pBR322质粒
pBR322质粒
【图谱】：pBR322质粒载体的基因组图谱如下：
pBR322质粒DNA分子的长度为4363bp，此载体中有两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因（Apr），另一个是四环素抗性基因（Tetr）。
现在已知pBR322DNA分子共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。
其中7种限制酶（从12：00位置按顺时针方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIII和NruI的识别位点位于四环素抗性基因内部，另外有2 种限制酶即ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr的失活。
3种限制酶即ScaI、PvuI和PstI的识别位点位于氨苄青霉素抗性基因内，在这些位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。
由pBR322质粒载体的结构可知其具有如下优点：（1）具有较小的分子量。
经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过10Kb。
pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段；（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。
标记基因往往可以赋予宿主细胞一种新的表型，这种转化细胞可明显地区别于非转化细胞。
当我们把一个DNA 片段插入到某一个标记基因内时，该基因就失去了相应的功能。
当把这种重组DNA分子转到宿主细胞后，该基因原来赋予的表型也就消失了。
要是仍保留了原来表型的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。
很显然，既要指示外源DNA是否进入了宿主细胞，又要指示载体DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么这种载体必须至少具有两个标记基因。
另外，pBR322质粒载体还具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累1000~3000个拷贝，这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。
【相关信息】：pBR322质粒载体的构建
pBR322质粒载体的构建过程可简单地概括如下：
1、由于pBR322质粒的亲本之一是pMB1质粒，故首先以pMB1为基础，引入Rldrd19质粒的Tn3易位子，得到13.3kb的pMB3质粒；
2、pMB3的分子量显然使得它不适合作为载体，所以要通过在EcoRI活性条件下的消化让它大部分的无用片段失去，留下来的小片段的DNA的黏性末端连接起来后就形成了pMB8质粒（2.6kb）；
3、此时，另外一种pSC101质粒在EcoRI活性条件下消化产生了含有tetr抗性的DNA片断，这个片断和pMB8整合在一起就形成了pMB9质粒（5.3kb）。
此时pMB9为ampstetr 表型；
4、pMB9已经初步具备载体的功能，为了让它更加完善，我们要让它具备amprtetr性能，即在pMB9上引入pSF2124的Tn3易位子，但Tn3可以来也可以走，为了留住它，我们切去了Tn3中表达转位酶的基因，形成了pBR313质粒。
此后我们兵分两路：一路把pBR313的PstI位点除去，使之成为ampstetr表型的pBR318质粒；
5、；另一路把pBR313的EcoRII的位点切除，使之成为amprtets表形的pBR320质粒。
由此我们的到了两种功能互补的质粒，这样我们只要将他们杂交就可以得到一种接近全能的载体质粒了，这就是pBR322 。
pBR322的应用
了解了pBR322的结构和它的构建过程之后，我们来看pBR322在基因工程中的应用。
pBR322质粒作为一种常用的基因克隆载体，在实际应用中有着非常重要的地位，其中一个突出的例子就是应用pBR322 作为克隆载体对水稻的叶绿体光诱导基因psbA 进行结构分析。
将水稻叶绿体的DNA，用EcoRI核酸限制性内切酶消化之后，放入含有溴化乙锭的低熔点（LMP）的1%琼脂糖凝胶中作电泳分离。
从LMP中分离出分子大小为1.8～2.5kb之间的DNA片段，再与同样经过了EcoRI核酸限制性内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR322质粒连接。
然后，将混合物转化到大肠杆菌5346菌株，培养在氨苄青霉素选择平板上，形成Ampr转化子菌落群体。
这样就构成了由EcoRI核酸限制性内切酶切割的水稻叶绿体DNA基因组库。
用Ampr转化子菌落与32P放射性标记的玉米psbA DNA 探针作菌落杂交，可以分离出其中的阳性克隆体。
从这些阳性克隆体中分离出来的重组体质粒DNA，经过进一步的分析，就能测出水稻叶绿体基因psbA的序列。
利用pBR322作为载体重组人体的抑生长激素也是一个经常提到的应用例子。
