荧光显微成像技术与应用共16页
光学显微成像技术在生物医药领域的应用
光学显微成像技术在生物医药领域的应用随着生物医药领域的不断发展，越来越多的疾病需要从细胞层面进行研究和治疗。
在这个过程中，成像技术起到了重要的作用。
光学显微成像技术是一种非侵入性的成像技术，可以在生物样本的活体条件下进行。
本文将介绍光学显微成像技术在生物医药领域的应用及其发展趋势。
一、荧光成像技术荧光成像技术是通过活体样本内标记的荧光染料，将荧光信号转换成可视化图像的技术。
荧光成像技术可以用于细胞、组织、器官和整个生物体的研究。
其中，基于扩增出的荧光蛋白基因（GFP）和注射标记的荧光染料的技术最为常用。
在生物医药领域，荧光成像技术主要用于活细胞分子动力学和蛋白质互作的研究。
例如，荧光成像技术可以用于实时监测细胞分化、细胞凋亡和细胞移动等过程。
此外，荧光成像技术还可用于碳水化合物代谢通路和细胞信号通路、肿瘤细胞分裂等生物过程的研究。
二、切片显微成像技术切片显微成像技术是一种高分辨率的成像技术，可用于在细胞和组织层面上研究医疗、生物化学、生理学和病理学过程。
在成像期间，光束被聚焦在样本表面，然后通过样品的深度切片收集数据。
此外，它还可以用于从单个细胞到整个生物器官的研究，例如神经元的二元配对、心脏细胞收缩过程和器官发生等。
切片显微成像技术在生物医药领域中的应用有很多。
例如，利用该技术可以研究神经元、活体细胞和组织中的变化、神经元网络中的结构和功能等。
在肿瘤研究方面，切片显微镜成像技术可用于研究癌细胞的生长、扩散及其影响周围细胞的方式。
三、吸收成像技术吸收成像技术通过利用样品对不同波长的光的吸收来成像，这种成像技术主要是基于医学影像技术的回声成像和X射线成像。
在生物医药领域，其主要应用于深层组织和类脑组织成像。
吸收成像技术的应用十分广泛。
例如，可以用于测量生物组织中的氧气饱和度、血流量、血管完整性和生物组织的电磁阻抗等。
此外，吸收成像技术还可以用于实时监测生物体内的血管和血流动态，帮助临床医生实现早期诊断和治疗。
荧光显微技术
荧光显微技术
荧光显微技术
荧光显微技术是一种利用荧光染料标记生物分子并通过显微镜观察的技术。
它在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用，如细胞成像、蛋白质定位、基因表达分析等。
一、荧光染料的选择
荧光染料是荧光显微技术中最重要的组成部分，其选择应根据样品特性和实验需求进行。
常见的荧光染料包括偶氮染料、羰基化合物、环氧化合物等。
二、标记方法
1.直接标记法：将荧光染料直接与待检测分子结合，适用于小分子或表面易于修饰的大分子。
2.间接标记法：先将抗体或亲和素与待检测分子结合，再使用带有荧光标记的二级抗体或亲和素进行检测。
3.生物素-亲和素标记法：待检测分子上带有生物素，使用带有荧光标记的亲和素进行检测。
三、显微镜成像
1.激发波长：不同荧光染料的最大激发波长不同，应选择与荧光染料相匹配的激发波长。
2.荧光滤镜：使用适当的荧光滤镜可以增强信号和降低背景噪音。
3.成像方式：常见的成像方式包括单色成像、双色成像、多色成像等，可以根据实验需求选择合适的方式。
四、应用
1.细胞成像：通过荧光显微技术可以观察细胞内各种分子的分布和动态变化，如蛋白质、核酸、小分子等。
2.蛋白质定位：通过标记蛋白质上的特定结构域或标签，可以观察其在细胞内的定位和转运情况。
3.基因表达分析：利用荧光素染料标记基因表达产物，可以观察不同组织或条件下基因表达水平的差异。
4.材料科学研究：荧光显微技术也被广泛应用于材料科学领域，如纳米粒子形貌分析、材料表面性质研究等。
