原代细胞分离纯化SOP
原代细胞制备操作SOP
1. 目的建立原代细胞制备操作规程，以保证试验的顺利进行和制备的细胞生长良好，满足检验和试验需要。
2. 范围适用于实验室原代细胞的制备，如：牛肾原代细胞、牛睾丸细胞制备等。
3. 职责3.1. 质量管理部：负责本规程的起草。
3.2. 质量管理部QC人员：负责本规程的实施。
3.3. 总经理：负责本规程的审批。
4. 定义无5. 引用标准无。
6. 材料6.1. 材料准备：6.1.1．细胞培养液：见《细胞培养液的制备SOP》。
6.1.2．EDTA－胰酶：见《胰酶的制备程序》6.2．实验器具6.2.1．手术器械：眼科剪、眼科镊、手术剪、手术刀、镊子、止血钳等。
6.2.2．玻璃器皿：大平皿、三角烧瓶250ml（含盖）、三角烧瓶（含盖）500ml、烧杯（含盖）100ml、烧杯500ml（含盖）、烧杯 1000ml（含盖）、注射器、离心管（含盖）、玻璃漏斗、吸管、玻璃珠等。
6.2.3．对以上器材按其性质高压蒸汽消毒或干烤消毒6.2.4. 消毒纱布6.3．仪器6.3.1．36℃培养箱培养用6.3.2 普通冰箱贮藏试剂用7. 流程图无8. 内容8.1. 取材：无菌采取代细胞的动物组织，置于消毒器皿中。
8.2. 漂洗：用灭菌培养液反复清洗组织，后移入洁净区内。
将组织在500单位双抗菌素溶液中浸泡三次，浸泡时间分别为20min和30min。
8.3. 剪切：剪去组织被膜，然后剪下组织的所需部分，放入PBS液反复漂洗除净血渍。
将洗净的组织块移入小烧杯中，用剪刀剪成0.5-1.0mm2小块。
8.4. 消化：收集剪切后的组织小块，移到装有小玻璃珠的三角烧瓶中，用PBS液洗1-2次，加入沉淀量5-8倍量的0.25%胰蛋白酶37℃作用30-60min。
8.5. 制备细胞悬液8.5.1．方法一：弃去胰蛋白酶消化液，加入培养液轻摇三角烧瓶后弃去培养液，以降低消化液的浓度，加入培养液后剧烈摇动三角烧瓶使小玻璃珠冲击组织小块分离细胞制取细胞悬液，吸取上清细胞悬液，再加入培养液，再继续摇三角烧瓶收集上清细胞悬液，反复数次，把所收集的细胞悬液混合到一起，分到细胞培养瓶中。
原代细胞分离培养Protocol
原代细胞分离培养原代细胞分离培养的原理是利用组织和器官中的细胞在体外适宜的条件下进行分离、纯化和培养的过程。
以下是所需试剂、耗材和实验仪器：1.试剂：包括胰蛋白酶、胶原蛋白酶、DMEM培养基、胎牛血清、双抗等。
2.耗材：培养瓶、培养皿、离心管、细胞筛、移液管、吸管等。
3.实验仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、粉碎机、冷冻冰箱、计时器等。
在开始实验之前，需要做好以下准备工作：1.清洁实验室：实验室内需保持清洁，所有的实验器材和器具必须经过高压灭菌处理。
2.灭菌处理：实验中所使用的所有试剂和器材都需要进行灭菌处理，以确保无菌操作。
3.准备培养基：根据实验要求准备好相应的培养基，加入一定比例的胎牛血清和双抗，混合均匀后储存备用。
4.制备组织块：将从人体或动物体内取得的待分离组织进行处理，去除筋膜、脂肪等杂质，修剪成适宜大小的组织块。
以下是原代细胞分离培养的具体步骤：1.组织块的消化：将组织块放入粉碎机中进行粉碎，然后用胰蛋白酶或胶原蛋白酶进行消化处理。
2.细胞过滤：将消化后的组织溶液通过细胞筛进行过滤，以去除未消化彻底的细胞团块和杂质。
3.细胞离心：将过滤后的细胞溶液进行离心处理，以去除上清液，收集沉淀的细胞。
4.细胞接种：将收集到的细胞接种到培养瓶或培养皿中，加入准备好的培养基，放入细胞培养箱中进行培养。
5.细胞传代：待细胞生长至一定密度后，可以通过胰蛋白酶进行细胞传代，将细胞继续培养或冻存备用。
注意事项包括：1.无菌操作：整个实验过程需在无菌环境下进行，所有的操作都需要用酒精灯进行灭菌处理，避免污染细胞。
2.细胞的活性：在分离和培养细胞时，需要保证细胞的活性，避免长时间的低氧、低营养环境。
3.细胞的冻存：如果需要长时间的保存细胞，应该将细胞冻存在-80℃的冰箱中，同时加入适当的冻存液进行保护。
4.细胞的复苏：冻存的细胞在复苏后需要进行活力检测，以确保细胞的存活率。
5.质量控制：用于细胞分离和培养的试剂、器材等都应该经过严格的质量检测和控制，以确保实验结果的可靠性。
细胞分离与纯化.ppt
2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法
（1）牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)
