实验二植物组织中可溶性糖的薄层层析分离与鉴定
糖类的提取分离与薄层层析分析实验步骤
实验1 糖类的提取分离与薄层层析分析实验简介：薄层层析(thin layer chromatography, TLC)是在吸附剂或支持介质均匀涂布的薄层上进行的，是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪酸、脂肪类、糖类、磷脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。
本实验是从水果中提取单糖、双糖和多糖组分，采用硅胶G薄层层析法分析糖类成分。
一、实验目的1．了解并初步掌握从水果中分离提取单糖、蔗糖及淀粉的原理。
2．学习薄层层析的一般操作及定性鉴定的方法。
二、实验原理1．单糖及多糖的提取凡不能水解为更小分子的糖即为单糖。
单糖种类很多，其中以葡萄糖分布最为广泛，存在于各种水果、谷类、蔬菜和动物血液中。
由于单糖分子中有多个羟基，增加了它的水溶性，尤其在热水中溶解度很大；在乙醇中也有很好溶解性，但不溶于乙醚、丙酮等有机溶剂中。
而蔗糖等双糖分子也易溶于水和乙醇中。
因此，单糖和双糖一般可用热水或乙醇将其提取出来。
多糖是由多个单糖分子失水缩合而成的大分子化合物。
在自然界中分子结构复杂而多种多样，有不溶性的结构多糖如植物纤维素、半纤维素，动物的几丁质等；另有一些为贮存物质如淀粉、糖原等；还有一些多糖具有复杂的生理功能。
多糖中的淀粉不溶于冷水及乙醇，但可溶于热水中形成胶体溶液。
因此可以用乙醇提取单糖及低聚糖，然后提取淀粉等多糖。
2．薄层层析薄层层析的主要原理是根据各组分在溶剂中的溶解度不同和吸附剂对样品各组分的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点。
糖的分离鉴定可用吸附层析或分配层析，吸附层析常用的吸附剂为硅胶，分配层析常用的支持剂是硅藻土。
在吸附剂或支持剂中添加适宜的黏合剂后再涂布于支持板上，可使薄层粘牢在玻璃板(或涤沦片基)这类基底上。
硅胶G是一种已添加了黏合剂—石膏(CaSO4)的硅胶粉，糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的相对分子质量和羟基数等有关，经适当的溶剂展开后，糖在硅胶G薄板上的移动距离为戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。
植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定
实验四植物组织中可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质的系列测定一、目的从一份植物样品中系统分离和测定可溶性糖、淀粉、氨基酸及蛋白质等多种成分，不仅对研究植物体内碳、氮代谢，了解植物的生长发育状况有重要意义，亦可以作为鉴定其品质的重要指标，而且也有助于训练基本操作技能。
二、原理（一）分离提取原理在80-85%的乙醇中，植物组织中的还原糖、蔗糖以及游离氨基酸和叶绿素等溶解，而淀粉及蛋白质沉淀，再用9.2 mol/L高氯酸溶解淀粉（蛋白质沉淀），最后用0.1 mol/L氢氧化钠溶解蛋白质，然后选用适当的方法测定各个提取液中相应物质的含量。
（二）测定原理1.蒽酮比色法——可溶性糖含量测定碳水化合物及其衍生物经浓硫酸处理，生成糠醛，再与蒽酮脱水缩合而生成蓝绿色化合物，在一定范围内其颜色深浅与碳水化合物含量成线性关系。
蒽酮反应的颜色深浅，随温度条件和加热时间而变化，葡萄糖显色高峰在100℃时，加热10 min后出现，而核糖在相同温度下，加热3 min后出现。
此法灵敏度高，糖含量达30 μg即可测定。
2.茚三酮比色法——氨基酸含量测定氨基酸的游离氨基与水合茚三酮作用后，产生二酮茚胺的取代盐等蓝紫色化合物，在570 nm下有最大光吸收。
在一定范围内，其颜色深浅与氨基酸的含量呈正比。
3.考马斯亮蓝G-250结合法——蛋白质含量测定考马斯亮蓝在游离状态时呈红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，后者最大光吸收在595 nm，在一定范围内（0-1000 μg /mL），其颜色深浅与蛋白质的含量呈正比。
此法快速灵敏，反应在2 min内即达到平衡，室温1h内颜色稳定，而且干扰物也少。
三、实验用品（一）实验材料：植物样品。
（二）器皿：1. 25 mL刻度试管⨯8 ，15 mL试管⨯20；2. 10 mL离心管⨯2；3. 容量瓶：50 mL⨯1 ，25 mL⨯1；4. 移液管：5 mL⨯2，2 mL⨯4，1 mL⨯2，0.1 mL⨯2；5. 恒温水浴锅；6. 离心机；7. 电子天平；8. 分光光度计。
9实验10-植物组织中可溶性糖含量测定(苯酚法)
• 含糖总量一般为：2.1—20%
五、作业
• 1、糖在植物组织中有哪些作用？ • 2、有哪些方法可以测定糖类？（列举4种 以上并说明测定原理）
三、实验步骤
• 1、标准曲线的制：用标准蔗糖母液配置成每毫 升含0(作空白)、20、40、60、80、100mg蔗糖 的标准溶液各2ml，然后按顺序向试管内加入 1ml9％苯酚溶液，摇匀，快速加入5ml浓硫酸， 摇匀。比色液总体积为8ml，在室温下放置30min， 显色。然后以空白为参比，在485nm波长下测OD 值，以糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制 标准曲线。
