肠杆菌鉴定及药敏分析测试板标准操作规程
微生物检验实验室肠杆菌标准操作规程
微生物检验实验室肠杆菌标准操作规程1. 概述肠杆菌属包括阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、阪崎肠杆菌、格高肠杆菌、中间肠杆菌、河生肠杆菌、日沟肠杆菌、生癌肠杆菌和梨形肠杆菌等14个种。
2. 标本类型痰液、脑脊液、穿刺液、脓液、血液等标本。
3. 鉴定3.1 形态与染色革兰阴性粗短杆菌，有周身鞭毛，无芽胞，与其他肠杆菌科细菌相似。
3.2 培养特性在血琼脂平板上菌落呈灰白色，不溶血；在麦康凯等培养基上因发酵乳糖形成红色、较大菌落；在中国蓝琼脂平板上形成中等大小、蓝色菌落。
3.3生化反应氧化酶试验阴性，TSI为A/A；发酵葡萄糖、乳糖、山梨醇等多种糖类，不发酵卫矛醇；IMViC--++，动力、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶和硝酸盐还原试验均阳性，H2S、赖氨酸脱羧酶试验阴性。
3.4 鉴别要点3.4.1 本菌特征：发酵葡萄糖等多种糖类，IMViC--++，动力、鸟氨酸脱羧酶和精氨酸双水解酶试验均为阳性。
3.4.2 阴沟肠杆菌与成团泛菌的鉴别阴沟肠杆菌鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶试验均阳性，赖氨酶脱羧酶试验阴性；成团泛菌鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶试验均阴性，并产黄色色素。
3.4.3 阴沟肠杆菌与产气肠杆菌的鉴别阴沟肠杆菌精氨酸双水解酶试验阳性，赖氨酸脱羧酶试验阴性；产气肠杆菌相反。
3.4.4 产气肠杆菌与成团泛菌的鉴别前者鸟氨酸脱羧酶和赖氨酶脱羧酶试验阳性，而后者相反。
3.5 操作步骤3.5.1 氧化酶试验参见氧化酶试验标准操作规程。
3.5.2 从麦康凯琼脂平板上挑取可疑菌落，用微生物鉴定仪或传统生化法进行细菌鉴定。
4. 药敏参见药物敏感性试验标准操作规程及CLSI M100-S20最新版本文件。
5. 质量控制参见质量管理程序。
检验结果解释与分析阴沟肠杆菌既存在ESBLs问题，有存在AmpC酶的问题，故耐药情况严重，应根据药敏试验和耐药机制检测报告选药。
如果检出上述两种酶，体外试验对对青霉素类、头孢菌素类或氨曲南敏感，也应报告对其耐药；同时对头霉素、酶抑制剂也耐药。
致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验 20140220
致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验1.材料与方法1.1实验材料1.1.1器材设备：剪刀、镊子、手术刀、接种环、接种针、涂布棒、酒精灯、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、革兰氏染液、光学显微镜、香柏油、恒温培养箱、游标卡尺等。
1.1.2病料采集：根据临床症状、流行病学采集疑似发病未死猪或刚死亡猪只的肝脏、脾脏、心脏、肺脏、大肠、排泄物等并冷藏运输于3h内送至实验室，待检。
1.1.3培养基与试剂：普通营养琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、微量生化反应管、药敏片、青霉素等抗生素。
1.2试验方法1.2.1细菌的形态学检查：触片镜检，用镊子夹取待检病料一端，再用灭菌过的剪刀剪出一个切面，将新鲜的切面在干净的载玻片上轻触几下，载玻片自然干燥后进行瑞氏染色或美兰染色并镜检。
可初步判断待检病料中是否含有细菌。
触片也可以是排泄物悬浮液或研磨后的组织液，注意，为避免细胞碎片影响观察，涂片或触片时一定要均匀、薄。
1.2.2分离培养：将手术刀灼烧趁热在待检病料表面烫一下，以杀灭其表面杂菌；用无菌剪刀在烫面剪出一个小口，用灭菌过的接种环从其切面伸入并旋转勾取组织，用分区划线的方法接种于普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上；或将组织研磨后用灭菌生理盐水或灭菌PBS液稀释，再用接种环勾取悬浮液使用分区划线的方法接种于普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基上，置37℃恒温箱培养18-24h后观察菌落形态。
