转基因植物的检测与鉴定
收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定宫雪超,于丽杰,高金秋(哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025)摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述.关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价[中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定.1外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法.1.1报告基因报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tÒ基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性.gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:¹适用于各种生物的基因转化;º检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;»便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;¼检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息.gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法.1.2转基因植株的PCR检测PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果.1.3Southern杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物.#15#利用Southern杂交,可以确定外源基因在植物中的组织结构和整合位置、拷贝数以及转基因植株F1世代外源基因的稳定性[8].分子杂交是进行核酸序列分析、重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段,它具有灵敏性高、特异性强的特点,是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法. Southern杂交可以清除操作过程中的污染以及转化愈伤组织中质粒残留所引起的假阳性信号,准确度高,但Southern杂交程序复杂,成本高,且对实验技术条件要求较高.根据杂交时所用的方法,核酸分子杂交又可分为印迹杂交(blo t)、斑点(do t)杂交或狭缝(slot)杂交和细胞原位(in situ)杂交等.现在已在水稻[9]、玉米、大白菜[10]、豆瓣菜[11]、马铃薯、杏、烟草等植物中得到广泛应用. 2外源基因转录水平的鉴定转录水平上的检测方法主要就是No rthern 杂交,它以RNA和探针杂交的技术检测基因在转录水平上的表达.2.1Northern杂交Northern杂交和Southern杂交相比,更接近性状表现,更具有现实意义,被广泛用于转基因植物的检测[12,13],现已用于杨树、豆瓣菜、马铃薯、草莓、烟草等转基因植物的检测中.但RNA 提取条件严格,在材料内含量不如DNA高,不适于大批量样品的检测.2.2RT-PCR检测RT-PCR(rev erse transcribed PCR)也是检测外源DNA在植物体内转录表达的一种方法.如果从细胞总RNA提取物中得到特异的cDNA 扩增条带,则表明外源基因实现了转录.此法简单、快速,但对外源基因转录的最后决定,还需与Northern杂交的实验结果结合.3外源基因表达蛋白的检测外源基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因工程的最终目的.3.1Western杂交Western杂交是集蛋白质电泳、印迹和免疫测定为一体的检测方法.它具有很高的灵敏性,可以从植物细胞总蛋白中检出50ng的特异蛋白质,若是提纯的蛋白质,可检出1~5ng.Western 杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果,可得知被检植物细胞内目的蛋白是否表达、表达的浓度大小及大致的分子量.能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录、翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现.一般来讲,Wester n杂交的结果与性状表现有直接关系[9,13].3.2ELISA检测ELISA(酶联免疫吸附法enzy me-linked im-m uno sor bent assay)是一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术.由于酶的放大作用,使测定的灵敏度极高,可检测出1pg的目的物,同时酶反应还具有很强的特异性.除了可溶性抗原(抗体)之外,ELISA还可以检测含表面抗原的细胞.该方法已用于辣椒、水稻、烟草、番茄[14,15]等转化植株的鉴定工作中.ELISA的检测虽然很灵敏,但容易出现本底过高的问题,应予以充分的注意.3.3蛋白检测试纸蛋白检测试纸是一种基于ELISA的改进方法Q uick Stix Strip或者Lateral Flow strip,用于转基因植物表达量的检测[16].先将特异性抗体吸附在膜上,将膜蘸入样品溶液,蛋白质随着液相扩散,遇到抗体,发生抗原-抗体反应,通过阴性对照筛选阳性结果,给出转基因成分含量的大致范围.此方法操作简单,费用低,耗时少(5~10m in).4原位杂交检测原位杂交技术目前在植物基因工程研究中已成为外源基因在染色体上整合定位及在组织细胞内表达定位的主要方法.原位杂交技术主要有同位素原位杂交和荧光原位杂交(FISH),使用放射性同位素标记,放射自显影检出.该方法灵敏性强,对于单拷贝的DNA序列检出非常有效.原位杂交可以分为三个层次:¹染色体DNA 原位杂交,可以确定外源基因在染色体上的整合位置及整合方式,还可以研究外源基因的整合方式对外源基因遗传稳定性、外源基因表达的影响,以及不同的转化方式与外源基因整合方式的关系等重大机理问题;º组织细胞mRNA原位杂交,对特定的基因表达的m RNA进行组织细胞分布的空间定位,获得外源基因在植物组织细胞内表达情况(是否表达,表达位置,表达量等);»外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位,指利用外源基因表达蛋白的抗体,通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布.