总之，荧光显微技术是一种非常重要的生物学研究工具，其应用范围广泛，未来还有着更广阔的发展前景。
显微荧光成像技术
显微荧光成像技术生命科学是一个充满活力的领域，包括生物学、医学、农学、生态学等诸多分支。
显微镜是生命科学研究中不可或缺的工具之一，而显微荧光成像技术则是显微镜技术的重要分支之一。
本文将围绕显微荧光成像技术展开阐述。
一、显微荧光成像技术的基本原理显微荧光成像技术是利用荧光分子在吸收一定波长的光后，能够发出较长波长（即红外、红光、黄光）的光的特性，来探测并分析样品中各种微观结构与分子的分布情况和相互作用。
从理论上讲，这些分子在不受到荧光激发的情况下是不会发光的。
因此，要实现荧光成像需要通过激发、显微观测、成像三个步骤来完成。
激发环节是荧光成像技术的起点。
荧光分子必须要由波长与其吸收光谱相吻合的光子作用下，才能在其内部发生电子的跃迁，发出荧光信号。
一般而言，荧光分子的激发波长与发射波长是不同的。
由此，通过双光子荧光激发技术，可以用一种比传统荧光显微镜的短波长更长的激发波长来对样品进行激发，使荧光分子针对测量目的进行有选择性的激发，大大减少光伤害，同时增加激光的渗透深度，解决深部显微成像的问题。
显微观察环节是荧光成像技术的重点。
显微荧光成像技术基于荧光分子的发射特性，即它们可以在可见光谱的较长波长区域发射出光，这种现象可以被显微镜观察到。
在显微荧光成像系统中，将样品置于显微镜下，并通过荧光染料激发样品，然后通过适当的荧光滤波器对荧光发射信号进行过滤，最后将信号捕获并显示在荧光显微镜上。
成像环节是荧光成像技术的末端。
荧光显微成像系统可以将荧光信号反射到图像传感器（如CCD）上，捕获图像数据，使用显微荧光成像图像处理软件对获得的图像数据进行分析和处理，处理结果可以被投影或与其他数据交互的形式展现。
二、显微荧光成像技术的应用显微荧光成像技术应用广泛，包括生命科学、药学、医学、农业、食品工业、生态学等领域。
一些具体的应用如下：1、生命科学领域显微荧光成像技术广泛应用于生命科学领域，它可以被用来研究生物体在不同行为状态下的荧光响应，如酶活性、细胞间相互作用、细胞家族、组织结构、线粒体功能等，进一步揭示生物体的结构、功能和相互作用等相关生物学问题。
《超分辨率荧光显微成像技术》
点光源光斑的半高宽
• 其中I是STED 激光器的最大聚焦强度，而I sat 则是当受激荧光强度被减少到1/e时的STED
激光的强度特征值。由此公式可看出，当I/Isat 的值趋近无穷大时，STED 成像的点光源的
半高宽趋近于0，即分辨率不再受光的衍射过
Advatange and Disadvantage
• RESOLFT能够反映出样本的细节，而传统 共焦显微镜做不到。
• 这种“耐疲劳”可切换的探针虽然可以在 荧光和黑暗状态之间来回切换很多次,但仍 然有限,大大妨碍了使用RESOLFT在生物成 像的应用。
近场光学成像技术
传统的光学理论，如几何光学、物理光学等，通常 只研究远离光源或者远离物体的光场分布，一般统称 为远场光学。远场光学在原理上存在着一个远场衍射 极限，限制了利用远场光学原理进行显微和其它光学 应用时的最小分辨尺寸和最小标记尺寸。
a.利用柱面镜增强PALM在z轴分辨率 b.利用液晶空间光调制器增强PALM在z轴分辨率 Science, 2008, 319(5864): 810～813 Proc Natl Acad SciUSA, 2009, 106(9): 2995～2999
多重平面成像
三维成像的另一种办法是将两个或者多 个不同聚焦层面的图像同时送入 CCD中， 提取三维信息。利用这个 原理 ， Hess 和 Bewersdorf 小组开发出来双层 PALM 技 术．