其过程和水稻叶绿体基因重组大同小异，只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因外，还将含有lac 操纵子起始部分的片段（包括启动子、操纵区、核糖体结合位点和β－半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生长激素基因的旁边。
由于有了lac操纵子的控制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了。
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第5章基因工程基本流程筛选与鉴定
4. 噬菌斑筛选法 原理 以λ-DNA为载体的重组DNA分子经体外包装后转染受 体，转化子在培养板上形成噬菌斑。 取代型载体，噬菌斑即为重组子； 插入型载体需进行二次选择
13
选择过程
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基于克隆片段序列的筛选与鉴定
1. PCR鉴定法 原理： 针对已知目的片段特异性扩增。包括：区分重组 子与非重组子、期望重组子与非期望重组子、目 的片段是否整合在受体基因组上。 PCR鉴定法不适用于大规模转化子的鉴定。
5
无环丝氨酸培养基
6
（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素 抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。
7
2. -半乳糖苷酶显色反应筛选法
乳糖
半乳糖 +
-半乳糖苷酶
X-gal
半乳糖 +
原理
葡萄糖
5-溴-4-氯靛蓝 深蓝色
载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基 端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。 可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完 整有功能的-半乳糖苷酶。
例：小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧 苄二氨嘧啶有抗性。
DHFR 载体
转化受 连接 体菌
三甲氧苄二氨嘧 啶培养基平板
含DHFR的克隆才能生长
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3) 酶活性检测 针对外源基因表达产物是酶。
①扩散免疫沉淀检测分泌型产物
原理：抗原——抗体凝集反应 方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当 插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时， 就会与抗体反应形成“沉淀圈”。
放射性标记
膜
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克隆载体及其主要功能
.克隆载体及其主要功能载体是克隆基因的关键组分，载体使重组DNA分子能够在受体细胞中复制。
质粒和噬菌体是两种天然的DNA载体。
目前，能在不同受体细胞中使用的载体有数百种，其中，可以在大肠杆菌中使用的载体数目最多。
质粒pBR322是一种典型的大肠杆菌克隆载体，它全长仅为4.3kb。
pBR322带有两种抗生素抗性基因：b -内酰胺酶基因和四环素抗性基因，前者修饰并消除氨苄青霉素对大肠杆菌的毒性。
通常，目的基因插入载体质粒将破坏四环素抗性功能。
因此，使用含有氨苄青霉素和四环素的培养基，我们可以鉴别大肠杆菌的转化细胞：带有重组质粒的转化细胞只能在含氨苄青霉素、不含四环素的培养基上生长；另一方面，原受体细胞不能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长；而有载体质粒但没有目的基因的转化细胞能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基上生长。
另外，pBR322是一种松弛型质粒，在培养液中加入氯霉素可以使转化细胞中的质粒拷贝数由通常的15个增至1000-3000个，此间，大肠杆菌的染色体并不复制。
在细菌中，噬菌体载体是另外一类常用的克隆载体。
和质粒不同的是，噬菌体载体通过感染过程即转导进入宿主大肠杆菌细胞。
通常，作为克隆载体的噬菌体，都经过一定的突变和缺失处理。
因此，这类噬菌体进入大肠杆菌细胞之后，并不像一般噬菌体那样在宿主染色体上整合，而是直接进入裂解周期：大量复制噬菌体、裂解宿主细胞，最终在培养基上形成含有大量噬菌体拷贝的噬菌斑。
和质粒载体相比，噬菌体载体能够克隆更长的DNA片断。
3.重组克隆筛选3.1.抗性基因插入失活筛选法根据抗生素抗性基因插入失活原理而设计的插入失活法是重组体常用的筛选方法。
如非重组的pBR322质粒DNA上的四环素和氨苄青霉素抗性基因都是正常的, 表型为AprTcr。
带有这种质粒的受体菌可以在加有四环素和氨苄青霉素的双抗性平板上生长。
但是, 如果在该质粒的四环素抗性基因内插入外援片段, 就会造成四环素抗性基因失活, 变成AprTcs, 携带这种质粒的宿主菌可以在氨苄青霉素的平板上生长, 而不能在四环素抗性平板上生长。
pBR322这个名字的含义.