该方法也是研究转基因植物中外源基因功能、外源蛋白稳定性及功能蛋白含量的重要手段.5检测方法的评估用DNA提取方法对目的基因进行检测方法简便,适合大批量样品的分析,又能检测目的基因的完整性,是早期检测的较好方法[17].Southern、N orthern、Western杂交分别从整合、转录、翻译水平检测外源基因,是检测外源基因最经典、最可靠的方法.虽然现在出现了一些像PCR-Southern、RT-PCR-Northern等功能类似、方便快捷的检测技术,然而由于其技术本身的原因,还不能取代以上技术在转基因植物检测和鉴# 16 #定上的权威地位.随着科学技术的发展,各种新的检测方法也在不断涌现,例如生物传感器筛选法、远红外线光谱法、定量PCR 、实时PCR 、基因芯片等.每种检测方法都有其自身的优点和不足,应该根据不同的检测目的和要求,选择合适的方法.在实际工作中把几种方法结合运用,可获得外源基因不同表达水平的信息,是准确检测转基因植物产品的合理策略.参考文献[1]Datta S.K.,A.Petew hans,K.Datta,e t,al.H erbicide -res istan ce rice plan ts from IRRI breedin g lin e IR72after PEG -mediated trans -form ation of protoplasts[J].Plant.M ol.Biol.1992,20:619.[2]S oryu ,N.Transformation of cucu mber plant usin g Agrobaeteriu m tarme faciens and regen eratinon from hypoceotyl exolants[J].PlantCell Report,1996,15:809-814.[3]Bryant J.,S.Leather.Rem oveal of selectable marker genes from transgenic plant:needless sophis tication or social neces sity[J ].Trends in Biotechn ology,1992,10:274-275.[4]王学聘,卞祖娴,张晋华,等.欧美杨转基因植物的PCR 检测[J ].林业科学.1997,33(4):380-384.[5]M organ A.J.,P.N.Cox ,D.A.T urner,et ,al .Transformation of tomoto u sing an R-i plas mid rector [J].Plant.s cien ce.1987,49:37-49.[6]朱新产.导入外源DNA 对小麦基因表达的影响[J].西北植物学报.1999,19(1):41-45.[7]刘建强,孙仲序,赵春芝.转基因植物鉴定方法的研究概况[J].山东林业科技.2002(5):39-45.[8]李乃坚,袁四清.卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响[J].广东农业学报.1998(4):13-15.[9]S himamoto,K.,R.Terada,T.Lzaw a,et,al .Fertile transg enic rice plants gen erated from transformed protoplas t[J ].Nature,1986,72:770-777.[10]毛慧珠,唐惕,曹湘玲,等.抗虫转基因甘蓝及其后代的研究[J].中国科学(辑).1996,26(4):339-347.[11]John D,Plant Gen etic T ransformation and Gen e Exp ress ion[M ].A Lab oratory M anual.Blackw ell S cien tific Pub lications OxfordLondon E dinburgh,1988.[12]M ik i,B.L.,bbe,J.H affori,e t,al .T rans formation of Brass ia hapu s canola Cu ltivars w ith Arabidopsis tbalian a acetohyacid syn -thase[J].Genes and nalysis of h erbiccide resisfan ce.T heor.APPL.Genet,1992,84:480-486.[13]Nelson,R.S.et al.Virus tolerance plant grouth anmd field perfamance of transgenic tomoto plants ex pres sing coat protein from to -mato mosaic virus[J ].Biotechn ology,1988(6):403-409.[14]J oarrne J.F.,J.Kiser,R.Ronold,ai.Eflicient tran sfer of a glyph os ate tolerance gene in to tomato using a binary Agrobacter-ium tume facien s Vector[J].Biotechnology,1987,5:726-730.[15]Nilogu ,E.T.M.Keith,S.N.Richard,et,al.Expression of affalfa mosaic Viruscoat protein gene confers cross protection in tran sgen -ic to bacco and tomato plant[J].The E M BO Journ al ,1987,6(5):1181-1188.[16]Lipton C.R.,Dautilick J.X.,Grothous G.D.,e t,al.Guidelines for the validation and u se of immu noas says for determining of int -rouduced proteins in biotechnology en han ced crops and derived food ingredien ts [J].Food Agric,Im mnunol,2000,12:153-164.