第四章、基因的分离与鉴定
生物必修一第四章知识点总结
生物必修一第四章知识点总结第四章生物的遗传与变异1. 遗传物质：DNA是生物遗传的基础，它携带了生物个体遗传信息。
2. DNA的结构：DNA是由核苷酸组成，核苷酸由糖、磷酸和碱基组成。
碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。
3. DNA的复制：DNA分子可以通过复制遗传信息传递给下一代。
复制过程是DNA解旋、互补复制和连接复制三个步骤的循环进行。
4. DNA的RNA转录：RNA是DNA的一条复制品，经过转录后产生的RNA称为信使RNA(mRNA)，它可以携带DNA信息到细胞质中，指导蛋白质的合成。
5. 蛋白质的合成：蛋白质由氨基酸组成，通过mRNA的指导，由核糖体在细胞质中合成。
蛋白质合成分为翻译和修饰两个过程。
6. 基因的表达调控：生物体内的基因可以在特定条件下被“开启”或“关闭”，从而控制基因的表达和蛋白质的合成。
7. 生物的遗传变异：遗传变异是生物进化和适应环境的基础。
遗传变异包括基因突变、染色体畸变和基因重组等。
8. 突变和突变率：突变是指遗传物质发生的突发性、不可逆转的基因变化。
突变率是指突变发生的频率。
9. 基因重组：基因重组是交换染色体上物种导致的遗传性状变化。
基因重组包括随机重组和非随机重组。
10. 染色体畸变：染色体畸变是指染色体结构发生异常的变化，包括染色体数目异常和染色体结构异常两种。
11. 遗传性状的分离和组合：生物的表型能够通过性状的分离和组合来体现不同基因的遗传。
12. 自交和杂交：自交是指同一个物种内不同个体之间进行交配，杂交是指不同物种之间进行交配。
13. 孟德尔的遗传规律：孟德尔通过对豌豆杂交的实验，揭示了基因的分离和组合规律，形成了遗传学的基础。
14. 基因型和表型：基因型是指个体所携带的基因的组合，表型是指基因型在外部表现出来的性状。
这些知识点是第四章的核心内容，通过对这些内容的学习，可以了解生物的遗传规律和遗传变异的原因，以及基因表达和遗传性状的相关机制。
苏教版高一生物必修二《基因的分离定律》评课稿
苏教版高一生物必修二《基因的分离定律》评课稿一、引言《基因的分离定律》是高中生物必修二课程中的重要内容，是遗传学中的基础概念之一。
本文将对苏教版高一生物必修二教材中关于《基因的分离定律》这一章节进行评课，从以下几个方面进行详细的分析和评价。
二、教材内容概述《基因的分离定律》是苏教版高一生物必修二教材中的第四章，主要内容涉及孟德尔定律、基因型与表现型、基因自由组合规律等。
通过学习这一章节，学生将了解到基因在遗传过程中的作用以及基因的分离和组合规律。
三、教学目标分析本章节的教学目标主要包括以下几个方面：1.掌握孟德尔定律的基本原理及其应用；2.理解基因型与表现型之间的关系；3.了解基因的自由组合规律以及交叉互换的作用。
通过达成这些教学目标，学生将能够建立起对遗传学基本概念的认知，并能够运用相关知识分析和解决遗传问题。
四、教学内容分析1. 孟德尔定律本章节首先介绍了孟德尔的实验和发现，通过对豌豆杂交实验的观察，学生将了解到孟德尔定律的基本原理，即一对互相对立的基因决定一个性状，分离遗传和独立遗传。
教材通过生动的实例和图表来解释这一定律，增强了学生的理解。
2. 基因型与表现型本章节进一步讲解了基因型与表现型之间的关系，探讨了显性基因和隐性基因、纯合子和杂合子的概念。
通过对哥德尔的实验的分析，学生将了解基因型和表现型之间的关系，并能够运用相关的遗传图谱进行分析和计算。
3. 基因自由组合规律本章节还介绍了基因的自由组合规律和交叉互换的作用。
通过对多个基因对的杂交实验的观察和分析，学生将了解到基因的自由组合和重新组合是遗传多样性的基础，从而进一步深化对基因的分离定律的理解。
五、教学方法探究针对本章节的教学内容，可以运用多种教学方法来增强学生的学习效果，具体包括：1.示范实验法：通过进行豌豆杂交实验的示范，让学生亲自参与实验过程，观察实验结果，深化对孟德尔定律的理解。
2.图解法：在教学过程中，使用图示来解释基因的分离定律，帮助学生更加直观地理解相关概念和原理。
4第四章遗传物质-基因和染色体