6.1.4 Other typical E. coli plasmid cloning vectors
6.1.4 Other typical E. coli plasmid cloning vectors
pGEM3Z——克隆 DNA的体外转录载 体 与pUC载体很相似 ，含ampR和lacZ′基 因，在lacZ′基因内 有一个限制性酶切 位点。还有两个启 动子——T的克隆的集 合，包含了某个生物体的所有基因。P306
6.4 λand other high capacity vectors enable genomic libraries to be constructed
一个基因组文 N= 库到底需要多 ln(1 少个克隆
ln(1 P ) a ) b
克隆数目 17kb片段 35kb片段 410 1500 10000 820 3225 21500
N指克隆个数，P得到基因可能性，a插入载体中的 DNA平均大小，b是基因组大小。
物种 大肠杆菌 酿酒酵母 黑腹果蝇 基因组大小/bp 4.6×106 1.8×107 1.2×108
稻米
人类 青蛙
5.7×108
3.2×109 2.3×1010
100000
564000 4053000
49000
274000 1969000
6.5 Vectors for other bacteria
含有对称克隆位点的M13mp7载体的构建 如用EcoRⅠ、 BamHⅠ、 SalⅠ中的一种 去酶解M13mp7 ，会出现什么 情况？再加入 外源DNA酶连 会出现什么情 况？
含有对称克隆位点的M13mp7载体的构建 M13mp7的 多接头会被 切下。 再加入外源 DNA会出现 三种连接情 况：1）插入 了新的DNA ；2）插入了 多接头；3） 载体自连。
列举重要质粒
列举重要质粒
质粒是一种环形的DNA 分子，常存在于细菌、真菌等生物体中，它能够自主复制并在细胞间转移，携带一些重要的基因信息。
以下是一些重要的质粒：
1. pUC19 质粒：这是一种常用的克隆载体，携带氨苄青霉素抗性基因和lacZ 基因。
它常用于在大肠杆菌中克隆和表达基因。
2. pET 系列质粒：这是一类用于表达外源基因的质粒，常用于在大肠杆菌中高效表达蛋白质。
pET 系列质粒携带T7 启动子，可以诱导基因的高水平表达。
3. pBR322 质粒：这是一种经典的质粒，携带氨苄青霉素和氯霉素抗性基因。
它常用于基因克隆和质粒构建。
4. pGL3 质粒：这是一种用于荧光素酶报告基因检测的质粒，常用于研究基因调控和启动子活性。
5. pGEX 系列质粒：这是一类用于表达谷胱甘肽S-转移酶（GST）融合蛋白的质粒，常用于蛋白质的纯化和检测。
这些质粒在分子生物学、基因工程和生物技术等领域具有重要的应用价值。
当然，还有许多其他类型的质粒，它们具有不同的特性和用途，可根据具体需求选择合适的质粒。
pBR322这个名字的含义.
6.1.1 The nomenclature of plasmid cloning vectors
pBR322这个名字的含义 :
1.“p”说明它是一个质粒； 2.“BR”表示最初构建它的实验室； 3.“322”把该质粒和该实验室构建的其它质粒区分开。
6.1.4 Other typical E. coli plasmid cloning vectors
6.1.4 Other typical E. coli plasmid cloning vectors
pGEM3Z——克隆 DNA的体外转录载 体 与pUC载体很相似 ，含ampR和lacZ′基 因，在lacZ′基因内 有一个限制性酶切 位点。还有两个启 动子——T7启动子 和SP6启动子。
感染大肠杆菌
6.2 Cloning vectors based on M13 bacteriophage
噬菌体载体构建的困难： 通常带有几个复制所必需的基因，可供改变的自 由度很小。
507bp可改变， 还必须保证复 制起点不被破 坏。
优点：可获得单 链的被克隆 DNA。
6.2.1 Development of the cloning vector M13mp2
M13mp7的优点：无论新DNA是通过哪个酶切位点引入，都可通过 EcoRⅠ从重组后的分子中切除。
Recovery of cloned DNA from a recombinant M13mp7 molecule by restriction at the outer sites of the polylinker.