[17]Vasil V.,A.M.Castillo,M.E.Fromm ,et al .H erbicide resis otant fertib e tran sgenic W heet plan t obtain ed by micro -projectile b om -bardmen t of regenerable embryonic callu s[J].Biotechnology,1992,3(12):667-674.编辑:琳莉收稿日期:2006-10-30基金项目:黑龙江发展高新技术产业专项资金(FG2003-21)无基质喷雾栽培法生产脱毒小薯的研究于洪涛(黑龙江省农业科学院绥化研究所,黑龙江绥化152000)摘 要:研究了无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不同品种、不同苗来源及不同收获方式对块茎产量的影响,结果表明:无基质喷雾栽培法生产马铃薯小薯以扦插苗分期收获效果最佳.无基质喷雾栽培比较适合栽培早熟品种,以早大白最佳.关键词:无基质;马铃薯;脱毒小薯[中图分类法]S532 [文献标识码]A [文章编号]1003-6180(2007)01-0017-02在马铃薯良种繁育体系中,原种的生产是关键环节,其质量的高低和数量的多少直接影响马铃薯的生产.无基质喷雾栽培法是一种极有前途的核心种薯生产方法,其主要技术是将适于马铃薯不同发育时期的营养液适时适量地喷于保持在黑暗状态下的马铃薯植株根际,使马铃薯根际获得充分的养分,促进马铃薯块茎的生长.马铃薯喷雾栽培技术在我国尚属起步阶段,提高其生产效率是生产实践中亟待解决的问题.为此,本试验对无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不#17#。
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏，有时会出现假阳性扩 增，因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
＊已获得专利许可
42
Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
43
外源基因去除（Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因，该基因在启动子的作用下，可根据科学家的 意愿，在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉，从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因，或将外来基因从 人们所需食用的部分（如植物的茎、叶、块茎） 彻底清除掉，达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的，从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
40
mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
41
marker-free转基因植株
• 共转化法＊(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法＊ • MAT(Multi-auto transformation)法＊ • 替代法＊
实验三 PCR-荧光探针法鉴定转基因大豆
实时荧光定量PCR Quantitative Real-Time PCR
（一）Real-time qPCR原理
实时定量PCR原理
• 实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR） 是指在PCR反应体系中加入荧光染料，实时监测 荧光染料 整个PCR过程中荧光信号的累积强度，并利用特定 数学原理对未知模板进行定量分析的方法。
基因组DNA分离纯化中的注意事项
保证基因组DNA的完整性和纯度 提高DNA的洗脱效率 DNA的储存
（二）转基因大豆鉴定 — CaMV35S基因核酸检测试剂盒杂交试剂盒
• 采用实时荧光PCR技术，针对CaMV35S基因核 酸序列设计特异性引物和荧光探针，通过实 时荧光PCR（Taqman探针法）对转基因成分 CaMV35S基因进行检测。
特异性高 多重PCR检出
要求反应的特异性 不能进行多重PCR
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
常用于SNP解析，病毒、病原菌检测
（三）Real-Time qPCR主要概念
非探针 扩增曲线
化学原理
实时定量PCR
两个重要图形
探针
熔解曲线
Real-Time qPCR曲线的意义
106 105 104 103 102 10
荧光强度---循环数曲线
初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线
三、实验内容
• 大豆DNA提取 • PCR-荧光探针法检测CaMV35S基因
四、实验材料和用品
大豆 大豆DNA提取试剂盒 CaMV35S基因核酸检测试剂盒 仪器：荧光定量PCR仪 台式离心机等
DePure Plant DNA Kit 基于硅胶 柱纯化方式。样品经液氮或研磨仪匀 浆后，在裂解液中裂解，DNA 释放到 裂解液中。经高盐溶液沉淀去除多糖 等杂质后，加入乙醇，转移至柱子中 过滤，DNA 被吸附到柱子的膜上，而 蛋白质则不被吸附而去除。柱子经 Buffer GW2 洗涤去除盐分，最后 DNA 经 Buffer AE洗脱。
植物转化及转基因的检测
复杂
复杂
简单
昂贵
昂贵
便宜
低
高
低
可行
广泛
广泛
Agrobacterium tumefaciens
Ti plasmid with the new gene
+
cell’s DNA
Agrobacterium
Plant cell
Transformation
The new gene
Tr2a0n20s/6g/20enic plant
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
vacuum chamber
Calli remain on the high osmotic media for 2020h2o0u/6r/s20 following shooting.
• 早衰
生长期缩短、早孕早穗等
• 对环境敏感
对水、肥、温度、光照敏感
Transformation is performed by gene gun meia prepare calli for transfomation
2020/6/20
福建省农业遗传工程重点实验室
DNA with desired gene and antibiotic resistance is coated onto the surface of gold particles.
