培养基灭菌的目的和要求
培养基的制备与灭菌
培养基的制备与灭菌培养基的制备与灭菌实验⼋培养基的制备与灭菌⼀、⽬的要求1.掌握微⽣物实验室常⽤玻璃器⽫的清洗及包扎⽅法。
2.掌握培养基的配置⽅法。
3.掌握⼲热灭菌和⾼压蒸汽灭菌的操作⽅法。
⼆、基本原理正确掌握培养基的配制⽅法是从事微⽣物学实验⼯作的重要基础。
由于微⽣物种类及代谢类型的多样性．因⽽⽤于培养微⽣物的培养基的种类也很多，它们的配⽅及配制⽅法虽各有差异。
但⼀般培养基的配制程序却⼤致相同．例如器⽫的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜⾯与平板的制作以及培养基的⽆菌检查等基本环节⼤致相同。
三、实验材料1.药品：待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L 的NaOH 和HCl 溶液。
2.仪器及玻璃器⽫：天平、⾼压蒸汽灭菌锅、移液管、试管、烧杯、量筒、三⾓瓶、培养⽫、玻璃漏⽃等。
3.其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花等。
四、操作步骤(⼀)玻璃器⽫的洗涤和包装1.玻璃器⽫的洗涤玻璃器⽫在使⽤前必须洗刷⼲净。
将三⾓瓶、试管、培养⽫、量筒等浸⼊含有洗涤剂的⽔中.⽤⽑刷刷洗，然后⽤⾃来⽔及蒸馏⽔冲净。
移液管先⽤含有洗涤剂的⽔浸泡，再⽤⾃来⽔及蒸馏⽔冲洗。
洗刷⼲净的玻璃器⽫置于烘箱中烘⼲后备⽤。
2 ?灭菌前玻璃器⽫的包装(1)培养⽫的包扎：培养⽫由⼀盖⼀底组成⼀套，可⽤报纸将⼏套培养⽫包成⼀包，或者将⼏套培养⽫直接置于特制的铁⽪圆筒内，加盖灭菌。
包装后的培养⽫须经灭菌之后才能使⽤(2)移液管的包扎：在移液管的上端塞⼊⼀⼩段棉花(勿图8-1移液管的包扎⽤脱脂棉），它的作⽤是避免外界及⼝中杂菌进⼊管内，并防⽌菌液等吸⼊⼝中。
塞⼊此⼩段棉花应距管⼝约0.5cm 左右，棉花⾃⾝长度纟勺1~1.5cm。
塞棉花时.可⽤⼀外围拉直的曲别针、将少许棉花塞⼊管⼝内。
棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通⽓⽽⼜不使棉花滑下为准。
先将报纸裁成宽勺5cm 左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的⼀端，约成45C⾓，折叠纸条包住尖端，⽤左⼿握住移液管⾝，有⼿将移液管压紧.在桌⾯上向前搓转，以螺旋式包扎起来。
一般培养基的灭菌条件
一般培养基的灭菌条件在生物学和微生物学实验中，培养基是非常重要的试剂，它提供了微生物生长所需的营养和环境。
培养基的制备是一个非常关键的过程，一旦受到污染就会对实验结果产生影响。
因此，在制备培养基前，必须对培养基进行灭菌处理，以杀死任何可能存在的微生物。
以下是关于灭菌条件的详细介绍和指导意义。
1.高温高压灭菌法高温高压灭菌法通常用于大容量的液体培养基或密封器皿，可以有效地杀灭大部分微生物，并且不会损坏培养基的成分。
这种方法需要使用高压灭菌器，将培养基加入到无菌的容器中，紧密密封并置于灭菌器中。
然后将温度升高到121°C，保持压力大约为15 psi，持续压力下维持 20 - 30 分钟，以确保培养基中微生物的完全灭活。
2.化学灭菌法化学灭菌法的原理是通过添加强效的消毒剂来杀死微生物。
消毒剂可以破坏微生物的细胞壁或膜，使其不能生长和繁殖。
最常用的消毒剂是氯己定、过氧乙酸等。
但是，这种方法可能导致一些残留物对微生物的生长产生影响，所以在使用化学消毒剂时需要注意浓度的控制和多次冲刷。
3.滤过灭菌法滤过灭菌法是利用过滤器将培养基中的微生物进行过滤，以达到灭菌的目的。
过滤器的孔径通常为0.22微米，可以有效地过滤掉绝大部分的微生物。
这种方法对于无菌条件较严格的实验，如病毒培养等非常有用。
但是需要注意的是，需要使用无菌装置将培养基进行滤过，在保证过滤器无菌的情况下进行操作。
在灭菌过程中，需要注意不同材料的适合灭菌方式。
对于易挥发的溶液，可以使用过滤灭菌法或化学法；对于含有糖酵母等易抗菌的成分的物资，可以使用过滤灭菌法或高温高压气炉灭菌；对于固体培养基，可以使用高温高压气炉灭菌或化学灭菌法。
灭菌后应密封保存，在无菌条件下储存。
在制备培养基时一定要注意消毒工作，确保培养基的质量与纯度。
综上所述，不同的培养基灭菌方法适用的条件不同，人们可以选择不同的灭菌方式来确保培养基的质量。
在灭菌过程中一定要注意保证无菌操作，避免污染并保存存储条件，以便取样和使用。
培养基的配制与灭菌实验报告
培养基的配制与灭菌实验报告一、实验目的1、掌握培养基的配制方法和原理。
2、学习并掌握高压蒸汽灭菌锅的使用方法和操作要点。
3、了解灭菌在微生物实验中的重要性。
二、实验原理（一）培养基的配制培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。