The Rayleigh criterion ① choosing very short wavelengths (UV, x radiation
in the case of electromagnetic fields or more efficiently, propagating electrons); ② working in very high index materials for increasing n. increasing the aperture angle of the microscope
宽场-共振能量转移-全内反射荧光的显微技术及其应用
宽场-共振能量转移-全内反射荧光的显微技术及其应用张少华;曹福元;胡茂琼;王建枝【期刊名称】《微循环学杂志》【年(卷),期】2005(015)002【摘要】1590年世界上第一台光学显微镜诞生，在随后的几百年间，显微科学取得迅猛发展。
人们逐渐地改进了成像质量，而且各种新的光学显微镜也应运而生。
生命科学中大量的事实表明细胞的动力学特征是起源于单个蛋白质分子的聚合和相互作用，对它的研究变得尤为重要。
但是传统的光学显微镜由于受到光瞳远场衍射效应的影响，存在分辨极限。
光学显微镜空间分辨极限约250nm。
【总页数】3页(P67-69)【作者】张少华;曹福元;胡茂琼;王建枝【作者单位】华中科技大学同济医学院病理生理学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院病理生理学系,武汉,430030;湖北省黄石理工学院医学院;华中科技大学同济医学院病理生理学系,武汉,430030【正文语种】中文【中图分类】Q6-33【相关文献】1.碳点-荧光素荧光共振能量转移体系在阿司匹林测定中的研究与应用 [J], 金文英;廖秀芬;陶慧林;赵颖;刘绍州;梁永敏2.碳点-荧光桃红荧光共振能量转移体系在铜离子检测中的应用研究 [J], 陶慧林;孙超;廖秀芬;徐铭泽;王海洋;易忠胜;覃宏伟3.胶束溶液中钙黄绿素-荧光桃红间荧光共振能量转移的研究及应用 [J], 陶慧林;朱仕毅;寿红娟;黎舒怀4.荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展 [J], 罗淋淋;牛敬敬;莫蓓莘;林丹樱;刘琳5.基于动态散斑照明的宽场荧光显微技术理论研究 [J], 尹君;王少飞;张俊杰;谢佳谌;陈宏宇;贾源;胡徐锦;于凌尧因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
荧光染色技术在生物成像中的应用
荧光染色技术在生物成像中的应用随着生物学领域的不断发展，生物成像技术也越来越成为研究生命科学的重要方法。
在这些生物成像技术中，荧光染色技术无疑是其中最为重要的一种技术。
荧光染色技术是通过将某种特定的分子或细胞结构标记成荧光，然后在适当的条件下进行显微镜成像，从而实现对生物样本的观察和研究。
荧光染色技术优点如下：1. 荧光染色技术具有高灵敏度和高分辨率，使得科学家能够观察到极小的生物结构和分子，并且可以在活细胞中进行观察。
2. 荧光染色技术对样品的破坏性小，不影响后续实验的开展。
3. 荧光染色技术的染色方法比较简单易行，同时也可以进行多种不同的染色。
在生物成像中，荧光染色技术的具体应用有很多，下面这些是其中的一些例子：1. 显微镜技术中的荧光染色技术在显微镜技术中，荧光染色技术常常被用来标记靶向特定蛋白质或细胞结构的分子探针，从而实现对细胞过程和分子机制的观察和研究。