6.1.2 The useful properties of pBR322
pBR322 产品说明书
HonorGene---专业的基因研究资源提供商（基因/载体/细胞/启动子/腺病毒/慢病毒/AA V/siRNA /miRNA）
pBR322产品说明书
产品信息
产品货号载体名称出品公司质粒用途原核抗性HG-VKY0280 pBR322 HonorGene 克隆载体Amp+、Tet+
质粒图谱
质粒简介
（1）pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。
质粒名称pBR322中的“p”代表质粒，“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。
（2）pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。
它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。
（3）pBR322具有很多优点，如相对分子质量较小、拷贝数较高等，是最常用的克隆载体之一。
Propagation in E.coli
（1）克隆菌株：DH5α、TOP10、XL1-Blue等均可。
（2）原核抗性：Amp+（工作浓度建议为100ug/ml）、Tet+（工作浓度建议为10ug/ml）。
（3）培养温度：37℃。
HonorGene（奥诺基因）---长沙艾碧维生物科技有限公司
地址：湖南省长沙市岳麓区桐梓坡西路229号麓谷国际工业园C栋12楼电话：155****6881
网址： E-mail：***************。
质粒载体pBR322
质粒载体pBR322质粒载体pBR322 质粒载体pBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。
符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。
pBR322是一个人工构建的重要质粒，有万能质粒之称。
它是由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。
质粒载体pBR322的大小为4361bp，相对分子质量较小的是它第一个优点。
优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。
具有两种抗生素抗性基因——氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。
质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。
同时，由于其为人工构建质粒，虽然带有抗药性基因，但已不能在自然界的宿主细胞间转移，同时应用安全菌株，亦不会引起抗生素抗性基因传播。
pBR322质粒载体的结构pBR322质粒载体的基因组图谱如下：pBR322质粒DNA分子的长度为4363bp，此载体中有两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因（Apr），另一个是四环素抗性基因（Tetr）。
现在已知pBR322DNA分子共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。
其中7种限制酶（从12：00位置按顺时针方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIII 和NruI的识别位点位于四环素抗性基因内部，另外有2 种限制酶即ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr的失活。
3种限制酶即ScaI、PvuI和PstI的识别位点位于氨苄青霉素抗性基因内，在这些位点插入外源DNA 则会导致ampr基因的失活。
质粒pBR322DNA与内切酶EcoRI相互作用的研究
ＥｏＩ ｃＲ 的浓度为 ５ ｎｔ Ｌ ｉｕ ｕ －
ＤＮ 内切 酶 复 合 物 的 切 割 图 像 Ａ一
Ｅ ｏ Ｉ 浓 度 为 ７５ ｎｔｔ。 ｃＲ 的 ．ｕ ｉｒ ・ Ｌ
＼
＼
丑
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丑
Ｉ Ⅱ Ｉ
Ｄ
Ｅ
Ｆ
切割后不同 Ｄ ＮＡ结构的统计图像（ Ｄ、Ｅ、Ｆ分别与上面 的 Ａ、Ｂ、Ｃ对应） 图 １ 有 Ｍｇ 存在 的条件时。内切酶 Ｅ ｏ Ｉ ＤＮ 的切割作用 图 ｃＲ 与 Ａ
增加．
关键词 ：Ｄ ＮＡ； 内切酶；切割 ；结合
中 图分 类 号 ：Ｑ６ ３ ３ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ： １７ —５ ３２ １）５０ ３ ．６ ６４３ ６ （０ １０ —０ ２０ 本文 的 Ｐ ＤＦ文件 可 以从 ｘ ｅａ ．Ｚ ． ｕｃ 得 ｕｂ ｏＷ Ｕｅ ． ｄ ａ获