不同的微生物对营养物质的需求不同，因此需要根据培养的微生物种类和实验目的来选择合适的培养基配方。
培养基通常包含碳源、氮源、无机盐、生长因子和水等成分。
在配制培养基时，需要按照一定的比例准确称量各种成分，并将其溶解在水中，调节 pH 值至合适范围，最后定容至所需体积。
（二）灭菌灭菌是指杀灭或去除物体上所有微生物（包括芽孢和孢子）的方法。
在微生物实验中，为了防止杂菌污染，必须对培养基、实验器具等进行灭菌处理。
高压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌方法，其原理是利用高温高压使微生物的蛋白质和核酸变性失活，从而达到灭菌的目的。
一般在 121℃、1034 kPa 的条件下灭菌 15 20 分钟，可以杀灭包括芽孢在内的所有微生物。
三、实验材料和仪器1、材料牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、NaOH 溶液、HCl 溶液、蒸馏水等。
2、仪器电子天平、药匙、玻璃棒、烧杯、量筒、pH 试纸、三角瓶、移液管、高压蒸汽灭菌锅、培养皿等。
四、实验步骤（一）培养基的配制1、计算根据培养基配方，计算所需各种成分的用量。
例如，配制 1000 mL 牛肉膏蛋白胨培养基，需要牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化钠 5 g、琼脂 15 20 g。
2、称量用电子天平准确称量各种成分。
先称取琼脂，放入三角瓶中，然后分别称取牛肉膏、蛋白胨和氯化钠，放入另一个烧杯中。
3、溶解在烧杯中加入适量蒸馏水，用玻璃棒搅拌，使各种成分溶解。
将溶解后的溶液倒入三角瓶中，用少量蒸馏水冲洗烧杯，冲洗液也倒入三角瓶中。
4、调节 pH 值用 pH 试纸测定培养基的初始 pH 值，然后用 1 mol/L 的 NaOH 溶液或 1 mol/L 的 HCl 溶液调节 pH 值至 72 74。
培养基的配制和灭菌1
5、分装过程中注意不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞 而引起污染。
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• 生理生化用培养基
• 2.溶解
• 加入所需要的水量，搅拌，使其溶解。
• 3.调节pH值
• 用玻璃棒沾少许液体，测量pH值。用氢氧化钠和 盐酸调节pH。
• 4.过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省 去。
• 5.分装及包扎
• 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试 管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口 塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。
培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理 性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半 合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体 培养基
灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物 体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢 子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照 射和化学药品法等。
常用加热灭菌法： 1、干热灭菌：
（四）实验方法
培养基的制备过程 称量---溶解----调节pH值----过滤---分装及包扎----灭菌----灭菌后试管 摆放斜面
• 1.称量 按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。
• 配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g,琼 脂粉20.0g,自来水水1000ml,pH7.0。
用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌 2、湿热灭菌
⑴高压蒸汽灭菌法 ⑵间歇灭菌法 ⑶煮沸消毒法
（三）实验器材
• 1.药品和试剂：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、5％ NaOH溶液、5％盐酸溶液；生理生化培养基。
培养基的制备与灭菌实验报告
培养基的制备与灭菌实验报告培养基的制备与灭菌实验报告引言：在微生物学研究中，培养基是不可或缺的工具。