• 3. 测定 吸取0.5ml样品液于试管中，加蒸馏 水1.5ml，同制作标准曲线的步骤，按顺序 分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定 吸光度。由标准曲线查出糖的量。
四、结果计算
• 按下式计算测试（ml）×稀释 倍数/[测定用样品液的体积(ml)×样品重量 (g)×106]×100
• 2. 可溶性糖的提取取：取新鲜植物叶片， 擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10、0.20、 0.30g，共3份（或干材料），分别放入3支 刻度试管中，加入10ml蒸馏水，塑料薄膜 封口，于沸水中提取30min（提取2次）， 提取液过滤（或离心）入25ml容量瓶中， 反复漂洗试管及残渣，定容至刻度。
实验10 植物组织中可溶性糖含量 测定（苯酚法）
植物体内的碳素营养状况以及农产品的 品质性状，常以糖含量作为重要指标；植 物为了适应逆境条件，如干旱、低温，也 会主动积累一些可溶性糖，降低渗透势和 冰点，以适应外界环境条件的变化。
一、原理
苯酚法测定可溶性糖原理：植物体内的可溶 性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。 苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作 用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛（分子式 见蒽酮法）能与苯酚缩合成一种橙红色化合物， 在10～100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成 正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可 用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基 化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，试 剂便宜，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存 在的影响，并且产生的颜色可稳定160min以上。
可溶性糖测定.
引言可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖等单糖和双糖，是植物品质的重要构成性状之一，尤其是以果实为目的产品的植物，可溶性糖与酸的含量及其配比是影响果实风味品质的重要因素。
对于鲜食品种，一般来讲，高糖中酸，风味浓，品质优；低糖中酸，风味淡，品质差。
因此，可溶性糖的定量研究对植物的品质育种、储藏、加工特性等具有重要意义。
而且可溶性糖广泛存在于植物的根、茎块和种子中，是人体热量的最最主要来源，具有较高的营养价值。
本文重点介绍蒽酮比色法、铜还原碘量法、费林试剂法、原子吸收法、气相色谱法、液相色谱-蒸发光散射法，及连续流动法这几种实验如何定量测定可溶性糖含量。
1 蒽酮比色法1.1 原理糖在硫酸作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮作用形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关。
在625 nm波长下的OD值与糖含量成正比。
由于蒽酮试剂与糖反应的呈色强度随时间变化，故必须在反应后立即在同一时间内比色。
1.2 仪器与材料1.2.1实验仪器分光光度计，电炉，铝锅，电子天平，20ml刻度试管，刻度吸管5ml 1支、1ml 2支，漏斗。
1.2.2实验试剂（1）蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数星期，如有结晶析出，可微热溶解。
（2）浓硫酸（比重1.84）。
1.2.3实验材料植物叶片。
1.3 实验方法1.3.1标准曲线的制作取20ml刻度试管11支，从0～10分别编号，按表24-1加入溶液和水。
表1 各试管加溶液和水的量管号 0 1、2 3、4 5、6 7、8 9、10 100μg/ml蔗糖液0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0(ml)水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0蔗糖量(μg) 0 20 40 60 80 100然后按顺序向试管内加入1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入5ml浓硫酸，摇匀。
比色液总体积为8ml，在恒温下放置30min，显色。
植物体内可溶性糖含量的测定
植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。
因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。
