荧光显微成像系统的原理及构成
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构 显微镜操作规程
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。
紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。
成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。
以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。
由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。
把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。
激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。
基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
荧光显微技术
• 1.分子标记
利用绿色荧光的发光机制，可将 GFP作为蛋白质标签(protein tagging)，即利用DNA重组技术， 将目的基因与GFP基因构成融合基 因，转染合适的细胞进行表达，然 后借助荧光显微镜便可对标记的蛋 白质进行细胞内活体观察
2.药物筛选
荧光显微镜的基本结构
滤光片
荧光显微 镜
隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。 激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见 波长 的光域，提供合适的激发光。 吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光 透过，保护眼睛。
荧光显微镜的基本结构
荧光显微镜
光路
透射光：照明光线从 标本下经聚光器透过 标本进入物镜。 落射光：照明光线从 标本上经垂直照明器 落射到标本，经标本 反射进入物镜。
(9)通过粗、细螺旋调整焦距。
(10)打开与显微镜连接的计算机，点击 数码成像系统软件，采集数码图像。
2.注意事项
(1)因观察荧光使用的光源为高压汞灯，其中发出的光含紫 外光，对人眼有损害作用，故必须安装紫外防护罩。 (2)为延长汞灯寿命，打开汞灯后不可立即关闭，以免水银 蒸发不完全而损坏电极，一般需要等15分钟后才能关闭。 (3)汞灯熄灭后待完全冷却才能重新启动，否则灯内汞蒸气 尚未恢复到液态，内阻极小，再次施加电压，会引起短路， 导致汞灯爆炸。这样不仅损坏电器，更重要的是汞蒸气溢 出，将导致工作室污染。故关闭汞灯之后，不能马上再次 打开，必须等待至少30分钟。
封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色 透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较亮，不 易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作 封裱剂。 （五）镜油
显微荧光成像技术
显微荧光成像技术生命科学是一个充满活力的领域，包括生物学、医学、农学、生态学等诸多分支。
显微镜是生命科学研究中不可或缺的工具之一，而显微荧光成像技术则是显微镜技术的重要分支之一。
本文将围绕显微荧光成像技术展开阐述。
一、显微荧光成像技术的基本原理显微荧光成像技术是利用荧光分子在吸收一定波长的光后，能够发出较长波长（即红外、红光、黄光）的光的特性，来探测并分析样品中各种微观结构与分子的分布情况和相互作用。
从理论上讲，这些分子在不受到荧光激发的情况下是不会发光的。
因此，要实现荧光成像需要通过激发、显微观测、成像三个步骤来完成。
激发环节是荧光成像技术的起点。
荧光分子必须要由波长与其吸收光谱相吻合的光子作用下，才能在其内部发生电子的跃迁，发出荧光信号。
一般而言，荧光分子的激发波长与发射波长是不同的。
由此，通过双光子荧光激发技术，可以用一种比传统荧光显微镜的短波长更长的激发波长来对样品进行激发，使荧光分子针对测量目的进行有选择性的激发，大大减少光伤害，同时增加激光的渗透深度，解决深部显微成像的问题。
显微观察环节是荧光成像技术的重点。