培养基的制备和灭菌是保证实验结果准确性和可重复性的重要步骤。
本实验旨在探究培养基的制备方法和灭菌技术的应用。
一、培养基的制备1.1 选择合适的培养基成分培养基的成分根据微生物的需求而定。
常见的培养基成分包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等。
在制备培养基时，需根据所研究的微生物特性选择合适的成分。
1.2 制备培养基的步骤制备培养基的步骤主要包括称量、溶解、调pH、加热消毒和装瓶。
首先，按照配方称取所需成分，并逐一溶解于适量的蒸馏水中。
随后，根据微生物的需求，调节溶液的pH值。
最后，将溶液装入试管或培养皿中，并加热消毒。
二、灭菌技术的应用2.1 灭菌的目的灭菌是指将培养基、培养器具和实验室环境中的微生物杀灭或去除的过程。
灭菌的目的是为了避免外来微生物的污染，确保实验结果的准确性。
2.2 常用的灭菌方法常用的灭菌方法包括高温灭菌、化学灭菌和紫外线灭菌。
高温灭菌是指将培养基或器具在高温条件下进行加热消毒，常用的方法有烘箱灭菌和压力灭菌。
化学灭菌则是通过使用化学物质如酒精、乙醛等来杀灭微生物。
紫外线灭菌则是利用紫外线的辐射杀灭微生物。
2.3 实验中的灭菌操作在实验中，常用的灭菌操作包括培养基灭菌、器具灭菌和工作台灭菌。
培养基灭菌是将制备好的培养基加热消毒，以杀灭其中的微生物。
器具灭菌则是通过高温、化学物质或紫外线对实验器具进行消毒。
工作台灭菌则是通过紫外线辐射对实验台面进行灭菌处理。
结论：培养基的制备和灭菌是微生物学研究中的重要环节。
正确的培养基制备和灭菌操作可以确保实验结果的准确性和可重复性。
通过本实验，我们学习了培养基的制备方法和常用的灭菌技术，为今后的微生物实验打下了基础。
参考文献：[1] 陈晓玲, 赵莉, 邱晓红, 等. 基础微生物学实验教程[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 2017.[2] 郭燕妮, 张晓红. 微生物学实验指导[M]. 北京: 高等教育出版社, 2019.。
培养基配置和灭菌的注意事项
培养基配置和灭菌的注意事项
培养基是微生物学研究和实验室操作中常用的一种物质，而培养基的配制和灭菌是关键的步骤。
以下是培养基配置和灭菌的注意事项： 1. 培养基配制：在配制培养基时，应选用优质原料，精确称量，严格按照配方比例配制，避免过量或不足的添加。
同时要注意加热溶解固体成分时的温度和时间，以及液体成分的搅拌均匀程度。
2. 培养基灭菌：灭菌是为了保证培养基中没有外来微生物的存在，从而保证实验结果的准确性和可靠性。
传统的灭菌方法包括高压蒸汽灭菌和干热灭菌，但这些方法的使用需要设备和条件的支持。
常用的方法是使用过滤器将培养基过滤，去除其中的微生物。
过滤器的选择应根据微生物的大小和过滤效率来确定，同时要注意滤器的细胞毒性和耐温性。
3. 培养基贮存：培养基的贮存也很重要，应将其保存在干燥、
阴凉、避光的环境中，避免受潮、受热、受光等影响。
同时要注意不同类型的培养基的贮存条件和有效期限。
总之，培养基的配制和灭菌是微生物学研究和实验室操作中至关重要的一部分，需要严格按照操作规程和注意事项进行，以保证实验结果的准确性和可靠性。
- 1 -。
培养基的制备与灭菌实验报告
培养基的制备与灭菌实验报告一、实验目的本实验旨在掌握培养基的制备方法和灭菌技术，为后续的微生物培养提供保障。
二、实验原理1. 培养基的制备方法：（1）选用适当的基质：如蛋白胨、肉汤、蔗糖等；（2）添加必需元素：如氮源、碳源、矿物质盐等；（3）调节pH值：使其接近微生物生长最适pH值；（4）加入琼脂：使液态培养基凝固成固态培养基。
2. 灭菌技术：灭菌是指将微生物及其孢子全部杀灭或去除，以保证培养基无菌。
常用的灭菌方法有高温灭菌法和化学药剂灭菌法。
三、实验材料和设备材料：蛋白胨、肉汤、琼脂、氧化钠等。
设备：量筒、天平、自动移液器、恒温水浴器等。
四、实验步骤1. 制备液态培养基：（1）称取所需的蛋白胨和肉汤，按比例混合加入适量的蒸馏水中，搅拌均匀；（2）调节pH值至7.0-7.2，若pH值过高可加入适量的氧化钠溶液；（3）将制好的液态培养基分装到不锈钢培养皿中，每个培养皿约20ml；（4）将分装好的液态培养基在恒温水浴器中加热至沸腾，持续煮沸10分钟。
2. 制备固态培养基：（1）按照液态培养基制备方法制备好液态培养基；（2）将琼脂加入到液态培养基中，搅拌均匀；（3）将制好的固态培养基分装到无菌试管或无菌平板中；（4）在恒温水浴器中加热至琼脂完全溶解。
3. 灭菌：将制备好的液态和固态培养基放入高压灭菌锅中进行灭菌处理，温度和时间根据不同材料和设备而定。
五、实验结果经过灭菌处理后，制备好的液态和固态培养基均无菌，可以用于微生物培养。
六、实验注意事项1. 实验过程中要严格遵守无菌操作规范，以保证培养基无菌。