一、目的：糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。
因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。
二、原理糖类遇浓硫酸脱水生成糖醛或其衍生物，反应如下：糠醛或羟甲基糠醛进一步与蒽酮试剂缩合产生蓝绿色物质，其在可见光区620nm波长处有最大吸收，且其光吸收值在一定范围内与糖的含量成正比关系。
此法可用于单糖、寡糖和多糖的含量测定，并具有灵敏度高，简便快捷，适用于微量样品的测定等优点。
三、实验材料、仪器及试剂1．材料：植物组织叶片2．仪器：分光光度计恒温水箱20ml具塞刻度试管（3支）漏斗100ml 容量瓶刻度试管试管架剪刀研钵3．试剂：（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。
（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏；（3）浓硫酸四、实验方法1．葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。
在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（O D），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。
2．样品中可溶性糖的提取称取1克叶片，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。
置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。
实验植物组织中可溶性糖含量的测定
实验方案一、实验目的通过实验，掌握测定萝卜品质的方法（一）萝卜外部形态的测定1、实验材料取鲜样3个∕小区直尺、蒸馏水、笔、记录本、吸水纸2、实验方法．用自来水将各组萝卜洗净后，再用蒸馏水洗涤，擦干表面水分．每个小区取3个重复，用电子天平称量每株的鲜重，用直尺测量植株的茎长、茎粗、叶长，取平均值作为指标值实验(二) 植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法）一、实验目的了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用二、实验原理糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。
不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。
因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。
蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。
蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。
当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。
上述特定的糖类物质，反应较稳定。
该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。
三、材料、仪器及试剂1.材料：植物种子、白菜叶、柑桔2.仪器：分光光度计；恒温水箱； 20ml具塞刻度试管（3支）漏斗；100ml容量瓶；刻度试管；试管架；剪刀；研钵3.试剂（1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。
（2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏；（3）浓硫酸四、实验方法1.葡萄糖标准曲线的制作取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。
在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标准葡2.称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。
植物组织可溶性糖的测定
植物组织中可溶性糖与淀粉的测定植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。
一、苯酚法测定可溶性糖【原理】植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。
苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10～100Mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nM波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。
苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定时间在160Min以上。