第四章遗传物质——基因和染色体第一节核被膜与核孔复合体细胞核的结构：在固定和染色的细胞中，可观察到细胞有下列结构：核被膜、染色质、核仁、核液（质）四部分。
一、核被膜（nuclear envelope）亦称核膜（nuclear membrane），由此使遗传物质DNA与细胞质分开。
电镜下证实为双层单位膜呈同心性排列。
除两膜之间有间隙外，膜上还有些特化结构。
所以，认为核被膜含义深刻，包括内容多，并执行重要的生理功能。
（一）核被膜结构1 外层核被膜（ONE）（外核膜）膜厚 6.5—7.5nm，相邻细胞质的一面常有核糖体附着，并有时与内质网（RER）相连，因此显得粗糙不平。
2 内层核被膜（INE）（内核膜）：膜厚度基本同ONE，膜上无核糖体附着，显得比ONE 平滑。
但在其内表面常附有酸性蛋白质分子的聚合物组成的纤维网状结构（密电子物质），称纤维层（fibrous Lamina）或核纤层（nuclear lamina），又有内致密层之称。
其厚度约在10—20nm（30—160nm），是位于细胞内核膜下的纤维蛋白或纤维蛋白网络。
3 核周隙（perinuclear space）又有核围腔或核围池之称。
指两膜之间的空隙，宽约20—40nm（10—50nm），内充满液态无定形物质（蛋白质、酶类、脂蛋白、分泌蛋白、组蛋白等），它是核质之间活跃的物质交换渠道（有些部位直接与ER或Golgi池相通）。
4 核孔（nuclear pore）核膜并不完全连续，在许多部位，核膜内外两层常彼此融合，形成环状孔道，称为核孔，它们是核质之间的重要通道。
（二）核被膜的主要功能核孔复合体可以看作是一种特殊的跨膜运输蛋白复合体，并且是一个双功能、双向性的亲水性核质交换通道。
双功能表现在它有两种运输方式：被动扩散与主动运输；双向性表现在既介导蛋白质的入核转运，又介导RNA、核糖核蛋白颗粒（RNP）的出核转运。
1、构成核、质之间的天然选择性屏障避免生命活动的彼此干扰，保护DNA不受细胞骨架运动所产生的机械力的损伤2、核质之间的物质交换与信息交流1）通过核孔复合体的被动扩散——小分子物质的转运：核孔复合体作为被动扩散的亲水通道，其有效直径为9～10nm，有的可达12.5nm，即离子、小分子（相对分子质量在60KD以下）以及直径在10nm以下的物质原则上可以自由通过。
第四章 目的基因的制取
第四章目的基因的制取内容提要•目的基因的制取策略•鸟枪法制取目的基因•物理化学法分离目的基因•化学合成基因•反转录合成DNA第一节目的基因制取的策略一、外源基因与目的基因基因工程主要是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而进行遗传研究或是获得表达产物。
通常我们把插入载体的DNA片段称为“外源基因”；将那些已被或准备要被分离、改造、扩增或表达的DNA片段称为“目的基因”。
原核细胞含有上千个基因，真核细胞基因组内的基因数目更是庞大。
目的基因一般都很小，都仅由几千或几百甚至更少的碱基对组成（人生长激素释放抑制因子的基因仅有42bp）。
要想获得某个特定的目的基因，必须对其性质、结构有所了解，根据其特点来制定分离方案。
二、目的基因制取的策略目的基因制取的策略可分为直接制取和间接制取。
一般来说，大部分低等生物基因组的碱基序列已测定，可以直接制取目的基因（确切定位）。
对于高等哺乳动物来说，目的基因在DNA上无法定位，只能间接制取。
获取目的基因的方法：1、直接制取法：以机械的方法或是限制性内切酶对总DNA进行切割，再直接分离特点位点的DNA分子。
2、逆转录法（互补cDNA法）：以RNA为模板，逆转录合成cDNA。
缺点是cDNA中不含天然基因的内含子。
3、PCR扩增法：对于含极微量mRNA的细胞大多采用PCR扩增，再进行目的基因的制取。
4、鸟枪法（散弹法）：可快速和高纯度地从单拷贝或多拷贝基因中筛选获得天然的目的基因。
5、人工化学合成法。
6、其它方法：mRNA差异显示法、限制性片段长度多态性探针技术等。
目前，真核基因，利用DNA合成仪合成目的基因的成本较高；利用cDNA文库获得目的基因需大量前期工作；直接以生物细胞染色体DNA为模板可获得目的基因，但模板的扩增会产生非特异性产物；一般通过构建完整的基因文库，再从文库中“钓取”出目的基因。