借助标记基因和报告基因的快速筛选和纯合
抗生素抗性基因
新霉素磷酸转移酶基因（nptII）——Kanr，G418r
双氢叶酸脱氢酶基因 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)——hygr 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）——Cre
白菜转基因实验报告
一、实验背景随着科学技术的不断发展，转基因技术在农业领域的应用越来越广泛。
白菜作为我国重要的蔬菜作物之一，其转基因研究对于提高产量、改善品质、增强抗病性等方面具有重要意义。
本实验旨在通过农杆菌介导法将抗病毒基因导入白菜，探究转基因白菜在抗病毒性方面的表现。
二、实验材料与方法1. 实验材料- 白菜（Brassica rapa ssp. chinensis）：取材于本地种植的结球白菜。
- 农杆菌：选择含有Ti质粒的根癌农杆菌C58。
- 抗病毒基因：TuMV-NIa及LMV-CP。
- 植物激素：6-BA、NAA、AgNO3。
2. 实验方法1. 基因转化1.1 准备农杆菌：将根癌农杆菌C58在含有卡那霉素的YEB培养基中培养至对数生长期。
1.2 制备外植体：取白菜叶片，用70%酒精消毒后，用无菌水清洗3次，再将其切成小块。
1.3 共培养：将外植体与农杆菌混合，共培养于含有植物激素的培养基上，共培养时间为2-3天。
1.4 诱导再生：将共培养后的外植体转入含有植物激素的再生培养基中，诱导其再生。
1.5 抗性筛选：将再生植株转入含有抗生素的培养基中，筛选出阳性植株。
2. 分子鉴定2.1 PCR检测：提取转基因植株DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否存在。
2.2 Southern blot检测：将转基因植株DNA进行 Southern blot，检测目的基因是否整合到植物基因组中。
3. 抗病毒性检测3.1 人工接种：将转基因植株和对照植株分别接种TuMV和LMV病毒。
3.2 观察记录：观察记录植株发病情况，比较转基因植株和对照植株的抗病毒性。
三、实验结果1. 基因转化通过共培养和诱导再生，成功获得转基因白菜植株。
2. 分子鉴定PCR和Southern blot检测结果均显示，目的基因已成功导入白菜基因组中。
3. 抗病毒性检测与对照植株相比，转基因植株在接种TuMV和LMV病毒后，发病率明显降低，表现出较强的抗病毒性。
转基因玉米最简单的辨别方法
转基因玉米最简单的辨别方法什么是转基因玉米？转基因玉米是经过基因工程技术改变了其基因组的玉米品种。
通过引入外源基因，转基因玉米可以表现出与传统玉米不同的特点。
转基因技术的引入旨在改善玉米的耐虫性、耐草药性、抗病性等，以增加产量和改善农作物的质量。
转基因玉米的辨别方法由于转基因玉米与传统玉米的性状非常相似，传统的肉眼观察往往无法直接区分。
然而，科学家们通过不断的研究和发展，已经开发出一些有效的方法来鉴定转基因玉米。
以下是一些可以用于辨别转基因玉米的简单方法。
DNA检测方法通过检测玉米中的DNA序列，可以准确地判断玉米是否为转基因品种。
以下是一些常用的DNA检测方法：1.PCR（聚合酶链反应）：PCR是一种扩增DNA序列的技术，可以通过特定引物扩增转基因DNA的片段。
通过检测扩增产物的大小和特征，可以判断玉米是否为转基因品种。
2.实时荧光PCR：实时荧光PCR结合了PCR技术和荧光检测技术，可以在扩增过程中实时监测DNA的数量和特征。
通过比较样本和参考样品的荧光信号，可以判断玉米是否为转基因品种。
3.基因芯片技术：基因芯片技术利用微阵列芯片上固定的DNA探针，可以同时检测多个基因。
通过比较样本和参考样品的信号强度和特征，可以判断玉米是否为转基因品种。
蛋白质检测方法转基因玉米通常会在其基因组中表达外源基因，并产生相应的蛋白质。
通过检测玉米中的特定蛋白质，可以判断玉米是否为转基因品种。
以下是一些常用的蛋白质检测方法：1.ELISA（酶联免疫吸附试验）：ELISA是一种常用的免疫检测方法，可以通过特定的抗体检测目标蛋白质。
通过比较样本和参考样品的吸光度值，可以判断玉米是否含有转基因蛋白质。
2.质谱法：质谱法是一种分析样品中蛋白质的方法，通过测量蛋白质的质量和带电量，可以确定蛋白质的特征。
通过比较样品和参考样品的质谱图谱，可以判断玉米是否含有转基因蛋白质。
生理学和形态学特征除了分子方法外，还可以通过观察玉米的生理学和形态学特征来推测其是否为转基因品种。
转基因植物的筛选与检测
8
• Western 印迹是将蛋白质从 SDS-PAGE胶 中电泳转移至固相支持体上 , 然后对固定化 蛋白质进行免疫学测定的方法。 • 特点：
1
一、筛选的方法与原理
• 通过特定基因在转化体内的表达，利用特 定的试剂，选择出来转化细胞。
• 注： 1.特定基因又称“抗性基因” 2.表达方式：蛋白质的合成、酶的失活等
表“植物遗传转化中的选择试剂及其抗性基因”
2
3
二、检测的方法与原理
• 利用特定基因在转化体内的表达，对其表 达产物进行检测。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 ，染色后很容易观察， 不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺 序。材料用量少，检测方便，可以在试管苗阶段， 甚至对愈伤组织进行检测，了解转化早期的信息， 便于及时优化试验方案。DNA提取方便，适合于 大批量样品分析，又能检测目的基因的完整性， 是早期检测的一种较好方法。
