超分辨荧光显微技术原理
超分辨显微镜的工作原理和应用
超分辨显微镜的工作原理和应用随着科技的飞速发展，人们对于微小的物体的研究越来越深入。
在过去，显微镜可以提供的最高分辨率为200nm左右，然而很多细胞和物质需要更高的分辨率才能被准确的研究。
超分辨显微镜(deconvolution microscopy)因而被应运而生，它的分辨率可以达到20nm以下，是传统显微镜的10倍以上。
下面，本文将为你介绍超分辨显微镜的工作原理和应用。
一、超分辨显微镜的工作原理超分辨显微镜的工作原理是使样品产生的荧光分子处于暗区域退回到明亮区域，通过这种方法，显微镜能够获取比传统显微镜更清晰的图像。
在超分辨显微镜之前，由于空气折射率的限制，显微镜无法将细胞成像到更高的分辨率。
超分辨显微镜通过不同的方法打破了这个技术障碍。
例如，受到今天最先进的高清电视和摄像机技术的启发，超分辨显微镜使用一种称为激发的荧光分子反转的技术（Stimulated Emission Depletion，简称STED）来实现高分辨率显微成像。
基本上，STED方法是通过在激光束之间使用减少荧光过程的抵消光束来使荧光分子处于暗区域"退回"到明亮区域的。
荧光物质只能在光束中的明亮区域发光，当光束聚焦到小于荧光分子的空间大小时，荧光分子会产生干扰，使得分辨率变得模糊。
为了解决这个问题，STED技术增加了所有光束之间的强烈相互作用，目的是将荧光分子拉回到它们本应该出现的明亮区域。
这使得STED显微镜能够放大高达20nm以下的样品。
二、超分辨显微镜的应用超分辨显微镜的应用涵盖了许多生命科学领域，从细胞核到分子水平都有广泛的应用。
（一）细胞功能研究超分辨显微镜的分辨率可以揭示小分子的扩散、细胞器动力学和蛋白质亚细胞位置，在细胞功能研究中有着重要的应用。
例如，在分子分布的研究中，超分辨显微镜可以帮助研究人员观察受体和离子频繁转位的过程。
该技术还可以用于研究神经元的突触功能，因为它可以检测小型生物分子如神经递质的扩散情况。
超分辨显微技术的原理和应用
超分辨显微技术的原理和应用随着生物学和医学研究的深入，越来越多的问题需要解决，例如细胞和分子结构的研究。
传统显微镜的分辨率受限制，无法同时观察到细胞内的多种分子机器。
因此，生物学家和医学家们需要发展更为先进的显微技术来研究更加复杂的生物结构和过程。
超分辨显微技术应运而生，在生物领域得到了广泛的应用。
本文将介绍超分辨显微技术的原理和应用。
超分辨显微技术的原理在传统显微镜中，光的波长限制了分辨率。
在最好的情况下，传统显微镜的分辨率约为200纳米。
超分辨显微技术则利用各种物理现象或化学反应来提高分辨率。
超分辨显微技术的原始形式是荧光显微镜。
荧光显微镜的原理是受到生物体或化合物吸收的特殊形式的光谱突变，可以使它们发射出可见的荧光光。
这种显微镜可以照射样本并观察荧光的分布。
但是，荧光显微镜分辨率仍然不足以分辨细胞内多种分子结构。
为了克服这个问题，科学家开始使用现代的超分辨显微技术，例如：刺激发射荧光显微镜（STED）、受限制的光学刺激取幅显微学（RESOLFT）、脆性光学限制显微镜（PALM）和单分子光学氧化（SMOX）等技术。
STED是一种使用激光的超分辨显微镜技术。
STED的激光束可以使样本中的分子跳跃到另一种状态。
然后，用另一束激光照射样本，使带有较高能量的分子部分退回最初的状态。
这种技术的分辨率可以达到20 - 30纳米，比荧光显微镜的分辨率要高得多。
RESOLFT技术的原理是在一小部分样本上同时照射两个激光。
一个激光束使样品发生化学反应，并改变其形状。
而另一个激光束可以清楚地观察样本中的分子结构。
与STED类似，RESOLFT的分辨率也达到了20 - 30纳米。
PALM和SMOX技术使用单纯的光学方法来观察细胞和分子结构。
PALM技术涉及到拍摄一系列小的图像，每个图像里只有一部分荧光标记。
这样可以使细胞的所有部分都看到。
用这些图像可以很容易地将所有图像拼接在一起，形成清晰的图像。
SMOX技术则涉及单分子测量。
超分辨显微镜的工作原理与成像技术
超分辨显微镜的工作原理与成像技术超分辨显微镜是一种先进的光学显微镜，具有很高的分辨率和成像能力，可以观察到微观领域中细小的结构和现象。
本文将介绍超分辨显微镜的工作原理和成像技术，以及其在生物医学、材料科学和纳米技术等领域的应用。
一、工作原理超分辨显微镜的工作原理基于曲折规律和波的衍射。
传统光学显微镜由于照明光束的衍射限制，无法分辨出比光的波长还要小的物体细节。
而超分辨显微镜通过使用特殊的技术，克服了这一限制。
1.1 衍射极限传统光学显微镜的分辨率受到衍射极限的限制。
衍射极限（称为耐克斯特准则）是由德国物理学家安德烈亚斯·耐克斯特提出的，规定了光学系统能够分辨物体的最小尺寸，即0.61倍的照明光波长。
