基因工程 介绍一种新技术

环介导等温扩增技术的研究随着分子生物学技术的发展，以检测核酸为基础的分子生学技术如PCR[1]、再生式序列复制[2]以及链置换扩增技术[3，4]等广泛应用于医学和生物学等领域，在医学诊断和传染病病原体的检测方面发挥了重要的作用。

由于核酸的分子生物学技术需要昂贵的仪器设备、操作程序复杂等缺点，大大限制了其作为快速诊断方法的使用。

环介导等温扩增技术(LAMP)的问世[5]，解决了核酸诊断上出现的诸多难题，使其作为快速诊断成为可能。

自LAMP技术建立多年以来，该技术已经广泛应用于对病毒，细菌，寄生虫以及环境中细菌等病原体的检测研究，取得了可喜的成就。

本文就该技术的方法及研究进展综述如下。

1环介导等温扩增技术的原理环介导等温扩增技术是用一套四条特异性引物与靶基因的六个不同区域退火杂交，在具有链置换活性功能的DNA聚合酶的作用下实现等温条件下扩增DNA分子的核酸扩增新技术，具有高特异性、高效率、便捷等特点[5]。

2引物设计环介导等温扩增对引物特异性的要求更高，设计也更为复杂，环介导等温扩增需要两对引物即两条外部引物和两条内部引物，外部引物限定了扩增片段的大小范围，同时也为内部引物提供了模板。

每条内部引物的两段DNA短片段通过TTTT序列连接[5]，也有研究结果认为在内部引物之间不加TTTT序列并不影响等温扩增，说明TTTT序列在串联内部引物上并不是必需的[6]。

最近NagamineK 等的研究提示在LAMP反应中加入环引物能够明显加快等温扩增的速度，大大提高了检测效率，检测率比没有加环引物的高7个数量级[7，8]。

3扩增反应与传统PCR技术相比，LAMP技术简化了94℃变性步骤，同时退火和延伸在同一温度(等温)条件下进行;反应体系的组成也较传统PCR复杂，除了反应体系中必须的缓冲液、dNTP、引物、酶和MgCl2等成分外，还须加入甜菜碱、硫酸铵等必需成分;整个扩增反应历时短，一般为30～60min即可判定结果。

由于LAMP扩增的反应体系较为复杂，因而对影响整个反应的主要成分如MgCl2和甜菜碱的浓度，内、外部引物及环引物的浓度比例要进行优化，各成分的最佳浓度是试验中确定的。

一般来说，内部引物和外部引物的浓度比为1∶4～1∶10[9]。

在进行环介导等温扩增之前一般要求对模板DNA进行变性，即95℃变性5min，60～65℃等温扩增1h左右，80℃2min终止反应整个反应的总体积通常为25LL[7]。

有研究认为在LAMP扩增反应中加入未变性的模板并不影响扩增结果，说明对模板DNA的变性在等温扩增中并不是必须步骤[10]。

LAMP反应过程是先由外部引物扩增出内部引物扩增所需要的模板即起始反应物模板的合成;紧接着由内部引物引导合成靶基因DNA片段，由于内部引物扩增的DNA片段含有与该引物5′端DNA片段的反向互补序列，因而这些反向互补序列之间通过杂交形成茎环结构，另外一条内部引物与其互补链退火杂交后引导链置换合成反应，在扩增的DNA片段的另外一端产生了新的茎环结构，形成哑铃状结构，如此往复循环最后形成菜花样结构，电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成，呈梯状条带。

LAMP的整个反应分三步完成，即起初反应物模板的合成;循环扩增阶段;延伸和再循环[5]4结果判定环介导等温扩增结果判定主要方法有:(1)电泳，将扩增产物电泳后在紫外灯下观察可见扩增产物呈梯状条带;(2)直接观察扩增管的浊度。

研究发现LAMP阳性扩增管反应后形成副产品焦磷酸镁，而没有发生扩增反应的阴性管中没有副产品焦磷酸镁产生，因此阳性管的浊度比阴性管高，经高速离心后出现更为明显的白色沉淀，阴性对照管则没有白色沉淀[11];(3)加入染料直接用肉眼判定结果。

有研究者向其扩增产物中加入能掺入到双链DNA中的荧光染料SYBYGreenÉ，发现电泳结果阳性管加入染料后颜色变为绿色，而没有目的DNA片段扩增的阴性对照管颜色没有发生变化，这一发现使得LAMP结果的判定更为简捷[12，13]5环介导等温扩增在病原微生物检测中的应用5.1细菌核酸的检测首先将LAMP用于细菌检测的是Maruyama，他们用该技术成功检测了水生环境中大肠杆菌的六个基因[14]。

之后有许多关于用LAMP对感染人[9]、鱼类[15]以及水生环境中的细菌进行检测的报道，甚至用该方法对病原体进行鉴定和分型[7]。

Iwamoto等用LAMP检测了患者痰液样品中的结核分歧杆菌，仅用35min就能检测出固体培养基中的细菌，60min内检测出液体培养基或痰液中的细菌[12]。

Song等用改进的LAMP检测了志贺氏属、侵入性大肠杆菌和引起反刍动物慢性进行性肠炎的分歧杆菌的副结核，结果提示LAMP的敏感性高于传统PCR，扩增时间比PCR缩短一半，对副结核杆菌的检出最小范围为0.01pgöLL。

与早期的LAMP相比，该方法不需要对扩增产物进行电泳，可直接通过肉眼观察反应副产品(焦磷酸镁)的浊度判定结果，大大简化了操作程序[26]。

最近，Maed等建立新型的LAMP技术并对引起牙龈炎的病原体的16sRNA基因进行了检测，可在30min内检测出含有20个细菌的扩增子，产物不需要进行电泳，只要向扩增产物中添加荧光染料SYBYGreenÉ，通过肉眼观察直接判定结果，大大地提高了检测效率[9]。