第二节鸟枪法制取目的基因一、“鸟枪法”的概念“鸟枪法”是指将基因组按染色体分开后，将它全部打乱，切成碎片，进行随机测序，测序后再将它们拼接起来的方法。
4.1生物成分的分离与测定技术(DNA的粗提取)
第1页第2页第四章 生物化学与分子生物学技术实践4.1生物成分的分离与测定技术（DNA 的粗提取）探究目的：1．说出DNA 的物理、化学性质。
2．概述DNA 粗提取和鉴定的原理。
3．尝试对动物或植物组织的DNA 进行粗提取。
探究预习：DNA 的提取是现代生物技术进行中药鉴别的最关键步骤。
总DNA 的有,效提取要求材料中的DNA 尽可能少的,降解。
不同的研究目的对DNA 的纯度,和量的要求不尽相同。
一、提取生物大分子的基本思路 1．基本思路：选用一定的_______方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
（物理或化学） 2．提取DNA 的方法(1)概念：利用DNA 与RNA 、______和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA ，去除其他成分。
（蛋白质）(2)原理：①分离：DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的___溶液中溶解度不同，利用这一特点选择适当的____就能使DNA 充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。
（NaCl 盐浓度 ） ②提纯：a ．DNA 不溶于__________，但是某些蛋白质则可溶于其中。
(酒精溶液) b ．蛋白酶能水解蛋白质，但是对_______没有影响。
(DNA) c ．大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温而发生变性，而DNA 在_____ 以上才会变性。
(80 ℃) d ．洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA 没有影响。
利用以上原理可以将DNA 与蛋白质进一步分离。
③鉴定：在沸水浴的条件下，DNA 被________染成蓝色。
(二苯胺)思考：为什么选用鸡血作实验材料？用哺乳动物的血作实验材料可以吗？【提示】 鸡血经济且易制得，鸡血红细胞、白细胞都具有细胞核，含大量DNA 。
哺乳动物的红细胞没有细胞核，DNA 含量较低，因而不宜作实验材料。
二、操作提示1．以血液为实验材料时，每100 mL 血液中需要加入3 g____________，防止血液凝固。
2022年第四章 目的基因的分离
三、DNA改组技术
DNA Shuffling
DNA改组 DNA洗牌 DNA搅乱重排
1994年，Stemmer等，用DNA Shuffling技术体外快速 进化蛋白——有性PCR法
1997年 ，France Aronld研究组将DNA Shuffling技术 做了改进——交错延伸法
DNA改组原理
因此,灵敏可靠的筛选方法是DNA改组技术成功与否的关键。 重叠延伸PCR技术流程 若突变频率太低，野生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到理想的突变体。 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,简称SOE PCR)由于采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链, 从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。 这主要通过有性PCR、交错延伸PCR完成。 在创造新基因的过程中,要设法产生各种变异。 体外诱变(in vitro mutagenesis)是指对克隆化基因进行诱变处理，改变其核苷酸序列，获得突变基因以用于研究基因结构与功能的技术。 (DNA shuffling) 第四节 基因突变与修饰 基因上的黑色区域为靶位点，NNN表示兼并引物或突变核苷酸 若突变频率太低，野生型将占据突变群体的优势，也很难筛选到理想的突变体。 定点诱变包括PCR介导的定点诱变和寡核苷酸传导的定点诱变，突变效率高，突变位点可以精确控制。 定点诱变包括PCR介导的定点诱变和寡核苷酸传导的定点诱变，突变效率高，突变位点可以精确控制。 ④DNA改组比随机突变显著提高了良性突变的概率。 延伸 反复重复2-4步后，可获得全长DNA片段