【仪器与用具】分光光度计；电炉；铝锅；20Ml刻度试管；刻度吸管5Ml 1支，1Ml 2支；记号笔；吸水纸适量。
【试剂】90％苯酚溶液：称取90g苯酚(AR)，加蒸馏水10Ml溶解，在室温下可保存数月；9％苯酚溶液：取3Ml 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30Ml，现配现用；浓硫酸(比重1.84)；1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。
加少量水溶解，移入100Ml容量瓶中，加入0.5Ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度；100μg／L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1Ml加入100Ml容量瓶中，加水定容。
【方法】1.标准曲线的制作取20Ml刻度试管11支，从0～10分别编号，按表1－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1Ml 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5～20s时间加入5Ml浓硫酸，摇匀。
比色液总体积为8Ml，在恒温下放置30Min，显色。
然后以空白为对照，在485nM波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
表1-1各试管加入溶液和水的量试管 1 2 3 4 5 6100ug/L蔗糖液（ml）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0水（ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0苯酚（ml） 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0浓硫酸（ml） 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0蔗糖量（μg）0 20 40 60 80 1002.可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10～0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5～10Ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30Min(提取2次)，提取液过滤入25Ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
糖的薄层层析
本实验是以硅胶G为支持物的薄层层析。在铺 有吸附剂的薄层上，样品经过连续反复的被吸附剂 吸附及展开剂解吸附的过程后，不同的糖因其分子 量不同，羟基数目及醛基、酮基性质的差异，故而 在薄层上以不同速度移动而得以分离。被吸附剂吸 附强及被展开剂解吸附弱的在薄层上移动速度慢， 展开距离短；反之则移动速度快，展开距离长，于 是混合糖液中的各种糖就被分离开来。糖在薄板上 的移动速度是戊糖＞己糖＞双糖＞三糖。 在相同条件下，对照已知糖的Rf值可对未知糖 进行定性分析。
六、思考题： 显色时，是否可以采用其他的糖显色剂？
薄层层析的种类:
1 吸附薄层层析：化学结构不同的物质，在同一吸附剂上具有 强弱不同的吸附性。薄层层析是利用吸附剂在各种溶剂中对不 同化合物的吸附能力的强弱不同而进行分离。如硅胶G、硅胶H 氧化铝等都属于此类。 2 分配薄层层析：其基本原理与纸层析相同，即由支持剂、固 定相、流动相组成整个层析系统。如纤维素、硅藻土等均属于 此类。 3 离子交换薄层层析：一般采用离子交换纤维素来制作层析薄 板。
5、 记录各斑点的位置、颜色，绘出层析图谱。计算 各标准糖及混合糖中各组分斑点的Rf值，以鉴定混合 糖中糖的组分。 移动速率(比移值)： 原点到层析点中心的距离 Rf = 原点到溶剂前沿的距离
五、注意事项
1、 制板时糊状物稀稠合适，铺板迅速，以 保证薄板薄而均匀，表面平整。 2、 样品不宜过浓或过稀。 3、 点样点直径≤3mm，样点间距离≥1cm。 4、 用0.02mol/L 醋酸钠（也可用0.02mol/L 硼酸）代替水来调制硅胶板，可使Rf值较接 近的糖得到更好的分离。
三、实验材料、仪器和试剂
1．实验材料和仪器：玻璃板、天平、电热烘箱、电吹风、 毛细管、层析缸、喷雾器。 2. 试剂 (1)、1%标准糖溶液：称取木糖、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖各 100mg ,分别用75%乙醇定容至10ml。 (2)、混合糖溶液：称取木糖、鼠李糖、蔗糖、葡萄糖各1g 溶于50ml蒸馏水。 (3)、糖显色剂（苯胺－二苯胺－磷酸显色剂）：称取1g二 苯胺，加入1 ml苯胺。待溶解后加入50ml丙酮，最后加入5 ml H3PO4，边滴加边搅拌。此溶液应透明、无浑浊。 (4)、展开剂：用前配制。 1、正丁醇︰乙酸乙酯︰异丙醇︰冰乙酸︰水=2︰6︰6︰4︰1 2、氯仿︰甲醇=60︰40（V/V） (5)、0.02 mol/L 醋酸钠（含有0.5%的CMC-Na）。