• 注意： • 此过程最重要的是保持各DNA片段的转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素 膜（NC膜）、尼龙膜（Nylon） 、化学活化膜和 滤纸等。
13
Western
• • • • • • 1.制胶及上样 2.电泳 3.转膜 4.封闭 5.抗体孵育 6.曝光显影
10
Southern杂交
• • • • • • • 1.提取DNA 2.电泳 3.变性 转移 DNA 印迹 4.转膜 5.固定DNA 6.探针的标记 7.杂交与检测（NBT/BCIP显色）
膜
11
简述转基因动植物的检测鉴定方法
简述转基因动植物的检测鉴定方法
一、转基因检测鉴定方法
1、理化检测法
（1）流式细胞术：利用流式细胞术技术，检测转基因植物DNA 核酸的含量，即采用荧光染料标记的 DNA 膜，以流速技术，测定和对比转基因动植物与其他植物的 DNA 含量。
（2）蛋白质印迹：利用蛋白质印迹法，它可以对植物蛋白质分子进行快速和准确的检测，包括转基因植物中特异性抗性蛋白。
2、分子生物学技术
（1）PCR 技术：通过荧光定量 PCR 技术，可实现对单个核酸分子的高灵敏度检测，其是转基因植物检测的常用技术。
（2） Southern 胺基酸印迹：利用 Southern 胺基酸印迹法，检测基因的等位基因进行检测和分析，如同位素标记 PCR，可以有效鉴定和分析转基因植物种群中不同基因的表达量及突变情况。
3、其他技术
（1）生物分子识别：通过生物分子识别，可以有效地检测出转基因植物特有的 DNA 序列，从而对转基因植物进行鉴定。
（2）生物免疫技术：利用生物免疫技术，可以以免疫试剂盒的形式，对转基因植物进行快速检测，从而达到鉴定的目的。
- 1 -。
鉴定转基因是否成功的方法
鉴定转基因是否成功的方法
转基因是一种重要的遗传工程技术，可以将外源基因导入到生物体内，从而改变其性状和功能。
但是，如何鉴定转基因是否成功呢？下面介绍几种方法。
1. PCR扩增法。
PCR是一种可以扩增DNA序列的技术，可以通过PCR扩增转基因序列和内部参考序列，然后对扩增产物进行电泳，观察是否存在目标大小的DNA条带，从而证明是否成功转基因。
2. Southern blotting。
Southern blotting是一种检测DNA序列的方法，可以将DNA片段转移到膜上，然后使用探针特异性检测转基因序列的存在。
3. Northern blotting。
与Southern blotting类似，但是是用来检测RNA序列的方法，可以检测目标RNA是否被表达。
4. Western blotting。
Western blotting是一种检测蛋白质的方法，可以检测目标蛋白质是否被表达。
5. 生理表型。
转基因生物的表型通常会发生明显的变化，如植物的生长速度、耐旱能力、抗病性等。
通过观察生理表型的变化，也可以鉴定转基因是否成功。
综上所述，以上方法可以用来鉴定转基因是否成功，研究人员可以根据需要选择合适的方法。
- 1 -。
转基因植物的检测与鉴定
转基因植物的检测与鉴定宫雪超于丽杰高金秋哈尔滨师范大学环境与生命科学院黑龙江哈尔滨摘要对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围转基因植物的检测和鉴定方法转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述关键词转基因植物检测鉴定评价中图分类法文献标识码文章编号植物转基因实验因受体系统的限制外源基因的转化频率较低为了达到转化目的必然要获得大量的转化材料如何在数以千万计的转化植株或细胞中快速有效地检测出转基因阳性植株或细胞外源基因是否整合到植物染色体上整合的方式如何整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题就成为重要的研究课题根据外源基因表达的不同水平对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行整合水平转录水平和翻译水平本文从外源基因表达的不同水平阐述转基因植物的检测与鉴定外源基因整合水平的鉴定检测外源基因是否转化成功首先是对报告基因进行检测必要时再进行目的基因的检测检测目的基因需要采用分子杂交方法报告基因报告基因必须具有两大特点一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在二是便于检测目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因大致分为两类抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因现在常用的报告基因主要有基因基因冠瘿碱合成酶基因H基因基因基因荧光素酶基因二氢叶酸还原酶基因等近年来绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用并显示出较其他几个报告基因更大的优越性基因的检测基因具有以下优点①适用于各种生物的基因转化②检测方法简便无需底物酶辅因子等物质只要有紫外光或蓝光照射其表达产物就可以发出绿色荧光这对转化细胞的检测极为有利③便于活体检测十分有利于活体内基因表达调控的研究④检测时可获得直观信息有利于转基因植物安全性问题的研究及防范若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时很容易通过光照获得直观信息基因的检测基因也是广泛用作转基因植物细菌和真菌的报告基因尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中基因应用的最多基因端与其他结