例如，多个研究中都曾利用螢光標記來觀察蛋白質的表現、分佈和互動，這讓研究人員能夠更加深入地了解細胞內部的分子機制。
2. 荧光分子成像技术荧光分子成像技术是一种具有高灵敏度的非侵入性成像技术。
它能够利用荧光染色技术对肿瘤、心血管系统和神经系统等的生物组织进行成像，并为体内分子运动、聚集和交换的观察和研究提供了手段。
例如，利用荧光染色技术制备了磁性纳米颗粒，并成功用于细胞成像和癌症光动力治疗。
3. 荧光显微术技术荧光显微术是一种通过标记荧光物质对生物组织进行显微镜成像的技术，目前被广泛应用于生物学、医学和材料科学领域。
该技术利用荧光染色技术对特定目标标记进行成像，常用于研究生物体内的各种细胞、组织和器官结构，并为疾病的诊断和治疗提供了新的方法。
例如，荧光染色技术在神经移植中的应用，可以监测移植细胞的生命活动状态和分布位置，为治疗神经系统疾病提供了有力的工具。
总结一下，荧光染色技术作为一种重要的生物成像方式，在各种生物领域中具有广泛的应用前景。
双光子激光扫描荧光显微镜及其应用
表 1 几种常见荧光分子的单光子 、双光子 和三光子的吸收截面 3 [5 ]
荧光分子
δ1 (λ/ nm) / 10 - 16cm2
ηδ2 (700nm)
/ 10 - 50cm4·s / 光子
ηδ3 (700nm) / 10 - 83cm6·s2/ 光子2
DAPI free
113 (345nm)
Dansy1
TWO PHOTON LASER SCANNING FL UORESCENCE MICROSCOPY AND ITS APPL ICATIONS
CHEN De2Qiang XIA An2Dong WAN G Ke2Yi HUAN G Wen2Hao
( Depart ment of Precision M achi nery and Inst rument ation , U niversity of Science and Technology of Chi na , Hef ei 230026)
图 1 单 、双光子激发过程示意图
图 2 单 、双光子激发所形成的荧光形貌 (样品为罗丹明 B 的水溶液. 上为单光子激发 ,下为双光子激发)
3 材料的吸收截面 δ
吸收截面 δ是双光子激发现象的重要参数 , 它 的大小反映了分子吸收双光子的本领. 对单光子激 发中的吸收截面 δ已有较为准确的文献记载 , 而对 双光子乃至多光子吸收截面 δ,目前尚缺乏全面 、准 确的记载. 因此 ,对常用的荧光分子多光子吸收截面 δ和光谱的进一步研究 , 将有助于多光子激发共焦 激光扫描荧光显微镜的进一步广泛应用.
·232 ·
2 双光子激发原理简介
在激光照射下 ,基态荧光分子或原子吸收一个 光子后成为激发态 ,随后又弛豫到某一基态 ,同时以 光子形式释放能量而发出荧光. 这一过程就是通常 的单光子激发情况. 1931 年 ,Maria G ppert - Mayer 预言一个分子或原子可以在同一个量子过程中 ,同 时吸收两个光子而成激发态 ,这种情况就是双光子 激发过程[2 ] . 1961 年 , Kaiser 等在 CaF2 ∶Eu2 + 晶体 中首次观察到了这种双光子激发现象[3 ] . 图 1 简单 地描述了这种双光子激发的过程. 比如在单光子激 发情形 ,NADH 酶在 350nm 的光激发下产生 450nm 的荧光 ,而在双光子激发情形 , NADH 酶则需同时 吸收两个 700nm 的光子才能产生 450nm 的荧光. 这 就是说 ,双光子技术可以使我们无需使用紫外光源
显微操作技术-----荧光显微镜技术的特点和应用.