内切酶 浓度 增加 对切 割 率 的影 响不 是很大 ，当 内切 酶 的浓 度大 于 ５ ｎｔ ｉ ｕ ・ 时 ，Ｄ ＮＡ 被切 割 的 比
３ ４
例 明显增 加 ．
温州大学学报 ・ 自然科学版 （ １） ３ 卷第 ５ ２ １第 ２ ０ 期
Ａ
Ｂ
Ｃ
Ｅｏ１ ｃＲ 的浓度 为 ２５ｕ ｉ ． ｎｔ －
异性作用与非特异性作用 的热动力学系数 ，１８年 ，Ｍｃ ｌ ｉ等人Ｌ 确定了Ｅ ｏ Ｉ Ｎ ９６ Ｃａ ｎ ｒ ｌ ｃＲ 与Ｄ Ａ作用复
合物 的具体 结构 ，１９ 年 ，Ｗｒ ｈ［１ 又进 一步 提 出 了Ｅ ｏ Ｉ ９９ ｉ ｔ５ ｇ １等人 ｃＲ 与ＤＮ Ａ结合与 分 离的动 力 学机制 ， 这 些研 究结 果为进 一步 在 云母片 上 面研究 Ｄ ＮＡ与 内切 酶 的相互 作用 提供 了主要依 据 ．
如何用pBR322质粒清除细胞
如何用pBR322质粒清除细胞什么是pBR322质粒？pBR322质粒是一种常用的分子生物学工具，它是一种含有两个抗生素抗性基因（氨苄青霉素和四环素）和多个限制性内切酶位点的质粒。
它可以在大肠杆菌等细菌中复制，并用于克隆和表达外源基因。
为什么要用pBR322质粒清除细胞？有时候，我们需要去除细胞中的质粒，以恢复其原始的遗传特征或为引入新的质粒做准备。
用pBR322质粒清除细胞是一种方法，它利用了pBR322质粒的低拷贝数和不稳定性，以及抗生素选择压力的缺失。
通过这种方法，我们可以在不需要操作细胞染色体的情况下，将细胞转化为突变体或进化状态。
如何用pBR322质粒清除细胞？用pBR322质粒清除细胞的步骤如下：1. 将pBR322质粒转化到含有目标质粒的细胞中，并在含有氨苄青霉素和四环素的LB平板上筛选转化子。
2. 在不含抗生素的LB培养基中培养转化子几代，使得质粒丢失或降低复制效率。
3. 在非选择性（LB）和选择性（含有氨苄青霉素和四环素的LB）平板上涂抹随机菌落。
4. 收集在非选择性平板上生长但在选择性平板上不生长的菌落，并用标准质粒纯化方法检测其是否含有目标质粒或pBR322质粒。
pBR322质粒清除细胞的优缺点用pBR322质粒清除细胞的优点是：•它是一种简单且成本低廉的方法，不需要使用特殊的试剂或设备。
•它可以适用于多种细菌菌株，只要它们能够接受pBR322质粒并对氨苄青霉素和四环素敏感。
•它可以保留细胞染色体上的突变或进化特征，而不影响其遗传稳定性。
用pBR322质粒清除细胞的缺点是：•它需要更多时间来完成清除过程，因为常规质粒的清除效率较低。
•它可能需要使用一些辅助剂，如丝裂霉素C、乙锭溴、十二烷基硫酸钠、升高温度或高压电穿孔来增加清除效率。
•它可能导致一些意外的突变或重组事件，因为pBR322质粒可能与目标质粒或染色体发生相互作用。
第5章 基因工程基本流程-筛选与鉴定.
有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在
底片上曝光显示。
18
选择过程
Southern blot流程
19
3. 菌落/噬菌斑原位杂交
原理： 特异性探针（与目的基因同源）进行的核酸原位杂交
20
选择过程
探针的制备及标记，p60
21
4. R-环检测法
原理：
DNA-RNA杂交：
外源基因的mRNA与重组载体杂交
的检测方案
37
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜 固相支 持滤膜
一抗
二抗
125I
标记的二 抗结合蛋白
待测基因 产物蛋白
一抗
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗
38
二抗
125I
标记的二抗 结合蛋白
选择过程
1) 弥补缺陷
转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌
29
原理：
在外源片段大小及限制性酶切图谱已知的条件下，选择 一两种内切酶切割载体，电泳后比较电泳结果(DNA条 带数目和分子大小）差异进行区分。 或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片 断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。
30
A
B
A或B
31
不同克隆的酶切结果
32
选择过程
A
A
T T
3) 酶活性检测 针对外源基因表达产物是酶。 ①扩散免疫沉淀检测分泌型产物 原理：抗原——抗体凝集反应
方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当
插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，