超过这个极限，显微镜就无法分辨出物体的细节。
1.2 超分辨技术超分辨显微镜采用了多种技术来突破衍射极限，实现更高的分辨率。
其中最常见的技术包括：1.2.1 利用荧光标记超分辨显微镜可以通过利用荧光标记结合合适的成像技术，将被观察物体的特定部分标记出来，并对其进行成像。
这些标记物在光的刺激下会发出荧光信号，通过检测和分析这种信号，可以实现纳米级的分辨率。
1.2.2 利用近场效应近场光学显微镜利用装载在探针尖端的金属纳米结构，利用探针与样品之间的极短距离来增强照明光的局部电场，从而实现超分辨成像。
这种技术在表面等离子激元共振和原子力显微镜中得到广泛应用。
1.2.3 利用建构性干涉通过将两束光进行干涉，可以在显微镜中形成特定的干涉模式。
这种模式包含了被观察物体的高频细节信息。
运用适当的算法和数学处理，可以从干涉模式中提取出高分辨率的图像。
二、成像技术超分辨显微镜采用多种成像技术来获取高分辨率图像。
以下是几种常用的成像技术：2.1 结构光成像结构光成像利用相干光束通过物体表面，通过记录物体与光束的相互作用，实现高分辨率的三维成像。
利用这种技术，可以获得具有亚微米分辨率的物体表面拓扑图像。
2.2 荧光成像荧光成像是利用带有荧光标记的样品在激发光线照射下发出的荧光信号进行成像。
超分辨荧光显微技术原理
超分辨荧光显微技术原理传统的荧光显微镜受到瑞利准则的限制，即其分辨率受到光学波长和透镜的限制。
超分辨荧光显微技术则通过创新的方法克服了这一限制，实现了超分辨率的荧光成像。
1.非线性显微技术：传统的荧光显微技术采用的是线性成像原理，即通过样品中的荧光物质发射的线性荧光信号来获得图像。
而超分辨荧光显微技术采用非线性成像原理，利用荧光物质的非线性光学效应，提高了分辨率。
例如，通过激光器的脉冲激发，可以使荧光物质在非线性荧光效应下发射高阶谐波信号，从而得到更高分辨率的图像。
2.相干显微技术：传统的荧光显微技术采用的是非相干光源，无法获取相干光的相位信息，从而限制了分辨率的提高。
而超分辨荧光显微技术采用相干光源，如激光光源或可调谐激光器，使得可以获取到样品的相位信息，从而提高了分辨率。
例如，通过在激光束上加入相位调制，可以在信号中提取出相位信息，从而实现更高的分辨率。
3.显微镜改进：传统的荧光显微镜在透镜、光路和探测器等方面都存在一定的限制，无法实现超分辨率成像。
超分辨荧光显微技术通过改进显微镜的设计和构造，例如采用高数值孔径物镜、自适应光学元件和高速探测器等，可以克服这些限制，提高分辨率。
4.数据分析和算法：超分辨荧光显微技术的数据量较大，需要进行大量的图像处理和分析。
通过使用高级算法和计算方法，可以将大量数据进行处理和重建，得到超分辨率的图像。
例如，通过拟合和重建点扩散函数，可以实现超分辨率的成像。
超分辨荧光显微技术的应用非常广泛，涵盖了生物医学、材料科学和纳米技术等领域。
例如，在生物医学领域，超分辨荧光显微技术可以用于观察和研究细胞结构、分子过程和疾病发展等，为生物医学研究提供了重要的工具。
在材料科学领域，超分辨荧光显微技术可以用于材料表征和纳米结构研究，为材料科学的发展和应用提供了有力支持。
总之，超分辨荧光显微技术通过创新的光学方法和图像处理算法，突破了传统荧光显微技术的分辨率限制，实现了超分辨率的荧光成像，为生物医学和材料科学等领域的研究提供了重要工具。
超分辨率荧光显微技术的原理和进展
超分辨率荧光显微技术的原理和进展超分辨率荧光显微技术是一种用于观察细胞和生物分子的显微镜技术，具有比传统荧光显微镜更高的分辨率，可以更清晰地分辨出细胞和生物分子的结构和功能。
其原理基于物理学原理和计算机算法，通过精确的荧光标记和高分辨率成像技术，实现了对生物结构的超分辨率观察。
本文将介绍超分辨率荧光显微技术的原理和进展。
1.超分辨率荧光显微技术的原理抑制光的衍射：传统光学显微镜无法突破维恩衍射极限，限制了其分辨率。
超分辨率荧光显微技术利用光的非线性响应和光学调制技术，使得衍射限制得以突破。
例如，利用单分子荧光显微技术，可以将荧光标记的分子在时间上进行“开关”，只有少数分子发出荧光，可以精确定位每个分子的位置。
利用这种方法，可以获得超分辨率的图像。
图像重建算法：超分辨率荧光显微技术还依赖于一系列图像处理技术，如重建算法和数据解析算法。
这些算法能够在获得低分辨率图像的基础上，通过处理和分析图像数据，恢复出高分辨率的图像。
常见的算法有结构光超分辨率显微镜（SR-SIM）、单分子定位显微镜（SMLM）等。
这些算法通过统计学原理和概率分析等方法，提高图像的分辨率和清晰度。
2.超分辨率荧光显微技术的进展（1）结构光超分辨率显微镜（SR-SIM）：这种技术是利用结构光的干涉原理，通过调整光源的相位和频率，实现对样本的超分辨率成像。