构形成的融合基因能正常表达所产生的融合蛋白仍具有活性这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件这是它的一大优点但是需要注意的是有一些植物在胚胎状态时能产生内源活性在转基因和代的子叶花粉和胚珠中检测到活性随着组织的成熟衰老表达逐渐停止在实验过程中要设定严格的阴性对照活性的检测方法有很多包括组织化学法色谱法荧光法等其中植物切片组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法转基因植株的检测聚合酶链式反应是首选的转基因产品检测方法技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段可以检测到每克样品含有～的转化基因成分对转基因产品大分子量检测的灵敏度可以达到样品含量的因为的高度特异性及检测所需的模板量仅为以内所以为外源基因整合的检测提供了便利条件尤其是在转化材料少又需及早检测的时候现在已经利用该技术对欧美杨番茄辣椒葡萄豆瓣菜小麦等转基因植物进行鉴定是转基因植物鉴定中最简单最常用的方法检测具有用量少操作简单成本低耗时少不需要同位素等优点但检测也存在缺点由于扩增十分灵敏有时会出现假阳性扩增因此检测只能作为初步结果杂交证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是杂交只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物年第期牡丹江师范学院学报自然科学版总第期收稿日期利用杂交~可以确定外源基因在植物中的组织结构和整合位置~拷贝数以及转基因植株世代外源基因的稳定性]分子杂交是进行核酸序列分析~重组子鉴定及检测外源基因整合表达的强有力手段~它具有灵敏性高~特异性强的特点~是当前鉴定外源基因整合及表达的权威方法杂交可以清除操作过程中的污染以及转化愈伤组织中质粒残留所引起的假阳性信号~准确度高~但杂交程序复杂~成本高~且对实验技术条件要求较高根据杂交时所用的方法~核酸分子杂交又可分为印迹杂交<>~斑点<>杂交或狭缝<>杂交和细胞原位<>杂交等现在已在水稻]~玉米~大白菜]~豆瓣菜]~马铃薯~杏~烟草等植物中得到广泛应用外源基因转录水平的鉴定转录水平上的检测方法主要就是杂交~它以和探针杂交的技术检测基因在转录水平上的表达杂交杂交和杂交相比~更接近性状表现~更具有现实意义~被广泛用于转基因植物的检测~]~现已用于杨树~豆瓣菜~马铃薯~草莓~烟草等转基因植物的检测中但提取条件严格~在材料内含量不如高~不适于大批量样品的检测检测<>也是检测外源在植物体内转录表达的一种方法如果从细胞总提取物中得到特异的扩增条带~则表明外源基因实现了转录此法简单~快速~但对外源基因转录的最后决定~还需与杂交的实验结果结合外源基因表达蛋白的检测外源基因编码的蛋白在转基因植物中能够正常表达并表现出应有的功能是植物基因工程的最终目的杂交杂交是集蛋白质电泳~印迹和免疫测定为一体的检测方法它具有很高的灵敏性~可以从植物细胞总蛋白中检出的特异蛋白质~若是提纯的蛋白质~可检出～杂交检测目的基因在翻译水平的表达结果~可得知被检植物细胞内目的蛋白是否表达~表达的浓度大小及大致的分子量能直接显示目的基因在转化体中是否经过转录~翻译最终合成蛋白而影响植株的性状表现一般来讲~杂交的结果与性状表现有直接关系~]检测<酶联免疫吸附法>是一种利用免疫学原理检测抗原~抗体的技术由于酶的放大作用~使测定的灵敏度极高~可检测出的目的物~同时酶反应还具有很强的特异性除了可溶性抗原<抗体>之外~还可以检测含表面抗原的细胞该方法已用于辣椒~水稻~烟草~番茄~]等转化植株的鉴定工作中的检测虽然很灵敏~但容易出现本底过高的问题~应予以充分的注意蛋白检测试纸蛋白检测试纸是一种基于的改进方法或者~用于转基因植物表达量的检测]先将特异性抗体吸附在膜上~将膜蘸入样品溶液~蛋白质随着液相扩散~遇到抗体~发生抗原抗体反应~通过阴性对照筛选阳性结果~给出转基因成分含量的大致范围此方法操作简单~费用低~耗时少<～>原位杂交检测原位杂交技术目前在植物基因工程研究中已成为外源基因在染色体上整合定位及在组织细胞内表达定位的主要方法原位杂交技术主要有同位素原位杂交和荧光原位杂交<>~使用放射性同位素标记~放射自显影检出该方法灵敏性强~对于单拷贝的序列检出非常有效原位杂交可以分为三个层次:①染色体原位杂交~可以确定外源基因在染色体上的整合位置及整合方式~还可以研究外源基因的整合方式对外源基因遗传稳定性~外源基因表达的影响~以及不同的转化方式与外源基因整合方式的关系等重大机理问题;②组织细胞原位杂交~对特定的基因表达的进行组织细胞分布的空间定位~获得外源基因在植物组织细胞内表达情况<是否表达~表达位置~表达量等>;③外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位~指利用外源基因表达蛋白的抗体~通过免疫反应确定表达蛋白在转基因植物组织及细胞中的分布该方法也是研究转基因植物中外源基因功能~外源蛋白稳定性及功能蛋白含量的重要手段检测方法的评估用提取方法对目的基因进行检测方法简便~适合大批量样品的分析~又能检测目的基因的完整性~是早期检测的较好方法]~~杂交分别从整合~转录~翻译水平检测外源基因~是检测外源基因最经典~最可靠的方法虽然现在出现了一些像~等功能类似~方便快捷的检测技术~然而由于其技术本身的原因~还不能取代以上技术在转基因植物检测和鉴年第期牡丹江师范学院学报!自然科学版"# !