在普通营养琼脂培养基上长出灰白色光滑圆形菌落，麦康凯培养基上长出粉红色或砖红色光滑圆形菌落，在伊红美蓝培养基上长出紫黑色并有金属光泽的光滑圆形菌落。
注：麦康凯培养基和伊红美蓝培养基为鉴别培养基。
1.2.3培养物革兰氏染色：用接种环取一滴灭菌生理盐水于载玻片上→用接种环挑去麦康凯培养基上单个中等大小的红色菌落于生理盐水中混匀→均匀涂布成直径约为1cm的薄层→那载玻片在酒精灯上方30-40cm处干燥→使用酒精灯外焰固定→滴加一滴草酸结晶紫1min→水洗→加革兰氏碘液2-3min→水洗→95%酒精脱色0.5-1min →水洗→滴加石炭酸复红0.5-1min，用滤纸吸干，油镜镜检。
大肠杆菌分离鉴定及药敏实验方案
鸡致病性大肠杆菌的分离培养及药敏实验实验基本步骤：样品→肝、脾触片革兰氏染色镜检→普通琼脂平板、麦康凯琼脂平板分离培养→革兰氏染色镜检、生化实验鉴定→普通肉汤培养基增殖培养→药敏实验。
1 病料采集1.1 准备材料：试管、载玻片、手术刀、手术剪、结扎绳、记号笔、冰块、泡沫箱、口罩、手套（该灭菌的都进行高压蒸汽灭菌）、冰箱。
1.2 取材部位：血液、肝脏、脾脏、肠内容物，若有鸡胚感染则去鸡胚及卵黄物。
1.3 操作方法：将病死鸡浸泡在消毒剂溶液中，打开腹腔，无菌采集肝脏、脾脏放于事先准备好的灭菌试管内，将带有肠内容物的肠管两端结扎放于灭菌是试管内。
将有明显病变的脏器入肝、脾进行触片，做好标记。
都贴上标签，标示采集样品，来源地，采集时间，采集人。
将装有病料的试管放在放有冰袋的泡沫箱中，及时返回实验室，置于4℃冰箱待检。
2 菌的分离培养及鉴定2.1 准备材料：光学显微镜、革兰氏染色液、载玻片、手术刀、接种环、平皿、恒温箱、高压锅、摇床、酒精灯、葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖等微量生化发酵管，蛋白胨水（蛋白胨(或胰蛋白胨)20g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL pH7.4），葡萄糖蛋白胨水溶液（每100 mL蛋白胨水中加入葡萄糖1g）、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、VP指示剂、超净台。
培养基：A. 普通琼脂培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、琼脂 20g、蒸馏水1000ml，ph7.3±0.1），B. 麦康凯琼脂培养基（蛋白胨20g、牛胆盐5g、氯化钠5g、琼脂15g，乳糖10g、结晶紫0.001g、中性红0.025g，ph7.2±0.2。
），C. 营养肉汤培养基（牛肉粉 3g、蛋白胨 10g、氯化钠 5g、蒸馏水1000ml，ph7.2±0.2）。
2．2 样品触片镜检涂片镜检：取触片,进行革兰氏染色镜检。
2.2.1在玻片上滴加草酸铵结晶紫染色液，作用1min，水洗。
2.2.2 加革兰氏碘液于玻片上媒染，作用1min，水洗。
肠杆菌科 国标 检测方法
肠杆菌科国标检测方法肠杆菌科是一类广泛分布于自然界和环境中的细菌。
它们是一类革兰氏阴性杆菌，具有多样的代谢特征和多种致病性。
肠杆菌科国标检测方法，是检测食品、生物制品和水产品等中的肠杆菌科细菌的一种方法，下面将重点介绍这种检测方法的相关内容。
一、肠杆菌科国标检测方法的基本原理通过培养基中添加肠杆菌属专属抑制剂，使其抑制了其它多种细菌；而肠杆菌属则能在这种环境下生长繁殖，形成特征性的黑色或暗紫色胞落。
通过计数这些胞落的数目，就能确定样品中肠杆菌科菌落总数。
二、肠杆菌科国标检测方法的操作流程1. 样品的采集和处理：对于不同的样品，采集和处理的方法也不同，一般采用合适的培养基进行加压过滤，然后将过滤的样品加入特制的肠杆菌科选择性琼脂膜（包含抑制剂和染色剂）中。
2. 其中需添加的培养基成分和配方都有国家标准规定。
3. 琼脂板的带样，分为TNTC的、100-1000个/个的、10-100个/个、1-10个/个和少于1个/个五级进行计数。
4. 检测结果的判断：通过繁殖的菌落数目以及颜色的特征和其他细节判断检测结果。
5. 数据分析和处理：对于数据的统计和处理，有专门的软件进行处理以得到更加准确的结果。
三、肠杆菌科国标检测方法的优缺点1. 优点：该方法操作简单，检测结果比较准确，而且可以同时检测多个样品，成本相对较低，需要的专业设备也相对简单。