由于BSA是血清蛋白，它对细胞活性的影响很小，是早期应用连续 或不连续密度梯度分离细胞的最常用介质，但BSA黏度很高，分离细胞 必须长时间离心，且用量大，费用高，故现在已经部分被其它分离介质 取代。
1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离
将用于体外细胞培养的动物组织材料制备成细胞悬 液，然后接种并培养，是原代培养的最常规方法。
由于从体内切取的大多数组织（少数结缔组织如血 液、骨髓、淋巴等除外），均是由细胞和少量的细胞间 质（后者内一般含有纤维成分）紧密结合而成的实体组 织。如果直接将所取的组织块用来培养（此即为植块培 养），在培养的组织块大于1 mm3时，培养过程中只有位 于植块周边的细胞容易获得营养而存活和生长发育。
为了获得大量细胞培养物，必须将组织解离，将组织 块内部细胞与细胞之间的“组织关系”解除，将细胞“解 放”，使之成为分离（离散）的细胞，这个过程即为细胞 分离（离散）或分散（cell dissociation)。
细胞分离（离散）或分散并不等于细胞分离和纯化， 但是，细胞分散是细胞纯化的前提。目前所建立的体外分 离和纯化细胞的方法，绝大多数是从细胞悬液中进行分离 和纯化的。
分离和纯化细胞的过程不仅仅是在原代培养之前进 行，有时候，分离和纯化细胞的过程还贯穿在原代与继 代培养的过程之中，甚至主要依靠培养过程实现分离与 纯化细胞的目的。
培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞在培养物 中的比例如何，常常是衡量某一培养工作是否成功的重 要指标。
四、细胞分离与纯化
根据所要分离纯化的对象和目的不同，可以采用不同 的细胞分离纯化方法，从简单的手工操作技术到使用自动 控制的特别是电脑控制的尖端仪器。
原核抗原纯化SOP
原核抗原生产转化1取出制备好的感受态细胞，放在冰上融化；2融化后100μl 感受态细胞加入约20ng 质粒DNA冰浴30min3热击：将离心管放置42 ℃水浴，热击90 秒，注意：勿摇动离心管；5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置 1 －2 分钟；6．复苏：每管加500μl LB培养基，在37 ℃摇床温和摇动温育45 分钟，使细菌复苏；7．涂皿：取适当体积均匀涂布于含有抗生素的平板上8．培养：倒置培养皿，于37 ℃培养过夜小量诱导1取5ml相应抗性的LB培养基于灭过菌的试管中2挑菌：用已灭菌牙签挑取转化的细菌单个菌落与1中，37℃培养3当试管中的细菌OD达到0.4-0.6时加入1mM的IPTG继续培养两个小时4收集3中细菌送QC做蓝染或者WB检测大量诱导37℃大量培养细菌，当od值达到0.4-0.6时用IPTG诱导，诱导7个小时候收菌，用生理盐水洗涤后离心取去上清，于-20保存。
Ni柱纯化（上清）1、镍琼脂糖凝胶FF 装柱2、用缓冲液50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl 10mM咪唑平衡5-20 个床体积3、将细菌破碎于(50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl)缓冲液中0.45 μm 滤膜过滤，上样，4、用缓冲液50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl再洗5-20 个床体积5、用分别含50、100、150、250mM mM 咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，收集，用SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度6、用纯水流洗5 个柱床体积，再用20%的乙醇流洗3 个柱床体积，柱子置于+4~8℃环境中保存Ni柱纯化（包涵体）1将细菌破碎于(50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑)中，在使用前加入1mM PMSF （每250毫升裂解液中加入约50克菌体，工作15s，间隔15秒，超声破碎45分钟，室温放置20分钟，16000RPM离心30分钟，保留沉淀）2用STE（50mM Tris-HCl, pH 8.0，150mM NaCl，1mM EDTA）洗涤包涵体三次3用STE+1%的tritonX100洗涤包涵体三次4用STE+2MNacl洗涤包涵体三次5用STE+ 