显微荧光成像技术基于荧光分子的发射特性，即它们可以在可见光谱的较长波长区域发射出光，这种现象可以被显微镜观察到。
在显微荧光成像系统中，将样品置于显微镜下，并通过荧光染料激发样品，然后通过适当的荧光滤波器对荧光发射信号进行过滤，最后将信号捕获并显示在荧光显微镜上。
成像环节是荧光成像技术的末端。
荧光显微成像系统可以将荧光信号反射到图像传感器（如CCD）上，捕获图像数据，使用显微荧光成像图像处理软件对获得的图像数据进行分析和处理，处理结果可以被投影或与其他数据交互的形式展现。
二、显微荧光成像技术的应用显微荧光成像技术应用广泛，包括生命科学、药学、医学、农业、食品工业、生态学等领域。
一些具体的应用如下：1、生命科学领域显微荧光成像技术广泛应用于生命科学领域，它可以被用来研究生物体在不同行为状态下的荧光响应，如酶活性、细胞间相互作用、细胞家族、组织结构、线粒体功能等，进一步揭示生物体的结构、功能和相互作用等相关生物学问题。
荧光显微镜的原理和使用方法
• 2.1 荧光显微镜旳基本装置及其光路
•
荧光显微镜因制造厂家、型号旳不同，构造
各异，但主要构件，基本相同。
• 2.1.1光源:采用高压汞灯。汞灯能以最小旳表面 发出最大数量旳紫外光和蓝光，且光亮度大，光
度稳定。汞灯旳构件，中间为一球形石英玻璃管， 有两个钨电极，内充汞滴和少许氩氖混合气体。 汞灯装在牢固旳灯室中，有调中、聚焦和集光装 置。使用中禁止频繁启闭，点亮后欲暂停使用时，
不可切断电源，可用光阀阻断光路。当汞灯熄灭 后，不能立即点亮，经5～10min，汞灯冷却后再 通电点亮。
•
HBO200Ｗ汞灯旳发射光谱为200～600nm，
• 视场光阑旳调整使用：视场光阑位于孔径光阑 之后，亦由外露手杆操纵。视场光阑用于限定样 品表面旳照明区域，其开度一般应与孔径光阑旳 开孔相当。
• 辅助激发滤色镜滑动阀旳使用:滑动阀位于镜臂 专用槽中，可拉出或推入。有三个挡位供不同使 用。全拉出位：供常规使用；中间位：用于Ｂ激 发法，辅助滤色镜进入光路；全推入位：用作光 阀，阻断全光线．
• 某些物质经波长较短旳光线照射后，分子被激活， 吸收能量后呈激发态。其能量部分转化为热量或 用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长旳 光能形式辐射出来，这种波长长于激发光旳可见 光称作荧光。生物体内有些物质受激发光照射后 可直接发出旳荧光，称为自发荧光（如叶绿体中 旳叶绿素分子受激发所发出旳火红色旳荧光）； 本身不发荧光，在吸收荧光染料之后所发出旳荧 光称为次生荧光。常用旳荧光染料涉及丫啶橙、 荧光素、罗丹明、GFP、PI、PE、DAPI等。
《超分辨率荧光显微成像技术》
点光源光斑的半高宽
• 其中I是STED 激光器的最大聚焦强度，而I sat 则是当受激荧光强度被减少到1/e时的STED
激光的强度特征值。由此公式可看出，当I/Isat 的值趋近无穷大时，STED 成像的点光源的
半高宽趋近于0，即分辨率不再受光的衍射过
Advatange and Disadvantage
• RESOLFT能够反映出样本的细节，而传统 共焦显微镜做不到。
• 这种“耐疲劳”可切换的探针虽然可以在 荧光和黑暗状态之间来回切换很多次,但仍 然有限,大大妨碍了使用RESOLFT在生物成 像的应用。
近场光学成像技术
传统的光学理论，如几何光学、物理光学等，通常 只研究远离光源或者远离物体的光场分布，一般统称 为远场光学。远场光学在原理上存在着一个远场衍射 极限，限制了利用远场光学原理进行显微和其它光学 应用时的最小分辨尺寸和最小标记尺寸。
a.利用柱面镜增强PALM在z轴分辨率 b.利用液晶空间光调制器增强PALM在z轴分辨率 Science, 2008, 319(5864): 810～813 Proc Natl Acad SciUSA, 2009, 106(9): 2995～2999
多重平面成像
三维成像的另一种办法是将两个或者多 个不同聚焦层面的图像同时送入 CCD中， 提取三维信息。利用这个 原理 ， Hess 和 Bewersdorf 小组开发出来双层 PALM 技 术．
The Rayleigh criterion ① choosing very short wavelengths (UV, x radiation
in the case of electromagnetic fields or more efficiently, propagating electrons); ② working in very high index materials for increasing n. increasing the aperture angle of the microscope