第十二页，共二十五页。
DAPI
染色原理：
DAPI 为一种荧光(yíngguāng)染料，可以穿透细胞膜与
细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比 DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染 色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细
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• 3荧光染料染色(rǎnsè)：
应用含荧光色团的物质作为染料，使与生物组织 中和该物质有特殊亲和力的成分相结合，即可被激 发荧光。这类染料称为荧光染料或荧色素。许多常 规染色剂(如刚果红、曙红、碱性品红、水溶性苯胺 蓝等)兼有荧光染料的性能
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1.DNA研究(yánjiū)
第九页，共二十五页。
• 它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不同
(bù tónɡ)颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与
RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有膜通 透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在 荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核 呈绿色或黄绿色均匀荧光。
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2.温度的影响
温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降时，介质的 粘度增大，荧光物质(wùzhì)与分子的碰撞也随之减少，去活 化过程也减少，则荧光强度增加。相反，随着温度上升， 荧光物质(wùzhì)与分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加， 则荧光强度下降。
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荧光显微镜技术(jìshù)的特点和应 用
第一页，共二十五页。
荧光 显微镜的种类 (yíngguāng)
超高分辨率荧光显微镜
研究重点在于分子间如何相互作用、组装形成 复合物。
1.通过观察蛋白质之间的组合关系来了解它们 的作用，并能为后续的细胞功能试验打下基础 2.SR成像有助于人们更好地了解分子间的差异 3.SR成像技术还能用于在单分子水平研究蛋白 动态组装过程
图3-1 蛋白质组装示意图
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应用前景
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基于点扩散函数调制的超分辨技术
环状光的孔径理论上可以通过增加激光强度无限缩小 获得一个小于衍射极限的荧光激发点
更改了阿贝的衍射极限公式:
d
2nsin 11/ l
可见，随着 I 的增加，STED 技术的分辨 率可以无穷小
16
基于点扩散函数调制的超分辨技术贡献
2000 年，用一束激光激发荧 光分子发光，再用另一束环状 激光消除激发光周边的荧光， 通过二维点扫描实现了超高分 辨率成像，将光学显微镜分辨 率提高了近 10 倍实现了 1994 年提出的想法
在生物领域的应用一直没有发展
后期努力均在远场条件下发展
10
超高分辨率显微成像
几种超高分辨显微成像技术原 理示意及成像结果
超高分辨率显微成像——一般指在远场条件下基
于荧光的、“突破”衍射极限的光学显微成像技
术
荧光——物质吸收光照后发出的一类光
成为
低背景：利用了荧光发射光波长比吸收光波长较 生物
长这一重要原理，通过光路设计，分开激发光和 学研
荧 发射光，大幅降低了成像的背景
究中
光 高灵敏度：结合灵敏的检测器件，在优化条件下， 最常
显 微 镜
荧光显微镜还可以检测单个荧光分子发出的极其 微弱的荧光，成为单分子成像的最佳选择，其发 展也奠定了这次诺贝尔化学奖的半壁江山
《显微成像》课件
《显微成像》ppt课 件
REPORTING
2023
目录
• 显微成像技术简介 • 显微镜的种类与特点 • 显微成像技术的基本原理 • 显微成像技术的应用实例 • 未来显微成像技术的发展趋势与挑战
2023
PART 01
显微成像技术简介
REPORTING
显微成像的定义与原理
显微成像定义
显微成像技术是一种利用光学系 统对微小物体进行放大，并将其 转化为可观察图像的科学技术。
材料科学
环境科学
在材料科学领域，显微成像技术用于观察 材料微观结构、晶体形态、表面形貌等， 有助于材料性能的优化和改进。
环境科学领域中，显微成像技术用于观察 微小生物和污染物的形态和分布，有助于 环境监测和污染治理。
2023
PART 02
显微镜的种类与特点
REPORTING
光学显微镜
总结词
光学显微镜是最早的显微镜形式，它使用可见光和透镜来放大样品。
详细描述
目前的光学显微镜已经达到了相当高的分辨率，但仍然受到光的衍射极限的限制。未来 可以通过采用超分辨技术、光子晶体、量子点等新型材料和技术，突破衍射极限，实现 更高的分辨率。同时，利用新型的探测器、荧光染料/探针和信号放大技术，可以提高
成像的灵敏度和动态范围，从而更好地捕捉和区分微小细节和弱信号。
土壤与水体中微小颗粒物分析
通过显微成像技术观察土壤和水体中微小颗粒物的形态、大小、分布等特征，有助于环境质量评估和污染防治。
2023
PART 05
未来显微成像技术的发展 趋势与挑战
REPORTING
高分辨率与高灵敏度成像技术
总结词
随着科学研究的深入，对显微成像的分辨率和灵敏度的要求越来越高，未来将不断涌现 出更高分辨率和高灵敏度的成像技术。