2%的脱氧胆酸钠洗涤包涵体三次6用STE+2M尿素洗涤包涵体2次（每次洗涤完后10000rpm离心10min）7用（50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑，6M盐酸胍）过夜溶解包涵体8把溶解的包涵体16000转30min离心去沉淀，上清用0.45milipor滤器过滤上样三遍（若溶解效果不好，加入5mMDTT 在50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑，6M盐酸胍溶解，装入透析袋，在50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑8M尿素中透析，去掉DTT，再进行His柱纯化）9用缓冲液（50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑，6M盐酸胍)淋洗5-20 个床体积10. 用缓冲液（50 mM tris-hcl，pH8.0，0.5M NaCl，10mM咪唑，6M尿素)淋洗5-20 个床体积10用分别含50、100、150、250mM mM 咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，收集，用SDS-PAGE 检测融合蛋白的分子量大小和纯度包涵体His柱上复性（常用）柱料：Chelating Sepharose Fast Flow（His柱）稀释buffer1：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；8MUrea稀释buffer2：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；10%甘油；0.1%PEG20000；0.3%Tween20复性buffer1：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；2MUrea；10%甘油；0.3%Tween20；10mM咪唑复性buffer2：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；1.5MUrea；10%甘油； 0.3%Tween20； 10mM咪唑复性buffer3：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；1MUrea；10%甘油；0.3%Tween20 ；10mM咪唑复性buffer4：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；0.5MUrea；10%甘油； 0.3%Tween20 ；10mM咪唑复性buffer5：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；0MUrea；10%甘油；0.3%Tween20 ；10mM咪唑淋洗buffer：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；10mM咪唑洗脱buffer：50mM Tris pH8.0；500mMNaCl；250mM咪唑洗脱液经SDS-PAGE检测纯度和大小。
原代细胞分离实验安全操作及保养规程
原代细胞分离实验安全操作及保养规程背景介绍原代细胞分离实验是一种在生物医学研究和治疗方面广泛应用的技术。
它可用于获得细胞样本和制备细胞培养物，具有广泛的应用前景。
然而，与细胞分离实验相伴随的安全风险也需要引起重视。
本文档旨在提供原代细胞分离实验的安全操作规程和细胞培养物的保养规程，以确保实验室人员和实验物品的安全。
实验室安全操作规程1. 实验室安全标准实验室应遵守研究所或实验室的安全规章制度。
实验人员应接受必要的培训和指导，学习实验室的安全标准和操作规程。
实验人员应穿戴个人防护装备，如手套、实验外套、面罩等，以减少对人体的伤害和交叉污染的风险。
2. 原代细胞分离前的准备在进行原代细胞分离实验前，必须进行适当的准备和清洁操作。
这包括：•准备无菌工作台。
细胞分离实验需要在无菌环境下进行，以减少外源性细菌和病毒的污染。
实验室应配备无菌工作台，并在实验前进行消毒。
•准备实验仪器和材料。
细胞分离实验涉及使用各种实验仪器和材料，如离心机、显微镜、培养皿、移液器等。
在实验前应对这些仪器和材料进行适当的清洁和准备工作。
•准备培养基和试剂。
细胞分离实验需要使用特定的培养基和试剂，实验前应准备好这些材料，并确保其无菌和正确使用。
