行 松弛型复制.
细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子 细胞外：超螺旋、开环，线形
双螺旋共价闭合 环（超螺旋）
开环双螺旋 （一个裂口）
线状双螺旋 （两个裂口）
质粒载体的特性
质粒DNA分子的大小: 细菌质粒的大小相差较大，小 的仅不足1kb，大的可达数百kb.
不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不同 的质粒不能存在于同一细胞中．
B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿 主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制．
C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同 一宿主细胞中．
D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移．
外源片段的整合及体外组装
2. Cosmid克隆载体
2.1 Cosmid载体的特点 a)兼有λ噬菌体和质粒载体的特点． 含有λ噬菌体Cos位点(可进行体外包装)和 细菌质粒载体的复制子(选择标记, 可在细 菌中保存和大量复制)． b)可插入大片段外源DNA．
e)染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector） 基因整合平台系统；ＹＡＣ克隆载体
2.2 按克隆载体的用途分类
a)cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3， b)原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 c)原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）载
染色体整合在一起． 3）在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合
的受体细胞染色体DNA一起复制． 4）外源基因能在受体细胞中表达． 5）克隆载体进入细胞后有可供选择标记
２ 克隆载体的分类
2.1 按构建克隆载体DNA的来源分类
a)质粒载体：大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体， 酵母质粒载体，农杆菌质粒载体，蓝细菌质粒载体
pET-28 系列融 合蛋白 表达载 体
6) 真 核 表 达 载 体
7)启动子活性分析载体pAc-GFP1-1
8）Ti质粒载体
1、T-DNA区：转移DNA，农杆菌侵染细胞时，从Ti质 粒上切割下来转移到植物细胞上的一段DNA
2、Vir区：毒区，激活T-DNA转移。与T-DNA区相邻， 共占Ti质粒DNA的1/3。
3、Con区：接合转移编码区，该区存在着与细菌间接 合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在 农杆菌之间的转移。
4、Ori区：复制起始区
3) 农杆菌Ti质粒载体的构建
双质粒系统介导外源基因整合的流程
第三节 噬菌体衍生的克隆载体
１ λ噬菌体克隆载体
１.1λ噬菌体的一般特性 λ噬菌体的组成
结构：外壳蛋白 DNA
可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新的 宿主细胞中．
复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制， 其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制， 质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列．
质粒上的相关基因
A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细 胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积 累到足以阻止质粒的复制．
第四章 基因克隆载体
第一节 基因克隆载体的特点与分类
1 基因克隆载体的含义及特点
含义：够把外源DNA片段带入受体细胞并进行稳定遗 传的DNA或RNA分子．
Foreign gene
MCS
Marker
基因克隆载体的特点
特点:1）具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点． 2）进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与
* 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) 3) 构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) 4) 构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片
段较大.
2.2 质粒构建的策略
1. 选择合适的出发质粒； 2. 正确获得构建质粒载体的元件； 3. 组装合适的选择标记基因； 4. 选择合适的启动子。
3 几种常见的质粒载体
１）pBR322：
2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始 点，部分缺失的Lac操纵子片段，并在Lac Z’区组
装了MCS．
3）pGEM-T TA克隆载体(promega Co.)
4）pGEX系列融合蛋白表达载体(Pharmacia Co.)
5）
b) λ基因组DNA上有多种限制酶识别位点． c) λ噬菌体包装DNA的大小为原λDNA长度的
75-105%( 38-54 kb)．
λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式
1.2 λ基因组DNA的结构
1.3 λ噬菌体载体构建的策略
a)去除部分限制酶识别位点 b)去除非必需区DNA J-N；P-Q c)插入可供选择的标记基因
体：pGEX-2T，pGEX-3X d)真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPV e)转录（Transcription）载体：pSL1190 f)普通载体（General vector）：pBR322，pUC18
第二节 质粒克隆载体
１ 质粒载体的一般特性
1）质粒的组成与构型
质 粒 (plasmid) 是 一种存在于宿主细 胞中染色体外裸露 的双链DNA分子．
b)噬菌体载体：双链DNA噬菌体载体λ；单链DNA噬菌 体载体，M13，T3，T7
c) 病 毒 载 体 ： 植 物 病 毒 载 体 CaMV （ 花 椰 菜 花 斑 病 病 毒）；动物病毒载体 SV40（猿猴空泡病毒）
d)质粒和噬菌体DNA兼有的载体：Phasmid 载体（含有 f1 噬菌体的ori）；Cosmid 载体（含有λDNA的Cos 区）
形态：头部 尾部
λ噬菌体的电子显微镜照片
λ基因组DNA的特点
a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp) 在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘 性末端(Cohesive end ),进入宿主细胞后, 粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)． 5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’
H) 致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒．
2 质粒载体的构建
2.1 质粒构建的基本要求
1）构建的质粒载体能转化受体细胞,并在其中进行 松弛型复制.
细胞内：超螺旋环状共价双链DNA分子 细胞外：超螺旋、开环，线形
双螺旋共价闭合 环（超螺旋）
开环双螺旋 （一个裂口）
线状双螺旋 （两个裂口）
质粒载体的特性
质粒DNA分子的大小: 细菌质粒的大小相差较大，小 的仅不足1kb，大的可达数百kb.