2. 缺点：该方法主要检测的是肠杆菌科菌落数目，但无法区分不同种类的菌落，对具体菌种的检测能力较差。
四、肠杆菌科国标检测方法的应用范围该检测方法主要应用于食品、饮料、医药保健、生物制品、化妆品、环境水样等各个领域，以保证产品的质量和安全。
总之，肠杆菌科国标检测方法是一种比较简单和实用的检测方法，通过该方法可以快速准确地检测出样品中的肠杆菌科细菌数量，为我们生活中的产品提供必要的质量保证。
大肠杆菌的检测：大肠菌群测定的操作细则(中英文对照版)
大肠杆菌的检测:大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料1.1 温箱:36±1℃。
1.2 冰箱:0~4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
肠杆菌科检验(食品微生物学检验)
4.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见 B.1。
1
4.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE 肉汤):见 B.2。 4.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA):见 B.3。 4.4 营养琼脂(NA):见 B.4。 4.5 葡萄糖琼脂:见 B.5。 4.6 革兰氏染色液:见 B.6。 4.7 氧化酶试剂:见 B.7。 4.8 无菌1 mol/L NaOH:见 B.选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板,36 ℃±1 ℃培养18h~24h,挑取平板上 的 菌 落 进 行 革 兰 氏 染 色 镜 检 、氧 化 酶 试 验 及 葡 萄 糖 发 酵 试 验 。
6.2 倾注平板和培养
6.2.1 根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液 体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌平皿。同时,分别吸取1 mLBPW 加入两个无菌平皿 内作为空白对照。 6.2.2 将10mL~15mL 冷却至46 ℃的 VRBGA(可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温)倾注于每 个 平 皿 中 。 小 心 旋 转 平 皿 ,使 样 品 匀 液 与 培 养 基 充 分 混 匀 。 6.2.3 待琼 脂 凝 固 后,倾 注 一 薄 层 同 样 的 培 养 基 覆 盖 平 板 表 层。 防 止 蔓 延 生 长 并 使 菌 落 特 征 更 为 明显。 6.2.4 待 VRBGA 平板上层琼脂凝固后翻转平板,36 ℃±1 ℃培养18h~24h。
GB 4789.41—2016
食品安全国家标准
食品微生物学检验 肠杆菌科检验
1 范围
本 标 准 规 定 了 食 品 中 肠 杆 菌 科 (Enterobacteriaceae)的 检 验 方 法 。 本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计 数;第 二 法 适 用 于 肠 杆 菌 科 含 量 较 低食品中肠杆菌科的计数。
肠杆菌鉴定板条中文说明书-2012
无色的芳基取代的糖苷或磷酸酯经酶水解释 放出黄色的 σ-或 ρ-硝基苯酚
1，3，5-8
丙二酸的利用可产生碱性产物，使 pH 升高并 使指示剂颜色改变。 芳香胺底物经酶水解释放出可被 RapID ONE 试 剂检测到的游离 β-萘胺 碳水化合物底物的利用产生酸性产物， 降低 pH 值并使指示剂颜色改变。 TM 底物的利用形成能被 RapID 斑点吲哚试剂检 测到的吲哚。
1. 当把肠杆菌鉴定反应板稳稳地置于台面上时，揭下反应槽上的标签盖，把右下角的垂片掀 起来拉到左边。 2. 向反应槽 15（PRO）到 17（PYR）中加入两滴肠杆菌鉴定试剂。 3. 根据表 3 中列出的结果解读指导，从左到右读取反应槽 1（URE）至 18（ADON）的结果并进 行打分。使用双功能试验方框上面的试验代码将试验评分记录在报告表中恰当的方框内。 4. 向反应槽 18（ANON/IND）中加入两滴 RapID