3. 原代细胞分离实验的操作规程原代细胞分离实验可以根据具体的实验需要进行多种操作，包括：•细胞消化。
细胞消化是分离细胞的主要方法之一。
在细胞消化过程中，细胞需要暴露于特定的酶消化液中，以在短时间内分离细胞。
在消化过程中，需要注意以下安全要点：–酶消化液必须是新鲜的，并使用刚刚打开的试剂瓶。
–完全消化需要时间，需要根据实验要求进行消化时间的精确确定。
–消化液中的酶可能会刺激皮肤和眼睛，使用时应戴上手套和面罩。
•细胞驯化。
分离后的细胞通常需要适应无血清的培养conditions，这个过程称为驯化。
在驯化细胞的过程中，需要注意以下安全要点：–无血清培养基可能含有病毒，因此应谨慎操作和使用防护装备。
CD4细胞分选SOP
CD4细胞分选实验计划Dynabeads洗涤（Dynabeads使用前必须清洗）1.重悬瓶中Dynabeads2.转移需要量的Dynabeads到离心管，200ul×32只×2个时间点=12.8ml，一次6.4ml，分7管洗涤。
3.加入同样体积的Buffer 1，或者至少1ml，混匀4.将离心管放在磁力架上1min，弃去上清5.移去磁力架，同样体积的Buffer 1重悬Dynabeads样品准备1x107淋巴细胞，细胞悬液体积100ul细胞分离关键步骤1.使用能提供离心和倾斜的混匀器，确保Dynabeads不会沉淀于管底2.每1x107淋巴细胞所用的Dynabeads不得少于200ul3.严格按照磁力架建议，确保成功分离从小鼠脾或淋巴结中分离CD4+T细胞本操作流程基于1x107淋巴细胞，可分离1x107至1x107个细胞。
1.将100ul(1x107)淋巴细胞（悬于Buffer 1）加入离心管中2.加入20ul热失活的FCS, 加入20ul抗体混合液3.混匀，孵育2-8℃，20min4.加入2ml Buffer 1洗涤细胞。
通过倾斜离心管多次来混匀细胞，离心300 xg，8min，4℃。
弃去上清5.800ul Buffer 1重悬细胞6.加入200ul 已洗涤过的Dynabeads7.孵育15min，18-25℃。
轻柔地倾斜离心。
8.轻轻抽吸5次以重悬磁珠结合的细胞（1000或5ml头）9.加入1ml Buffer 110.静置在磁力架上2min, 转移上清到新管中，上清中即为阴性选择的小鼠CD4+T细胞。
细胞培养标准操作程序（SOP）
细胞培养标准操作程序（SOP）细胞培养标准操作程序（SOP）1．⽬的：为了保证培养细胞的正常⽣长，实验技术⼈员必须明确并正确执⾏细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．适⽤范围：适⽤于来我院细胞室进⾏细胞培养⼯作的⼈员。
3．操作规程：3.1 培养液、PBS、胰蛋⽩酶的配制3.1.1 1000ml培养液的配制1、准备⽤品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电⼦分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）、NaHCO3粉、1000ml⽆菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉⽤900ml新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2.0g，Invitrogen 公司的DMEM 需加NaHCO3粉3.7g等），再充分搅拌。
⽆需加⾕氨酰胺，因该培养基⾥已含有。
4、⽤1M（1mol/L）HCl 调PH⾄7.0左右（细胞适宜在PH7.2～7.4⽣长，配制好后PH值会升⾼0.2～0.3，故配时调PH⾄7.0左右）。
5、⽤新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）定容到1000ml。
6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏⽔溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏⽔溶解取0.5ml青霉素和0.4ml链霉素加⼊到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在⽆菌操作台⾥⽤0.22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶⼝⽤薄膜封⼝，盖上橡⽪塞，放-20℃保存备⽤。
注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使⽤的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）配制。