总第期"定上的权威地位随着科学技术的发展 各种新的检测方法也在不断涌现 例如生物传感器筛选法 远红外线光谱法 定量 实时基因芯片等 每种检测方法都有其自身的优点和不足 应该根据不同的检测目的和要求 选择合适的方法 在实际工作中把几种方法结合运用 可获得外源基因不同表达水平的信息 是准确检测转基因植物产品的合理策略参考文献王学聘 卞祖娴 张晋华 等 欧美杨转基因植物的 检测 林业科学 朱新产 导入外源 对小麦基因表达的影响 西北植物学报 刘建强 孙仲序 赵春芝 转基因植物鉴定方法的研究概况 山东林业科技 李乃坚 袁四清 卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响 广东农业学报毛慧珠 唐惕 曹湘玲 等 抗虫转基因甘蓝及其后代的研究 中国科学 辑编辑 琳莉收稿日期 基金项目 黑龙江发展高新技术产业专项资金无基质喷雾栽培法生产脱毒小薯的研究于洪涛黑龙江省农业科学院绥化研究所 黑龙江绥化摘要 研究了无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不同品种 不同苗来源及不同收获方式对块茎产量的影响 结果表明 无基质喷雾栽培法生产马铃薯小薯以扦插苗分期收获效果最佳 无基质喷雾栽培比较适合栽培早熟品种以早大白最佳 关键词 无基质 马铃薯 脱毒小薯 中图分类法 文献标识码 文章编号在马铃薯良种繁育体系中 原种的生产是关键环节 其质量的高低和数量的多少直接影响马铃薯的生产 无基质喷雾栽培法是一种极有前途的核心种薯生产方法 其主要技术是将适于马铃薯不同发育时期的营养液适时适量地喷于保持在黑暗状态下的马铃薯植株根际 使马铃薯根际获得充分的养分 促进马铃薯块茎的生长 马铃薯喷雾栽培技术在我国尚属起步阶段 提高其生产效率是生产实践中亟待解决的问题 为此 本试验对无基质喷雾栽培法生产马铃薯脱毒小薯过程中不年第 期牡丹江师范学院学报 自然科学版总第 期转基因植物的检测与鉴定作者：宫雪超， 于丽杰， 高金秋， GONG Xuechao， YU Lijie， GAO Jinqiu作者单位：哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江,哈尔滨,150025刊名：牡丹江师范学院学报（自然科学版）英文刊名：JOURNAL OF MUDANJING TEACHERS' COLLEGE(NATURAL SCIENCES EDITION)年，卷(期)：2007(1)被引用次数：3次1.Datta S K;A Petew hans;K Datta Herbicide-resistance rice plants from IRRI breeding line IR72 after PEG-mediated transformation of protoplasts 19922.Soryu N Transformation of cucumber plant using Agrobaeterium tarme faciens and regeneratinon from hypoceotyl exolants[外文期刊] 1996(11)3.Bryant J;S Leather Removeal of selectable marker genes from transgenic plant:needless sophistication or social necessity 19924.王学聘;卞祖娴;张晋华欧美杨转基因植物的PCR检测 1997(04)5.Morgan A J;P N Cox;D A Turner Transformation of tomoto using an Ri-plasmid rector 19876.朱新产导入外源DNA对小麦基因表达的影响[期刊论文]-西北植物学报 1999(01)7.刘建强;孙仲序;赵春芝转基因植物鉴定方法的研究概况[期刊论文]-山东林业科技 2002(05)8.李乃坚;袁四清卡那霉素胁迫对转基因烟草种子发芽的影响 1998(04)9.Shimamoto K;R Terada;T Lzawa Fertile transgenic rice plants generated from transformed protoplast 198610.毛慧珠;唐惕;曹湘玲抗虫转基因甘蓝及其后代的研究 1996(04)11.John D Plant Genetic Transformation and Gene Expression 198812.Miki B L;H Labbe;J Haffori Transformation of Brassia hapus canola Cultivars with Arabidopsis tbaliana acetohyacid synthase Genes and nalysis of herbiccide resisfance 199213.Nelson R S Virus tolerance plant grouth anmd field perfamance of transgenic tomoto plants expressing coat protein from tomato mosaic virus 1988(06)14.Joarrne J F;J Kiser;R Ronold;ai Eflicient transfer of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tume faciens Vector 198715.Nilogu E T;M Keith;S N Richard Expression of affalfa mosaic Viruscoat protein gene confers cross protection