第四节 基因突变与修饰
体外诱变(in vitro mutagenesis)是指对克隆化基 因进行诱变处理，改变其核苷酸序列，获得突变 基因以用于研究基因结构与功能的技术。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
必修二第四章第一节 基因的分离定律
七 应用
1.指导杂交育种 指导杂交育种 ①隐性基因控制的优良性状 隐性基因控制的优良性状 例 小麦、水稻矮杆性状的选育(aa) 小麦、水稻矮杆性状的选育(aa) 矮杆性状的选育
F1 Aa
②显性基因控制的优良性状 显性基因控制的优良性状 例
×
AA
Aa
aa
小麦抗杆锈病性状的选育(AA) 小麦抗杆锈病性状的选育(AA) 抗杆锈病性状的选育
3.亲代基因型未肯定的情况下，求后代某一性状的发生概率 亲代基因型未肯定的情况下， 亲代基因型未肯定的情况下
确定亲代基因型及概率 设亲代为某种基因型才能出现所求性状
运用加法乘法原理求该性状发生的概率
例：
白化病是由常染色体上的隐性基因（ ）控制的遗传病， 白化病是由常染色体上的隐性基因（a）控制的遗传病，某家族的遗传系谱 图如下： 图如下： 1 2 3 4 正常男女 Aa aa A_ A_ A_ Aa 患病男女 5 aa 6 A_ 2/3 Aa AA 1/3 7 A_ Aa
概念
显性性状： 表现出来的亲本性状 显性性状：F1表现出来的亲本性状 隐形性状： 没有表现出来的那个亲本性状 隐形性状：F1没有表现出来的那个亲本性状 性状分离： 性状分离：杂种自交后代显性性状和隐性性状都表现出来的现象 显性基因：控制显性性状的基因， 显性基因：控制显性性状的基因，用大写字母表示 隐形基因：控制隐性性状的基因， 隐形基因：控制隐性性状的基因，用小写字母表示
基本概念
性状
相对性状
形态特征和生理特征 同种生物同种性状的不同表现类型 生物个体表现出来的性状 与生物个体表现型有关的基因组成 含相同基因的配子结合发育成的个体 含不同基因的配子结合发育成的个体
表现型
基因型 纯合体
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
(ⅱi). 将mRNA-DNA杂交分子转变为双链cDNA分子 用碱处理使mRNA模板水解掉，从而导致第一条cDNA链解
离；末端发夹结构作为第二条链合成的引物，用S1核酸酶切割 除去发夹结构
(ⅳ). 将合成的双链cDNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导 入大肠杆菌寄主细胞增殖
重组的方式：先用末端转移酶给双链cDNA分子加尾，或 将人工合成的衔接物加到双链cDNA分子的两端，而后再同经 适当处理而且有相应粘性末端的载体分子连接
(ⅱ) 合成第一条cDNA链
A. oligo(dT)引导的cDNA合成法 缺点：它必须从3ˊ-末端开始，反转录酶无法到达mRNA分 子5ˊ-末端
B. 随机引物引导的cDNA合成法 原理：根据许多可能的序列，合成出6-10bp的寡核苷酸短片 段混合物，作为合成第一条链cDNA的引物。在应用这种混 合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位 点同时发生，而不仅仅从3ˊ-末端的oligo(dT)引物一处开始
注：理论克隆数：供体生物的基因组DNA总量/克隆片段的平均大小 实际克隆数：按照Clarke-Carbon公式计算的
4.3.1 互补作用基因克隆
如果被克隆的DNA片段，同重组体DNA分子的寄主细胞的 染色体DNA是同源的，那么使用互补作用进行基因克隆，将是 一种十分有效的方法。