2. 制备液态培养基时，要注意加入必需元素的比例和pH值的调节。
3. 制备固态培养基时，要注意琼脂的加入量和溶解度。
4. 灭菌处理时，要根据实验材料和设备选择合适的灭菌方法和时间。
5. 实验结束后，要对实验器材进行消毒处理。
七、实验结论本实验通过制备液态和固态培养基以及灭菌处理等操作，掌握了培养基制备和灭菌技术。
培养基灭菌注意事项
培养基灭菌注意事项
培养基灭菌是为了消除可能存在的细菌、真菌和其他微生物，在进行微生物实验或培养工作时非常重要。
以下是培养基灭菌时需要注意的事项：
1. 选择合适的灭菌方法：常见的灭菌方法包括高温高压灭菌（如常用的压力釜或高压锅）、滤过灭菌和化学消毒等。
根据实验的需要和培养基的成分特点，选择合适的灭菌方法。
2. 严格遵守操作规范：在进行培养基灭菌时，必须严格遵守操作规范，如戴好手套和口罩，保持操作区域的清洁和无尘，避免污染。
3. 注意灭菌时间和温度：灭菌时间和温度是很关键的，要确保相应的时间和温度能够有效杀灭细菌和其他微生物。
根据不同的灭菌方法，注意控制好时间和温度。
4. 使用合适的培养基容器：选择适当的培养基容器也很重要，例如使用无菌培养瓶或管，确保培养基与外界环境隔离。
5. 防止污染：在灭菌过程中，一定要注意防止培养基的二次污染。
避免将灭菌后的培养基暴露在不洁的环境中，避免接触可能带有微生物的物品。
6. 定期检测灭菌效果：要定期检测灭菌效果，可以通过培养基的无菌化验来确
认是否达到了灭菌要求。
7. 储存注意事项：灭菌后的培养基要储存在干燥、避光和低温的环境中，避免细菌再次污染。
总之，进行培养基灭菌是保证实验结果准确和可靠的重要步骤，需要严格遵守操作规范和注意相关细节。
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K Nt
K
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为理论灭菌时间的对数残留规律公式。
问题：能不能做到绝对无菌？
温度对K的影响 • 微生物的热死灭动力学接近一级反应
动力学，它的比热死灭速率常数K与 灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方
程表征 K A eE/ RT
A-频率因子，min-1 ΔE-活化能，J/mol R-通用气体常数，J/（mol.k）
54℃
10-1
残留的活菌含量
10-2
56℃
10-3
10-4 10-5
0
58℃ 60℃
24
6 8 10 t(min)
图2-1 大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线
– 活化能ΔE的大小对K值有重大影响。其它条件
相同时， ΔE越高，K越低，热死速率越慢。 ∆E/R是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量， 值越大，表明微生物死亡速率随温度的变化越 敏感，在灭菌中∆E/R是很重要的常数 。
– 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的 分解。
灭菌的方法
• 化学法
– 化学药品灭菌法：甲醛、苯酚等
• 物理法
– 干热灭菌法 – 湿热灭菌法（生物工程工业常用方法） – 射线灭菌法
1. 湿热灭菌原理和影响灭菌的因素
湿热灭菌的原理：主要是因高温使微生物体内的 一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性， 从而导致微生物无法生存而死亡。
• KVB从0.02（min-1）提高到0.06（min -1 ） • KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min -1 ）
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和 维生素B1的lnK-1/T图
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 绝对温度倒数，1/T（·K）×10-3
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度 对维生素B1破坏的影响
1 1-5 30 2 5-10
湿热灭菌的优点 • 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； • 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； • 蒸汽有很大的潜热； • 操作方便，易管理。
1.1 湿热灭菌的理论基础
• 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以 接受的总数N（10-3），需要多高的温 度、多长的时间为合理。