in transgenic to bacco and tomato plant 1987(05)16.Lipton C R;Dautilick J X;Grothous G D Guidelines for the validation and use of immunoas says for determining of int-rouduced proteins in biotechnology enhanced crops and derived food ingredients 200017.Vasil V;A M Castillo;M E Fromm Herbicide resisotant fertibe transgenic Wheet plant obtained by micro-projectile bombardment of regenerable embryonic callus 1992(12)1.谢为龙.陈其文.喻国泉.李冠雄.乐海洋.谭群英.廖力转基因植物快速检测方法的研究[期刊论文]-生物技术通报2002(4)2.武海斌.孙红炜.杨崇良.李宝笃.路兴波.WU Hai-bin.SUN Hong-wei.YANG Chong-liang.LI Bao-du.LU Xing-bo转基因植物检测技术研究[期刊论文]-河北农业科学2008,12(7)3.贾月梅转基因植物检测技术的发展[期刊论文]-世界农业2007(6)4.贺熙勇.陈善春.彭爱红.HE Xi-yong.CHEN Shan-chun.PENG Ai-hong转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展[期刊论文]-热带农业科技2008,31(1)5.张莹.张永军.吴孔明.赵奎军.彭于发.郭予元.Zhang Ying.Zhang Yongjun.Wu Kongming.Zhao Kuijun.Peng Yufa.Guo Yuyuan转基因植物的检测策略和检测技术[期刊论文]-植物保护2007,33(1)6.马强.徐勤青.李栋转基因植物检测方法的研究与进展[期刊论文]-种子科技2009,27(4)7.刘信.宋贵文.沈平.厉建萌.Liu Xin.Song Guiwen.Shen Ping.Li Jianmeng国外转基因植物检测技术及其标准化研究综述[期刊论文]-农业科技管理2007,26(4)8.刘建强.孙仲序.赵春芝转基因植物鉴定方法的研究概况[期刊论文]-山东林业科技2002(5)9.芦春斌.Lu Chunbin转基因植物(农产品)中转基因成分的PCR检测[期刊论文]-种子2006,25(1)10.黄亚东.赵文.李校堃.苏志坚.吴春利.何健凡.房师松.HUANG Ya-dong.ZHAO Wen.LI Xiao-Kun.SU Zhi-jian .WU Chun-li.HE Jian-Fan.FANG Shi-Song利用放射免疫技术快速检测转基因植物[期刊论文]-农业生物技术学报2005,13(3)1.王莹.任大明盐芥T-DNA插入突变体库的建立及初步分析[期刊论文]-湖北农业科学 2011(4)2.刘松瑜.谢深喜.陶爱群.周亚洲.周力.沈程清农杆菌介导的果树转基因研究进展[期刊论文]-中国农学通报2009(9)3.王文文.孟艳玲.宗晓娟.王甲威.魏海蓉.崔海金.刘庆忠核果类果树遗传转化及检测技术研究进展[期刊论文] -山东农业科学 2013(4)引用本文格式：宫雪超.于丽杰.高金秋.GONG Xuechao.YU Lijie.GAO Jinqiu转基因植物的检测与鉴定[期刊论文]-牡丹江师范学院学报（自然科学版） 2007(1)。
鉴定转基因是否成功的方法
鉴定转基因是否成功的方法随着生物技术的发展，转基因技术逐渐成为一种有效的方法，应用在农业、医药、生物制药等领域。
转基因技术通过人工改变生物基因，进而创造出新品种或个体。
在转基因工程中，鉴定转基因是否成功是极其重要的。
本文将从多种角度介绍鉴定转基因是否成功的方法。
一、利用PCR技术确认转基因是否成功PCR反应是鉴定转基因是否成功最为简便和经济的方法之一，这种技术是利用酶切扩增DNA的特点，在反应中对改造的基因进行检测，在特定的条件下扩增目的基因片段，并与未转基因进行比较。
如果扩增所得的基因片段与转基因所期望的片段大小一致，说明转基因已经成功。
二、Southern blotting 鉴定转基因Southern blotting是一种DNA测定技术，通过将RNA 转换为DNA并进行胶体电泳将目标DNA片段从细胞中分离并检测目标片段。
Southern blotting 可以检测到基因定位，基因拷贝和突变，改变DNA构型和次级结构。
Southern blotting的结果可以表明：在细胞内是否存在谷氨酸脱羧酶基因等转基因相关的基因组位置。
三、利用生物学筛选法进行鉴定利用生物学筛选法可以鉴定出转基因是否成功，它们往往是通过化学诱变法，以及处理基因的特殊性质，来筛选目标基因。
例如可以利用抗草甘膦，病毒耐受性，抗虫淀粉酶等性质来鉴定。
只要观察到相应的特性，就可以证明此转基因已经成功。
四、荧光成像鉴定转基因Fluorescent Proteins如GFP和RFP等，诞生于最近十几年之间。
通过构筑转基因生物，来融入荧光基因，从而使生物体内部发亮。
并且，荧光标记的转基因生物能使生物学家们观察到某些细胞活动的细微变化以及动物生命体系资源的流入流出等现象。
五、PCR约束消化鉴定转基因PCR约束消化也被广泛用于检测转基因。
将PCR扩增的产物，用细菌中相应的酶切割，然后进行胶溶电泳，这么做可从大小上直观鉴定出目的基因片段是否已被插入基因位点，以及是否是单一拷贝。