对众多细菌研究结果表明，与传统PCR相比LAMP技术不仅快速、敏感，而且具有良的特异性[15]。

用LAMP对沙门氏菌亚种肠道菌的39个血清型220株分离株和沙门氏肠道菌亚种的7株分离株进行了检测，结果显示该方法可以检测2.2CFu的细菌[6]。

Yoshida等用LAMP在检测引起牙龈炎的细菌时加入了环引物，发现加环引物后敏感性和特异性比没有加环物的高7个数量级[8]。

5.2病毒的检测5.2.1 DNA病毒自Ihira等用LAMP成功地检测了人疱疹病毒6型和7型毒株之后[16，17]，又用LAMP对SARS[18]、人流感病毒[19]、新城疫病毒[20]、口蹄疫病毒[21]等许多病毒进行了检测性研究。

对发病1～5d的疑似SARS患者研究结果提示，不仅该方法的诊断准确率高(达到80%)，而且快速(在发热首日用该方法就可以诊断出是否患有非典)。

PoonLL等用LAMP检测了人流感病毒(A型)，并对其特异性进行了鉴定。

结果提示人流感病毒分离株H1N1，H2N2和H3N3检测结果均为阳性，而禽流感病毒H5N1，H6N1和H9N2特异性均为阴性，与常规方法的检测结果一致[19]。

5.2.2 RNA病毒NotomiT等人首先将LAMP与翻转录(RT)相结合建立了单管RT2LAMP技术，使反转录和等温扩增在同一反应管中进行[5]。

而将该技术首先用于RNA检测的则是FukutaS等人，他们用RT2LAMP检测日本红薯花叶病毒，直接从感染花叶病毒的叶子、种子、根茎中快速成功地检测出病毒。

Hong等建立了新型LAMP技术即一步快速实时定量RT2LAMP方法并用该方法对49份来自SARS 流行期间采集的SARS患者的样品进行了回顾性研究，结果显示实时定量RT2LAMP敏感性比传统RT2PCR高100倍以上，能检测出0.01PFU的病毒，敏感性的和特异性分别为100%和87%，最早可在反应11min时观察到结果[19]。

FukutaS等用建立的免疫捕获RT2LAMP，对感染番茄的菊花斑点枯萎病毒进行了检测，结果表明，该方法的敏感性是免疫RT2PCR(ICöRT2PCR)的100倍。

整个扩增不到1h，结果可用反应副产品焦磷酸镁的浊度来判断，研究还提示加环引物最早在扩增反应的20min中之内浊度开始增加，而没有加环引物的在反应50min时才出现浊度增加，说明环引物能增加整个反应的速度。

5.3寄生虫的检测Ikadai等用LAMP检测了巴贝西虫对犬的感染状况，并对该方法进行了评价。

结果显示该方法具有与PCR和光学显微镜同样的敏感性，提示该方法用于检测犬体内巴贝西虫是可行的。

2003年Oriel等用LAMP成功地对非洲锥虫靶基因进行扩增后，于2005年又用LAMP、PCR以及寄生虫学方法(血涂片、鼠接种实验)对实验感染猪体内的埃文斯锥虫进行了检测，并对其方法进行了评价，认为LAMP技术在检测锥虫感染上与PCR和寄生虫学方法同样敏感。

6LAMP的优缺点与其他分子生物学技术相比LAMP技术具有以下优点:(1)敏感性高，能从极低微量的拷贝中扩增出目的基因，比传统PCR高出10～1000倍，具有与real2timeTaqmanPCR同样的敏感性。

有研究发现加环引物的敏感性要比没有没有加环引物的高出7个数量级，在极低模板量的即0.01PFu即可获得结果。

(2)特异性好，对人流感病毒和人疱疹病毒等病毒的研究结果提示，LAMP能对多血清型的同一病原体进行定型而没有出现假阳性[16，17，19]。

(3)简便，由于LAMP是在等温条件下进行的扩增，因此其在进行病原体检测时只需要维持等温的水浴锅或者是其他等温设备即可，不需要PCR仪等昂贵的仪器设备。

(4)快速，检测通常只需要30～60min就可以判定结果。

Parida等用建立的实时RT2LAMP检测了西尼罗河病毒，可以检测出0.1PFU的病毒粒子，检测敏感性比传统RT2PCR高10倍，如果病毒量为104拷贝时可在17min内出结果。

(5)结果易于判定，不需要对产物进行电泳，而直接用肉眼观察扩增管浊度或通过向其扩增产物中添加荧光染料通过颜色变化来判定结果。

(6)与反转录结合可以对RNA分子进行有效的扩增[9，11，13]。

(7)可以直接从扩增产物中分离到单链DNA分子。

缺点:该方法最大的缺点就是容易出现假阳性，由于LAMP采用了多条引物，而且是在同一温度条件下扩增，引物之间有可能互补而扩增出非特异性的条带，造成假阳性。

7展望虽然LAMP技术建立时间短，还存在诸多的缺点和不足，但其在微生物检测方面表现出来的特异性高、敏感性好、便捷快速等优点使其在开展研究病原体快速检测手段上已经显示出了令人鼓舞的前景。

坚信随着该技术的不断完善，该方法将作为分子生物学的一种快速检测技术广泛应用于各种病原体的检测和疾病的快速诊断等领域，为及时控制传染病和临床快速诊断疾病提供技术支撑。

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