光片荧光显微成像技术
光片荧光显微成像技术摘要：光片荧光显微成像技术因其独特的优点，受到广泛关注。
从光片荧光显微镜基础入手，介绍成像原理、发展历史、研究现状及应用展望。
关键词：显微成像，荧光成像；光片照明引言显微成像技术是现代生物医学研究的重要技术手段之一，显微荧光成像技术因其特异性标记及高灵敏度高对比度的成像，而受到广泛地应用。
光片荧光显微镜一种特殊的荧光显微镜，其显著提高了传统荧光显微镜的三维成像速度，降低了光漂白以及光毒性，使得科学家们能够长时间地观察生理状况下组织细胞的生命活动，对生命科学的研究具有重要意义。
1.光片显微镜的历史显微镜是一种古老的光学仪器，历经几百年发展，形成了多个分支，广泛地应用生命科学的各个领。
荧光显微镜是利用物质荧光特性进行观察的光学显微镜，具有检出能力高、能进行多重着色观察的特点，广泛地应用于生物医学领域。
长期以来，传统荧光显微镜受限于阿贝衍射极限，分辨率都不能突破200nm；其次，激发光的光漂白及光毒性无法实现样本的长时间观察；再者，常用于活细胞研究的共聚焦荧光显微镜的成像速度太慢；无法满足生物医学研究快速成像、高分辨的要求。
薄片光的概念最早是在1903年提出的，然而直到1993年Voie才用薄片光的原理开发了正交面荧光光学切片显微镜)，样品由薄片光扫瞄成像。
二十一世纪以来，光片照明显微镜发展非常迅速，由于采用面探测的成像方式，光片照明系统能够快速获得高分辨率的三位层析结构成像，和共聚焦相比，对整体标本的光毒性小，光漂白低，适合长时称活体成像。
2004年Stelzer发明了选择薄片光显微镜,SPIM可以三维高分辩率高穿透深度成像。
2008年Stelzer改进了SPIM，改进版的SPIM可以对斑马鱼胚胎进行24小时成像并追逐胚胎发育过程中的细胞位移和分裂。
2014年，光片荧光显微镜被Nature Mehtods列入十大新技术之列，深刻改变了生物医学观察方式。
2.成像原理及结构光片荧光显微成像技术，LSFM或者selective plane叫umination microscopy，SPIM）通过对光片激荧光的宽场成像，该技术综合了成像速度和空间分辨率的优势，极小的光损伤和光漂白，广泛应用于生物样品的长时间动态活体多维成像。
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
全内反射荧光显微术原理与应用1. 引言全内反射荧光显微术（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的显微技术，利用全内反射限制激光光束的传播范围，使其仅激发样品表面附近的荧光染料，并通过荧光显微镜观察和记录表面附近的高分辨荧光信号。
该技术具有高灵敏度、高空间分辨率和实时监测能力等优点，广泛应用于生命科学研究中。
本文将详细介绍TIRFM的原理和应用。
2. 全内反射原理光在由一个折射率较大的介质（如光具）射入折射率较小的介质（如空气）时，当入射光线的入射角大于一个特定的临界角时，光线将会完全发生反射，不再穿透进入折射率较小的介质中。
这个现象被称为全内反射（Total Internal Reflection，TIR）。
当一个光束从高折射率的物质射入低折射率的物质时，入射角大于临界角时，发生全内反射。
通过调控入射角，可以使光线沿着介面传播，从而形成衰减系数很小的光束。
这个现象可以被用来实现TIRFM的照明光路。
3. 全内反射荧光显微术系统TIRFM系统主要由以下几个部分组成：激光光源、调制器、目标镜、物镜、荧光滤光片、成像系统和数据采集分析系统等。
激光光源：一般使用高功率激光器，如氩离子激光器或二极管激光器。
激光通过光纤输入到光路系统中。
调制器：用于控制激光的工作模式，常用的包括振荡镜或振荡腔。
目标镜：一般是具有高折射率的玻璃片或光具，用于实现全内反射，常用的目标镜材料有石英、玻璃等。
物镜：用于聚焦激光到样品表面，并收集荧光信号。
物镜的选择要考虑到激光的聚焦效果和空间分辨率。
荧光滤光片：用于选择性地阻挡激发光和透射荧光信号。
成像系统：一般是荧光显微镜或全内反射显微镜。
能够观察并记录样品表面的荧光信号。
数据采集分析系统：可以对观察到的荧光图像进行实时处理和分析，如图像增强、图像叠加、荧光强度计算等。
4. TIRFM原理TIRFM的原理可以通过以下步骤进行解释：1.激光从物镜聚焦到样品表面。