最简单的方式：将大肠杆菌DNA的克隆片段“库”，即一 组含有大肠杆菌基因组全部DNA序列结构的重组体DNA分子的 异源群体，导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株的受体细胞。然 后将此受体细胞涂布在一种缺少该菌株所需的底物的基本培养 基上。因此，只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体细胞 才能会长成转化子菌落。
♣ cDNA克隆的基本过程： 通过一系列的酶催化作用，使总poly(A) mRNA转变成双链
cDNA群体，并插入到适当的载体分子上，然后再转化到大肠 杆菌寄主菌株的细胞内
GGG
限制酶
末端转移酶 dGTP
GG
5ˊ
AAAAAA 3ˊ
Oligo(dT)引物
5ˊ
AAAAAA 3ˊ
反转录酶 TTTTT
NaOH降解mRNA链， DNA聚合酶I
4.3.3 应用mRNA差别显示技术分离克隆的目的基因
根据表达特性的差异可将高等真核生物的基因分为： 看家基因：以组成型表达模式维持细胞的基本代谢活动 发育调控基因：以时空特异性表达模式完成个体的正常的 生长、发育和分化。
真核生物基因总数为100 000个，在一定发育阶段只有15% 基因得以表达，产生出15 000种mRNA分子，其中相当一 部分属于发育调控基因，起左右全局的作用。
Pst I
pGGCC ACGTCCGG
GGCCTGCAGG CCGGACGTCCp
GGCCTGCA CCGGp
附加衔接物
HO
OH
5ˊ HO-GATCCCCGGG-OH HO p
p HO
OH p
3ˊ
HO-GGGCCC-P HO
OH
HO p
T4 DNA连接酶 ATP
HO HO
OH OH
多核苷酸激酶 ATP
■ 非互补或平末端DNA分子的连接： ♣ 附加衔接物（接头） ♣ 同聚物加尾
Pst I 衔接物
CCTGCAGG GGACGTCC
GGCC CCGG
T4多核苷酸激酶 ATP
pCCTGCAGG GGACGTCCp
Hae III
pCC GG
T4 DNA连接酶
GGCC CCGG
GG CCp
pCCTGCAGGCC GGACGTCCGG
SI核酸酶降解发夹结构
CCC
末端转移酶，dCTP CC以质粒为载体构建cDNA♣ cDNA构建的步骤
(i) 分离细胞总RNA，然后从中纯化出主要含mRNA的部分 纯化的原理及步骤： 一段仅由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸 [oligo(dT)],能够同惰性物质如纤维素(或琼脂糖)结合。当 细胞总RNA通过已经用[oligo(dT)]处理过的纤维素柱时， mRNA分子的poly(A)尾巴便会同[oligo(dT)]序列杂交而粘 附到柱子的填充物纤维素上，而其余的rRNA及tRNA分子 则流出柱子。先用100mM NaCl缓冲液广泛洗涤纤维素柱， 以清除全部污染的rRNA和tRNA分子，而后再用低离子强 度的10mM Tris- 1mM EDTA缓冲液洗涤。 mRNA分子占细胞总RNA的1%-2%
♣ cDNA克隆的优点
第一：cDNA克隆以mRNA为材料，这对于有些RNA病毒， 如流感病毒和呼肠孤病毒来说特别的适用。这些病毒的增 殖不经过DNA中间体，故cDNA克隆是DNA克隆都含有一种mRNA序列，故在选择 中出现假阳性的几率比较低
基因分离的方法： 应用核酸探针、差别杂交或扣除杂交、 mRNA差别显示技术、酵母双杂交体系
4.3.2 应用差别杂交和扣除杂交法分离目的基因
差别杂交(differential hybridization)
适用范围：分离在特定组织中表达的基因、在细胞周期特定 阶段表达的基因、受生长银子调节的基因、在特定发育阶段 表达的或是参与发育调节的基因，同时也用来分离经特殊处 理而被诱发表达的基因
1 23 456 7 8 9 12 3 4 5 6 7 8 9
4.2 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞
4.2.1 外源DNA片段同载体分子的重组
■ 考虑因素： ♣ 实验步骤要尽可能简单易行； ♣ “接点”能被一定的内切酶重新切割； ♣ 对转录和转译过程中密码子的阅读不发生干扰
■ 外源DNA片段定向插入载体分子：
4.3.2 cDNA基因克隆
♣ 为什么要进行cDNA基因克隆： 真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂度是蛋白质和
mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列 高等生物的基因数量一般在105左右，但在一定时间阶段
的单个细胞或个体中，都仅有15%左右的基因得以表达，产生 出约15 000种不同的mRNA分子
技术基础：不需要任何有关目的基因的核苷酸序列信息，只 要拥有两种不同的细胞群体：在一个细胞群体中目的基因正 常表达，而在另一个细胞群体中目的基因不表达
操作步骤：
制备两种不同的mRNA提取物：其一，含有一定比例的目的 基因mRNA种的总mRNA的总mRNA群体；其二，不含有目 的基因mRNA种的总mRNA群体。通过这两种总mRNA(或 是它们的cDNA拷贝)为探针进行平行杂交，对由表达目的基 因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选
制备poly(A) mRNA
加oligo(dT)32p-dNTPs 反转录酶，制备cDNA
cDNA
与λ载体重组 感染大肠杆菌 构建cDNA制备poly(A) mRNA
加oligo(dT)32p-dNTPs 反转录酶，制备cDNA
含目的基因的阳性克隆
差别杂交的局限性：
♣ 灵敏度低，特别是低丰度的mRNA ♣ 耗时耗力，费用高 ♣ 重复性差
扣除杂交：
除去那些普遍共同存在的、或是非诱发产生的cDNA 序列，从而使欲分离的目的基因的序列得到有效的 富集，提高了分离的敏感性
制备poly(A) mRNA
加oligo(dT) dNTPs 反转录酶，制备cDNA
杂交
制备poly(A) mRNA
羟基磷灰石柱
单链 cDNA 双链 cDNA
与λ载体重组，感染大肠杆菌构建cDNA2 ×106 (细菌) 理论 实际
400 1831
200
919
100 458
50 278
基因组的大小（bp）
2 ×107(真菌)
理论
实际
3 ×109(动物) 理论 实际
4000 2000 1000 500
18418 9208 4603 2300
600 000 2 763 110 300 000 1 381 550 150 000 690 774 75 000 345 386
■ 产生片段群体要求： ♣ 必须包容整个基因组的全部序列； ♣ 高纯度； ♣ 大小适合基因操作。
■ 产生片段群体方法： ♣ 机械切割（超声波；搅拌器高速搅拌） ♣ 限制性内切酶（单酶、双酶）
。
4.1.2 DNA片段的大小分布■ 构建完全基因： ♣ 不做特殊处理；或者脉冲电泳
■ 编码目的基因的克隆片段的富集： ♣ 琼脂糖凝胶电泳 ♣ 蔗糖梯度离心
p
OH
HO
p
同聚物加尾
4.2 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞
4.2.1 外源DNA片段同载体分子的重组
■ 最佳连接反应： ♣ 载体DNA和外源DNA之间的比例； ♣ DNA的总浓度；
低浓度的DNA(20μg/ml)，自连 高浓度的DNA(300~400μg/ml)，多连体分子
♣ 连接温度
4.2 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞
例子：从人类基因组DNA(3 ×106)，克隆β-珠蛋白基因(1.5 kb)
ln (1-0.99) N = ln [1- (1.5/3 ×106)] = 9隆片段 的平均大 小(bp)
5×103 10×103 20×103 40×103
第四：自身的特殊用途 克隆在细菌中表达的基因 和用作基因序列结构的测定
4.3.3基因组DNA克隆
4.4 克隆基因的分离
基因组测序
A. 耗资巨大，一般发展中国家(实验室)的财力难以承受 B. 基因组中的大部分序列并无重要的生物学功能 C. 一些具有理论研究和生产应用价值的基因，例如人类的疾
病控制基因，仅占基因组全序列的极少部分，按部就班的 测序不可能优先筛选出这类基因 D. 农业生产和医疗临床实践都迫切要求尽快分离到有关的重 要基因
第四章 基因的分离与鉴定
♣ 1. DNA克隆片段的产生与分离 ♣ 2. 重组体DNA分子的构建及导入受体细胞 ♣ 3. 基因克隆的实验方案