⼀般于配制当天制备，以保证⽔的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先⾼压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸⽔（或新鲜反渗⽔）的容器均不需⾼压灭菌，⼲净即可。
原代细胞纯化方法
原代细胞纯化方法嘿，你问原代细胞纯化方法啊？那咱就来好好唠唠。
这原代细胞纯化呢，可不是一件容易的事儿哦。
一种方法是差速贴壁法。
就像挑选手下的兵一样，得把好的留下来，不好的去掉。
先把原代细胞悬液放到培养瓶里，让细胞在里面待一会儿。
这时候不同类型的细胞贴壁的速度不一样哦。
有些细胞贴得快，有些细胞贴得慢。
等一段时间后，把还没贴壁的细胞轻轻倒出来，这样就把贴壁快的细胞和贴壁慢的细胞分开啦。
就像把跑得快的人和跑得慢的人分开一样。
还有一种方法是密度梯度离心法。
这就像在玩一个分离游戏。
准备一种特殊的溶液，把细胞放进去，然后用离心机转一转。
不同的细胞在溶液里的位置不一样，就像不同的东西在水里会浮起来或者沉下去一样。
这样就可以把想要的细胞分离出来啦。
另外呢，免疫磁珠法也挺好用。
就像给细胞贴上小标签，然后用一个有磁性的东西把有特定标签的细胞吸出来。
先准备好带有特定抗体的磁珠，让磁珠和细胞混在一起。
那些有特定抗原的细胞就会和磁珠结合在一起。
然后用一个磁铁把结合了磁珠的细胞吸出来，这样就纯化了想要的细胞啦。
我给你讲个例子哈。
有个实验室的小伙伴，他要纯化一种原代细胞。
他先试了差速贴壁法，把细胞放到培养瓶里，等了一会儿，倒出没贴壁的细胞。
但是效果不是特别好。
然后他又试了密度梯度离心法，准备好溶液，用离心机转了转。
哇，这次效果好多了，分离出了比较纯的细胞。
最后他还试了免疫磁珠法，用带有特定抗体的磁珠，成功地纯化出了他想要的细胞。
他可高兴了，觉得这些方法虽然有点麻烦，但是真的很管用呢。
所以啊，原代细胞纯化方法有很多，要根据不同的情况选择合适的方法哦。
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原代肝细胞分离纯化SOP
1、实验目的
分离和纯化原代干细胞，体外研究药物对原代肝脏细胞的毒性
2、实验方法
实验材料：ICR小鼠（20-30g）
实验试剂：20%乌拉坦或水合氯醛
0.1%肝素钠（Glucose 0.2g，0.125mM EDTA 8Ml,肝素钠
0.2g，1Mm HEPS 4.6Ml）
0.025%胶原酶（胶原酶12.5mg，L-15无血清培养基50Ml）
Pecoll分离液：9份Pecoll+1份10×D-PBS（PH7.4）制
成分离液。
3、实验步骤：
1．ICR小鼠禁食过夜。
2．取ICR小鼠，用20%乌拉坦或水合氯醛0.2-0.3ml腹腔麻醉。
3．10-15min后固定小鼠，75%酒精消毒腹部后正中切开打开腹腔并更换器械。
4．显露肝门静脉并游离2-3cm；显露游离肝下腔静脉2-3cm，置一结扎线，暂不结扎。
5．穿刺针插入肝下腔静脉后立即结扎固定，尽快接通硅胶管并启动蠕动泵（无泵，输液器亦可）同时剪断肝门静脉远端。
6．从门静脉入肝素，使小鼠全身肝素化，并持续灌注至肝脏呈米黄色。
7．换肝素钠为胶原酶消化液（37℃预热）循环灌注消化，至肝质变软，压之凹陷不易恢复。
8．停止灌注，小心剪取个肝叶置入消毒平皿内，加入约20mlDMEM 培养基（含血清，4℃预冷）祛除纤维结缔组织，制成混合肝脏细胞悬液。
9．200目筛网过滤入15ml离心管，100rpm离心5min。
去上清，沉淀加入DMEM培养基（含血清，4℃预冷）7ml重悬。
10．取等体积肝细胞悬液悬浮于Pecoll分离液，颠倒混匀。
11．4℃1000rpm离心10min，弃上清液，用PBS清洗肝细胞2次，4℃1000rpm离心10min。
12．肝细胞沉淀加入（含血清）重悬为3ml，取适量计数并用台盼蓝（3：1）判断活率。
13．活率在90%以上的肝细胞按2×103细胞密度接种于96孔板，每孔加入100ul DMEM培养基，于37℃ 5% CO2条件下培养24h。
14．将化合物用DMSO稀释到所需浓度，每孔加药1ul（化合物终浓度通常为1000uM起始，10×梯度稀释，6个梯度），空白对照加入1ulDMSO。
15．细胞于37℃ 5% CO2条件下培养24h后，加入100ulATP检测试剂，震荡孵育10min。
16．于酶标仪上读取每孔荧光值。
17．计算各药物处理组细胞存活率。