荧光显微成像系统的原理及构成
荧光显微成像系统的原理及构成1.荧光染料：荧光显微成像系统通过荧光染料标记目标物体，使其发出荧光信号。
荧光染料通常是天然或合成的荧光性物质，其分子结构含有色团和荧光基团。
当荧光染料被激发光波长的光线照射后，其激发态电子跃迁至激发态，并在短时间内回到基态，释放出发射光子，形成荧光信号。
2.荧光显微镜：荧光显微成像系统使用荧光显微镜进行成像，荧光显微镜由光源、物镜、筛片轮、探测器等组成。
光源通常是弧光灯或LED，用于产生激发荧光染料所需的光的波长。
物镜具有高放大倍数和数值孔径，用于聚焦和收集荧光信号。
筛片轮可根据荧光染料的激发光波长进行选择，以过滤非目标光。
探测器可以收集和记录荧光信号，并进行图像处理与分析。
3.激发光源：激发光源是荧光显微成像系统的重要组成部分，用于产生适当波长的激发光，激发荧光染料发出荧光信号。
常见的激发光源包括白炽灯、汞灯、激光器和LED等。
不同的激发光源具有不同的波长和强度，可根据需要进行选择。
4.探测器：探测器用于收集和记录荧光信号，常见的荧光显微成像系统探测器包括光电倍增管、CCD相机和CMOS相机等。
其中，光电倍增管用于接收低强度的荧光信号，并通过电子放大将其转换为电信号；CCD相机和CMOS相机具有高灵敏度和分辨率，能够实时采集图像并记录。
1.样品台：样品台是放置生物样品的平台，通常由固定夹持装置和控制台组成。
固定夹持装置用于固定样品的位置，确保样品在成像过程中不移动或晃动。
控制台用于调节样品台的位置和倾角，以便选取最佳的成像角度。
2.激发系统：激发系统包括激发光源和筛片轮等组件，用于产生适当波长的激发光。
激发光源通常位于显微镜的下方或侧面，经由物镜进入样品。
筛片轮可根据需要选择不同的激发光波长，以过滤非目标光。
3.探测系统：探测系统包括物镜、滤光片和探测器等组件，用于收集和记录荧光信号。
物镜通过调节焦距和数值孔径，在样品上聚焦并收集荧光信号。
滤光片用于过滤非目标光，减少背景干扰。
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激发滤色片
激发光源
谢
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荧光显微镜的特点
●光源能供给大量特定波长范围的激发光， 光源能供给大量特定Байду номын сангаас长范围的激发光， 光源能供给大量特定波长范围的激发光 使受检标本内的荧光物质能获得必要强度 的激发光 ●具备相应的滤光镜系统。 具备相应的滤光镜系统。 具备相应的滤光镜系统
荧光显微镜的种类
●透射式 透射式 ●落射式 落射式
荧光显微成像系统的原理及构成
原理
●普通光学显微镜 普通光学显微镜 通过普通光源的照明观察标本 ●荧光显微镜 荧光显微镜 利用一定波长的光， 利用一定波长的光，激发显微镜下标本内 的荧光物质， 的荧光物质，使之发射荧光
什么是荧光？ 什么是荧光？
●物质吸收的短波光，发射出的长波光 物质吸收的短波光， 物质吸收的短波光 ●特点：荧光波长>激发光波长 特点：荧光波长 激发光波长 特点 荧光强度<<激发光强度 荧光强度 激发光强度 有不同程度的衰减
CCD种类 扫描方式 种类-扫描方式 种类
●面阵或面扫描（Area Arrays）： 面阵或面扫描（ 面阵或面扫描 ） 可以在一次曝光中以任意快门速度捕捉动 体，创建二维的影像 主要应用在高阶数码相机、 主要应用在高阶数码相机、监视器和摄录 像机等
CCD种类 扫描方式 种类-扫描方式 种类
●线阵或线扫描（Linear Arrays）： 线阵或线扫描（ 线阵或线扫描 ）： 排成一排的像素构成， 排成一排的像素构成，逐行扫描成像 获取彩色图像时，为了分别得到RGB三基色 （获取彩色图像时，为了分别得到 三基色 的信息，需要扫描三次，每次对应一种颜色） 的信息，需要扫描三次， 适合获取静态图像， 适合获取静态图像，分辨率高
CCD
主要功能： 主要功能： •光信号转电信号 光信号转电信号 •电信号转成数字信号 电信号转成数字信号 •配合计算机形成影像 配合计算机形成影像
CCD概念 概念
●CCD Charged Coupled Device: 电荷耦合元件 大量的独立的光敏元件排列在一起 每个光敏元件称为像素 ●像素 像素 图像的基本单位：最小的视觉显示单位. 图像的基本单位：最小的视觉显示单位