SR-SIM技术能够将样本的分辨率提高到约100 nm，从而观察到更细微的结构。
（2）单分子定位显微镜（SMLM）：SMLM技术利用荧光标记的分子在时间上进行“开关”，只有少数分子发出荧光，可以精确定位每个分子的位置。
通过收集大量分子的位置信息，可以恢复出高分辨率图像。
SMLM 技术的分辨率可以达到10 nm左右，成为最高分辨率的超分辨率显微技术之一（3）受限激发荧光显微镜（STED）：STED技术是一种利用激光束的光强分布来抑制荧光的发射，从而实现超分辨率成像的方法。
STED技术的分辨率可以达到几十纳米，可以观察到更小的细胞结构和分子组装。
超分辨荧光成像技术
受激发射损耗显微技术（STED）
原理：通过受激发射损耗的方式来改变荧光基团发射荧光的区域，借助受激 辐射过程中的非线性效应，压缩 PSF，突破衍射极限对分辨率的限制实现超 分辨成像。
受激发 能级图
xy 平面STED 显微镜压缩 PSF的示意图
STED 显微 L1 镜的结构
L0
A. S1最低能级的荧光分子遇到 波长与基态和激发态能级差相匹 配的光子就会发生受激辐射回到 基态，失去发荧光的能力。 B.STED 显微镜借助波长相对于 激发光红移的STED 光来压缩 PSF。 C.STED 光产生的圆环光斑是中 心强度为零而中心以外区域强度 不为零的圆环光斑。
2.彩色成像。用不同颜色的荧光分子对标记研究对象，选 取恰当的激发光，就能区分细胞内的不同结构，分析结构 间的相互作用。
3. 3D成像：借助像散成像技术获得观测对象的Z轴信息， 可获得生物大分子的STORM3D图像。
STORM的缺点
由于需要反复激活-猝灭荧光分子，所以使得实验大多数在 固定的细胞上完成。即使是在活细胞上进行的实验，也不 易获得足够高的时间分辨率。
超分辨荧光显微镜术
分辨率
光激活定位显微技术
1nm
随机光学重构显微技术
20-30nm
受激发损耗显微技术
大约50nm
饱和结构照明显微技术 径向 100 nm 、轴向 约200 nm
可逆饱和线性荧光跃迁（RESOLFT）
原理：可逆光饱和转移过程。
转移截面大小
图 1 RESOLFT过程的原理图
A→B的转移过程可以由入射光来驱动。而反转移过程 B→A 可以由任 意形式的能量来驱动，如光、化学反应、热能，甚至是自发辐射等。
PALM成像方法的点扩散函数成像仍与传统显微成像一致，时间 分辨率低。
超分辨显微技术原理和应用场景
超分辨显微技术原理和应用场景随着科技的不断进步，超分辨显微技术已经成为了现代科学研究中不可或缺的工具。
它可以让我们更加深入地观察和理解生命、物质等领域中的微小细节，为现代科学研究提供更加精确和丰富的数据信息。
一、超分辨显微技术的原理超分辨显微技术是指一系列可以对物质进行高分辨率观察的技术。
这些技术可以让我们在显微镜下看到更加微小的细节，比传统显微技术更加精细。
超分辨显微技术的原理主要有以下几种：1. 结构照明技术结构照明技术通过在样品前加上特殊的光学器件，改变照明光线的传播途径和相位，从而实现更加精细的成像。
2. 荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术可以用来在单个分子甚至分子集合中的精细定位。
3. 光学斑点技术光学斑点技术是一种通过奇异光束在样品中产生光学斑点的技术。
这种技术可以实现极高的空间分辨率和时间分辨率。
它是超分辨显微技术中最常用的一种。
二、超分辨显微技术的应用超分辨显微技术的应用非常广泛，包括材料科学、生命科学、纳米技术等领域。
下面我们就来看一下超分辨显微技术在不同领域中的应用。
1. 生命科学超分辨显微技术在生命科学中有非常广泛的用途，它们可以让我们更加精细地观察细胞、分子和生物体的内部结构。
其中最广泛使用的超分辨显微技术是荧光显微技术。
荧光显微技术可以用于观察体内特定分子的分布和作用，例如蛋白质、核酸等。
2. 材料科学超分辨显微技术在材料科学中也有广泛的应用。
材料科学中的核心问题之一是探索材料的微观结构和性能，以便更好地设计新型材料。
超分辨显微技术可以提供非常精细的材料结构和性能信息，为材料科学的发展提供了重要的支持。
3. 纳米技术纳米技术是一种基于纳米尺度物质构建和制造的技术。
由于纳米尺度的特殊性质，纳米技术在生物医学、材料科学等领域中有广泛的应用。
超分辨显微技术可以提供非常精细的纳米材料成像，为纳米技术的研究和发展提供重要的支持。
总之，超分辨显微技术的应用和研究已经成为现代科学研究中的重要分支之一。
几种超分辨率显微术原理及对比