孢子热死灭和营养成分破坏活化能
物质 维生素B12 维生素B1盐酸盐 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 肉毒梭菌孢子 枯草杆菌孢子
ΔE（J/mol） 96232
9204 ΔEBS=67000× 4.184（J/mol） • ΔEVB=22000× 4.184 （J/mol） • 将灭菌温度从105˚C提高到127 ˚C
• 致死温度与致死时间：杀死微生物的极限温度 称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生 物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上， 温度愈高，致死时间愈短。
微生物的热阻和相对热阻：前者是指微生物 在某一特定条件（主要是温度和加热方式） 下的致死时间。后者是指某一微生物在某 条件下的致死时间与另一微生物在相同条 件下的致死时间的比值。
– 不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。
– 对（4）两边取对数，得
ln
K
E RT
ln
A
k/min
4.0 3.0 2.0
1.0 0.8 0.6 0.4
0.2
0.1 2.54
2.56
斜率= -ΔE/R 2.58 2.60 2.62 2.64
微生物死亡速度常数K与温度的关系
– K是ΔE和T的函数，K的对T的变化率与有 关，对（5）两边对T的导数，得
灭菌温度（˚C）
100 110 120 130 140 150
达到灭菌程度的时间 （min）
843
维生素B1的损失（%） 99.99
75
89
7.6
27
0.851
10
0.107
3
0.015
1
1.2 影响灭菌的因素
培养基成分 培养基的物理状态 培养基中氢离子浓度 培养基中微生物数量 微生物细胞含水量 微生物细胞菌龄 微生物的耐热性 空气排出情况 搅拌 泡沫
• 灭菌温度和时间的确定取决于：
– 杂菌孢子的热灭死动力学 – 反应器的形式和操作方式 – 培养基中有效成分受热破坏的可接受范围
微生物的热死灭动力学方程：对数残留定律
• 微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学 反应的一级反应动力学，即：
dN dt
kN
N-任一时刻的活细菌浓度，个/L； t-时间，min； K-比热死速率常数，min-1，越小越耐热
• 1、培养基成分 • 培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越
高，微生物的热死亡速率越慢 • 在热死温度下，脂肪、糖分和蛋白质等
有机物质在微生物细胞外面形成一层薄 膜，它能有效保护微生物细胞抵抗不良 环境，因此需较高的灭菌温度。 • 另一些物质，如高浓度的盐类，色素等 可削弱其耐热性。
培养基灭菌的目的和要求
• 目的：杀灭培养基中的微生物，为后续发 酵过程创造无菌的条件。
• 要求：达到要求的无菌程度(杂菌污染降低到被 处理的每1000罐中只残留1个活菌的程度,10-3个/罐）； 尽量减少营养成分的破坏。
在灭菌过程中，培养基组分的破坏是由 两个基本类型的反应引起的：
– 培养基中不同营养成分间的相互作用；
细菌孢子的热死灭动力学与营养细胞的有
所不同。它表现为非对数的死亡动力学。 但当温度超过120˚C时，热阻极强的嗜热 脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接 近对数死亡动力学即符合一级反应规律。
• 取边界条件t0=0，N=N0，对上式积分得
Nt ekt N0
或
t 1 ln N0 2.303 lg N0
各种微生物对湿热的相对热阻
微生物
营养细胞和酵母 细菌芽孢 霉菌孢子 病毒和噬菌体
相对热阻
1.0 3×106 2~10 1~5
某些微生物的相对热阻
灭菌方式 大肠杆菌 霉菌孢子 细菌芽孢 噬菌体或病毒
干热灭菌 1 湿热灭菌 1
苯酚
1
甲醛
1
紫外线 1
2-10 2-10 1-2 2-10 5-100
1000 3×105 1×109 250 2-5
d ln K dT
E RT 2
由该式可得出结论：
反应的ΔE越高，lnK对T的变化率 越大，即T的变化对K的影响越大
• 试验表明，细菌孢子热死灭反应的ΔE很高，而某
些有效成分热破坏反应的ΔE较低。
• 将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速
度，缩短灭菌时间，由于有效成分的ΔE很低，温 度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时 间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少