不相容性（Incompatible）：两种类似的但又不同 的质粒不能存在于同一细胞中．
B）Rep基因：在质粒的复制过程中，Replication基因会指令宿 主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制．
C）Inc基因：决定两种亲缘关系相近的两种质粒不能存在于同 一宿主细胞中．
D）Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛（Pilus）和细胞表面物， 促使宿主细胞与受体细胞表面结合，遗传物质的转移．
外源片段的整合及体外组装
2. Cosmid克隆载体
2.1 Cosmid载体的特点 a)兼有λ噬菌体和质粒载体的特点． 含有λ噬菌体Cos位点(可进行体外包装)和 细菌质粒载体的复制子(选择标记, 可在细 菌中保存和大量复制)． b)可插入大片段外源DNA．
e)染色体和质粒DNA兼有的载体（Chrosmid vector） 基因整合平台系统；ＹＡＣ克隆载体
2.2 按克隆载体的用途分类
a)cDNA克隆载体：λgt11，pT7T3， b)原核（Prokaryotic）表达载体：pKK223-3 c)原核基因融合（Prokaryotic gene fusion）载
染色体整合在一起． 3）在宿主细胞或受体细胞中自我复制或随整合
的受体细胞染色体DNA一起复制． 4）外源基因能在受体细胞中表达． 5）克隆载体进入细胞后有可供选择标记
２ 克隆载体的分类
2.1 按构建克隆载体DNA的来源分类
a)质粒载体：大肠杆菌质粒载体，枯草杆菌质粒载体， 酵母质粒载体，农杆菌质粒载体，蓝细菌质粒载体
pET-28 系列融 合蛋白 表达载 体
6) 真 核 表 达 载 体
7)启动子活性分析载体pAc-GFP1-1
8）Ti质粒载体
1、T-DNA区：转移DNA，农杆菌侵染细胞时，从Ti质 粒上切割下来转移到植物细胞上的一段DNA
2、Vir区：毒区，激活T-DNA转移。与T-DNA区相邻， 共占Ti质粒DNA的1/3。
3、Con区：接合转移编码区，该区存在着与细菌间接 合转移的有关基因（tra），调控Ti质粒在 农杆菌之间的转移。
4、Ori区：复制起始区
3) 农杆菌Ti质粒载体的构建
双质粒系统介导外源基因整合的流程
第三节 噬菌体衍生的克隆载体
１ λ噬菌体克隆载体
１.1λ噬菌体的一般特性 λ噬菌体的组成
结构：外壳蛋白 DNA
可转移性：质粒可通过接合作用等方式转移到新的 宿主细胞中．
复制性：质粒DNA分子只在宿主细胞内进行单向复制， 其复制受质粒本身和宿主细胞遗传系统的双重控制， 质粒提供复制的起始位点和核苷酸的序列．
质粒上的相关基因
A）COP因子：决定质粒的拷贝数，在质粒的复制过程中指令细 胞合成阻物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻物的量也积 累到足以阻止质粒的复制．
第四章 基因克隆载体
第一节 基因克隆载体的特点与分类
1 基因克隆载体的含义及特点
含义：够把外源DNA片段带入受体细胞并进行稳定遗 传的DNA或RNA分子．
Foreign gene
MCS
Marker
基因克隆载体的特点
特点:1）具备与外源DNA片段连接和重组的克隆位点． 2）进入受体细胞后能稳定存在于细胞质中或与
* 选择松弛型质粒复制起始子(Ori)
2) 构建的质粒载体含有克隆外源DNA的位点(MCS) 3) 构建的质粒载体含有选择标记基因(Apr,Tcr,Kmr) 4) 构建的质粒载体分子量小,转化效率高,插入外源片
段较大.
2.2 质粒构建的策略
1. 选择合适的出发质粒； 2. 正确获得构建质粒载体的元件； 3. 组装合适的选择标记基因； 4. 选择合适的启动子。
3 几种常见的质粒载体
１）pBR322：
2）pUC18-19：含有pBR322的Apr基因和复制的起始 点，部分缺失的Lac操纵子片段，并在Lac Z’区组
装了MCS．
3）pGEM-T TA克隆载体(promega Co.)
4）pGEX系列融合蛋白表达载体(Pharmacia Co.)
5）
b) λ基因组DNA上有多种限制酶识别位点． c) λ噬菌体包装DNA的大小为原λDNA长度的
75-105%( 38-54 kb)．
λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式
1.2 λ基因组DNA的结构
1.3 λ噬菌体载体构建的策略
a)去除部分限制酶识别位点 b)去除非必需区DNA J-N；P-Q c)插入可供选择的标记基因
体：pGEX-2T，pGEX-3X d)真核（Eukaryotic）表达载体：pSVK3，pBPV e)转录（Transcription）载体：pSL1190 f)普通载体（General vector）：pBR322，pUC18
第二节 质粒克隆载体
１ 质粒载体的一般特性
1）质粒的组成与构型
质 粒 (plasmid) 是 一种存在于宿主细 胞中染色体外裸露 的双链DNA分子．
b)噬菌体载体：双链DNA噬菌体载体λ；单链DNA噬菌 体载体，M13，T3，T7
c) 病 毒 载 体 ： 植 物 病 毒 载 体 CaMV （ 花 椰 菜 花 斑 病 病 毒）；动物病毒载体 SV40（猿猴空泡病毒）
d)质粒和噬菌体DNA兼有的载体：Phasmid 载体（含有 f1 噬菌体的ori）；Cosmid 载体（含有λDNA的Cos 区）
形态：头部 尾部
λ噬菌体的电子显微镜照片
λ基因组DNA的特点
a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp) 在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘 性末端(Cohesive end ),进入宿主细胞后, 粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)． 5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’