●物镜 物镜 各种物镜均可应用， 各种物镜均可应用，但最好使用消色差的 物镜 提高荧光图像的亮度， 提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的 物镜 ●目镜 目镜 在荧光显微镜中多用低倍目镜， 在荧光显微镜中多用低倍目镜，如5×和 × 6.3× ×
荧光图像的记录方法
荧光显微镜所看到的荧光图像具有： 荧光显微镜所看到的荧光图像具有： 形态学特征和荧光的颜色、 形态学特征和荧光的颜色、亮度 判断结果时， 判断结果时，必须将二者结合起来综合判断 记录结果：主观指标（即工作者目力观察） 记录结果：主观指标（即工作者目力观察） 客观指标（细胞分光光度计、 客观指标（细胞分光光度计、图像 分析仪等） 分析仪等）
CCD结构及工作原理 结构及工作原理
●CCD结构 结构 • 感光二极管（Photodiode） 感光二极管（ ） • 并行信号寄存器（Shift Register） 并行信号寄存器（ ） -用于暂时储存感光后产生的电荷 用于暂时储存感光后产生的电荷 • 串行信号寄存器（Transfer Register） 串行信号寄存器（ ） -用于暂时储存并行寄存器的模拟信号并 用于暂时储存并行寄存器的模拟信号并 将电荷转移放大 • 信号放大器 用于放大微弱电信号 信号放大器-用于放大微弱电信号 • 数摸转换器 将放大的电信号转换 数摸转换器-将放大的电信号转换 成数字信号
CCD 种类 传输方式 种类-传输方式
全帧（Full Frame） -感光元件产生电信号 -电荷转移到串行寄存器 -放大、数摸转换、数字信息 动态范围宽 信噪比高 分辨率高 成像速度慢 必须借助机械快门控制暴光量
CCD 种类 传输方式 种类-传输方式
全转（Full Fransfer） -综合Full Frame和Interline Transfer特点，在器件上划分感光 区和寄存区 -暴光和数据转移可以同时进行 保证单位像素上的感光面积 保证了拍摄速度
T%
●滤色系统 滤色系统 激发滤色镜： 激发滤色镜：选择激发光的波长 吸收滤色镜：透过荧光， 吸收滤色镜：透过荧光，阻挡杂光 ＜B 完全阻挡激发光通过） （完全阻挡激发光通过）
T%
nm
阻挡
＞B 透过
●分色镜 分色镜 反射激发光， 反射激发光，透过荧光
T%
＜A 反射
＞A 透过
●暗场聚光镜 暗场聚光镜 来自下面光源的光线经过暗场聚光镜， 来自下面光源的光线经过暗场聚光镜，形成 了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。 了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。 因此视野是暗的
CCD 种类 传输方式 种类-传输方式
隔行传输式（Interline Transfer） -感光元件产生电信号 -电荷转移到并行寄存器 -电荷从并行寄存器转移到串行寄存器 -串行寄存器将电信号转到模拟寄存器 -放大、数摸转换、数字信息 快速-暴光和数据读出可同时进行 可采用软件控制的电子快门工作 动态范围小
CCD种类 扫描方式 种类-扫描方式 种类
●三线（Tri-Linear Sensor）： 三线（ 三线 ）： 排成三排的像素构成， 排成三排的像素构成，每一排对应一种基 色（RGB） ） 不用扫描三次， 不用扫描三次，且能得到很高的分辨率和 色域
CCD与显微镜的连接 与显微镜的连接
生物标本 物镜 吸收滤色片
荧光显微摄影技术
由于荧光很易减弱褪色， 由于荧光很易减弱褪色，要及时摄影记录 结果， 结果，所以荧光显微镜摄影技术对于记录荧光 ● 图像十分必要。 图像十分必要。 ● 因紫外光对荧光猝灭作用大， 因紫外光对荧光猝灭作用大，所以曝光速 速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。 速度太慢，就不能将荧光图像拍摄下来。 ● 一般研究型荧光显微镜都有半自动或全自 动显微镜摄影系统装置，或用 动显微镜摄影系统装置，或用CCD与计算机连 与计算机连 将图像存在计算机硬盘上。 接，将图像存在计算机硬盘上。
透射荧光显微镜原理图
目镜
吸收滤色镜 物镜
标本
暗场聚光镜 激发滤色镜
汞灯
落射荧光显微镜原理图
吸收滤色镜
汞
灯
分色镜 物 镜 激发滤色镜
标 本
荧光显微镜的主要部件
透射式
●汞灯光源 ●激发滤色镜 ●暗场聚光镜 ●吸收滤色镜
落射式
●汞灯光源 ●激发滤色镜 ●分色镜 ●吸收滤色镜
各部件介绍
●光源 光源 多采用200W的超高压汞灯作光源 多采用 的超高压汞灯作光源 提供激发光（紫外和蓝紫光） 提供激发光（紫外和蓝紫光）