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实验二植物组织中可溶性糖的薄层层析分离与鉴定
[实验目的]
糖类是自然界存在的数量最多的有机化合物，它既是植物躯体和细胞的结构成份，又是生命活动能量的主要来源，并且与植物体内各类物质的代谢密切相关，分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类及其变化，对了解植物体内的组织代谢和农产品的品质，具有重要意义。
本实验采用硅胶G薄层层析法，分离鉴定植物组织中可溶性糖的种类，要求通过本实验，学习提取植物材料中可溶性糖的一般方法，掌握吸附薄层层析的原理，操作及其在糖类鉴定中的作用。
[实验原理]
植物组织中的可溶性糖可用一定浓度的乙醇提取出来，经除去杂质，即可获得较纯的可溶性糖混合物。
薄层层析是层析法的一种，层析法是利用被分离样品混合物中各组分的物理、化学差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，这两个相通常使一个被固定在一定的支持物上的，称为固定相；另一个是移动的，称为流动相；当流动相流过固定相时，在移动过程中由于各组分在两相中的分配情况不同，或吸附性质不同，或电荷分布不同，或离子亲和力不同等，而以不同速度前进，从而达到分离的目的。
薄层层析是一种快速而微量的层析方法，它是将一种固定支持物均匀地涂在薄板上，对物质进行层析的方法，本实验只讨论吸附薄层层析，即所有支持物是吸附剂(如硅胶粉)，层析时，主要是根据吸附剂对样品中各组分的吸附能力不同，因此个组分的移动速度不同，从而达到分离混合物的目的。
糖为多羟基化合物，具有较强的极性，在硅胶G薄板上展层时，糖与硅胶分子有一定的吸附力。
硅胶分子与糖的吸附能力大小取决于糖的分子量和羟基数目，不同的糖分子由于分子量及羟基数的不同，因而它与硅胶分子间的吸附力不同。
造成各种糖分子在展层过程中移动的距离不同，从而将各种糖分离出来，一般吸附力的大小为：三糖>双糖>己糖>戊糖。
其中各种糖移动的速率可用Rf值表示。
通过与标准糖的Rf值比较。
即可鉴定出植物组织提取液中糖的种类。
溶质斑点中心到样点的距离：Rf( 值) = 溶剂前沿到点样点的距离
[器材与试剂]
1、材料：苹果或其他植物材料
2、仪器：离心机及离心管、天平、研钵、量筒（25ml)、移液管（10ml）、恒温水浴、毛细管、层析缸、吹风机、烘箱、喷雾器、烧杯、铅笔，尺子，硅胶GF254薄层层析板。
3、试剂
展开剂（氯仿：冰醋酸：水=30：35：5）
5%标准糖溶液(10mg/ml)：木糖，葡萄糖，果糖，蔗糖等。
显色剂：2mL苯胺，10mL 85%磷酸，2g二苯胺，1mL浓盐酸，100mL丙酮，溶解后混匀）[实验步骤]
1、硅胶板活化：将硅胶板置于120℃烘干箱中，烘干30min。
2、水果中可溶性糖提取液的制备：取洗净的苹果(或其他水果)削去果皮，称3g果肉在研钵中研成匀浆后，倒在双层洗净的纱布上。
包起置于漏斗，用干净玻璃棒将果汁压出。
取果汁1ml于离心管中，加无水乙醇3ml，充分混匀后，在3000转/分下离心20分钟，上清夜即为可溶性糖提取液。
3、苹果提取液中可溶性糖的分离鉴定：取活化后的硅胶G板一块，距底边1.5厘米水平线
上确定5个点，相互间隔1厘米，其中4个点，分别点上5%的木糖，葡萄糖，果糖，蔗糖标准溶液数滴，另一点点上苹果提取液数滴。
在用毛细管点样时，毛细管应垂直于硅胶G 板的方向点样，而且毛细管接触G板的时间应尽量短，不然点样斑点直径难以控制，点样量约20－30μL，分次滴加，使点扩散后的直径不超过3ｍｍ。
4、展层
将点样后的薄层板置于密闭的薄层层析缸中，用新配制的展开剂，采用上行法展层，至展开剂距薄层板的上端约１cm时取出，用吹风机吹干。
5、显色
把一块薄板放在通风橱内，采用苯胺－二苯胺－磷酸（2g二苯胺，加2mL苯胺，10mL 85%磷酸，1mL浓盐酸，100mL丙酮，溶解后混匀）显色剂丙酮溶液喷雾法显色，然后于85℃烘箱中烘10-30分钟，各种糖即显示出不同色斑与标准糖比较，根据斑点颜色及Rf值即可鉴定出苹果提取液中所存在的可溶性糖的种类。
显色剂处理后不同单糖显现的颜色
单糖颜色
葡萄糖蓝紫
半乳糖蓝紫
果糖橙红
木糖蓝绿
鼠李糖绿
[实验结果]
精确量出原点至溶剂前沿，以及各斑点中心的距离，计算出它们的R f值。
根据标准糖的颜色和R f值，鉴定出样品中糖的种类，并绘出层析图谱。
原点至斑点中心的距离
Ｒf＝──────────────。
原点至展开剂前沿的距离
[注意事项]
1、点样时，要注意点样点不能太大，操作时，应待第一次点样风干后，再在原点样点上继续点样，为少量多次点样。
2、每个点样点不宜距离太近，点样点不宜靠近硅胶板边缘，注意边缘效应。
3、放置硅胶板时，不能碰着层析缸的内壁。
4、在用多元系统进行展层时，其中极性较弱的和沸点较低的溶剂（例如氯仿-甲醇系统中的氯仿）在薄层板的两边易挥发，因此，它们在薄层两边的浓度比在中部的浓度小，也就是说在薄层的两边比中部含有更多的极性较大或沸点较高的溶剂，于是位于薄层两边的Rf 值要比中间的高，即所谓“边缘效应”。
为减轻或消除边缘效应，可先将展开剂导入层析缸中，使层析缸内溶剂蒸汽的饱和程度增加。