ODC LDC TET LIP KSF SBL GUR ONPG βGLU βXYL NAG MAL PRO GGT PYR ADON 无 肠杆菌鉴定试剂 无 红色 紫罗兰色、紫 色、 红色或深粉 色 黄色或非常浅 的橙色 无 黄色 无 黄色
药敏试验操作方法
欢迎共阅药敏试验操作方法药敏试验根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐的K-B琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉维酸（AMC），头孢噻吩（CFT），头孢噻肟（CTX），庆大霉素（GEN），萘啶酸（NAL），诺氟沙星（NOR），四环素（TBT），利福平（RFA），复方新喏明（SMZ）。
1 操作方法：(1)将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。
(2)用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。
用棉拭子涂布整个M-H培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
(3)待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。
用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。
每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。
在菌接种后15分钟内贴完纸片。
(4)将平板反转，孵育18～24小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录（附表5）。
抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。
结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。
2 注意事项：(1)制备MH琼脂平板应用直径90mm平皿，在水平的实验台上倾注。
琼脂厚为4±0.5mm （约25-30ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。
倾注平皿前应用pH计测pH值是否正确(pH应为7.3)。
pH过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。
(2) 药敏纸片长期储存应于－20℃，日常使用的小量纸片可放在4℃，但应至于含干燥剂的密封容器内。
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1 目的
规范肠杆菌鉴定及药敏分析系统测试板标准操作规程。
2 原理
系统测试板由生化反应孔和抗菌药物MIC测定试验孔组成，在生化反应孔中加入细菌悬液，抗菌药物MIC测定试验孔中加入细菌药敏培养基，经35—37℃孵育，生化反应在细菌代谢作用下直接产生颜色变化或经加入辅助试剂后产生颜色变化，抗菌药物MIC测定是根据试验孔是否出现浑浊（沉淀）确定是否有细菌生长。
3 试剂盒组成
3.1微生物（肠杆菌）鉴定及药敏分析系统测试板（珠海美华）
3.2稀释液
3.3M-H肉汤培养基
4 质控
大肠埃希菌ATCC25922
5 操作步骤
5.1生化试验操作方法
5.1.1菌悬液制备：挑取纯培养单个菌落于稀释液瓶内壁研磨，呈细菌悬液（0.5麦氏单位）。
5.1.2使用移液器（配无菌吸头）吸取该菌液加入测试板A1-A12孔，B1-B12孔，每孔100ul。
5.1.3在A1-A6孔分别滴加无菌石蜡油2滴。
5.2药敏试验操作方法
5.2.1吸取菌悬液50ul，加至M-H肉汤培养基内混匀，继续加入测试板的其余各孔（所
有的药敏孔及生长对照孔C+及6.5%NaCL），每孔100ul。
5.2.2撕开不干胶的纸（对齐孔）贴于鉴定板（把鉴定板两侧的凹槽页贴上），孵育18-24h
参考文献
[1]Patrick R.Murray,Mannal of clinical Microbiology,7th edition.
[2]闻玉梅，现代医学微生物学，第一版，上海医科大学出版社。
[3]《全国临床检验操作规程》
[4]《Clinical and Laboratory Standards Institute》文件。