各厂家超分辨技术1、莱卡公司采用的超分辨技术STED2000年，德国科学家StefanHell开发了另一种超高分辨率显微技术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率．当特定的荧光分子被比激发波长长的激光照射时，可以被强行猝灭回到基准态．利用这个特性，Hell 等开发出了受激发射损耗显微技术(stimulatedemissiondepletion,STED)．其基本的实现过程如图2所示，就是用一束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋白)发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率,原理见下图。
STED成像技术的最大优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，因此在生命科学中应用更加广泛.2、蔡司公司采用的超分辨技术PLAM2002年，Patterson和Lippincott‐Schwartz首次利用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种(PA‐GFP)来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹．这种荧光蛋白PA‐GFP在未激活之前不发光，用405nm的激光激活一段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿色荧光．德国科学家EricBetzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2006年9月，Betzig和Lippincott‐Schwartz等首次在Science上提出了光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)的概念．其基本原理是用PA‐GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子．在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来．之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环．这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位．将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，原理如下：PLAM通过定位细微结构乃至单分子，实现 20 nm 的横向分辨率和 50 nm 轴向分辨率。
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超分辨荧光显微技术原理Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT2014年的诺贝尔理综奖颁发给了“超分辨荧光显微技术”。
也许接下来的几天，媒体会关注StefanHell、EricBetzig二人的传奇经历，或者另一名华人女科学家与该奖项失之交臂的遗憾。
但是八卦之外，这项成果背后的科学本身也非常有意思。
这里面有三个关键词：“超分辨”、“荧光”和“显微技术”，我希望能够解释清楚以下几个问题，尤其是后两个问题：1.为什么需要（光学）显微技术？2.为什么光学显微镜的分辨率存在理论极限？3.用怎样的方法可以突破这个理论极限以达到“超分辨”为什么这个理论极限可以被突破？5.为什么非得是荧光显微技术，而非普通的明场（透射光）显微技术？1.采样定理与显微镜我们用肉眼观察或者用相机拍摄一个物体时，物体上的每一个细微的点都会在眼睛的视网膜或是相机的感光芯片上成像。
那么我们为什么不能看到细菌等微小的东西，为什么不能把照片无限放大以看清远处树木上面的每一片叶子呢？这个问题的答案比较简单：因为组成视网膜的每一个感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）、相机芯片上的每一个感光元件（CCD、CMOS等）都是有大小的。
比如视网膜中央凹区域的视锥细胞直径平均约为5微米。
而由于奈奎斯特-香农采样定理的限制，视网膜上能分清的两个相邻像点的距离是视锥细胞直径的两倍，即10微米。
再结合眼球的构造，大致可以推断出，在距离眼睛25厘米的位置，我们能分辨物体上相距为80微米的两个点，换算成点阵密度就是大约320ppi，这也是苹果所谓“视网膜屏”分辨率的来历。
如果要观察小于80微米的物体，比如细菌，就需要先将物体放大，再用眼睛或者相机观察。
现代光学显微镜的构造其实非常简单，样品放置在物镜的焦点处，从样品上发射或散射的光经过物镜变成平行（准直）光，再经过一个结像透镜，然后会聚到相机的感光芯片上成像。
按照前面的方法来推算，要区分物体上相距为200纳米的两个点，如果使用科研级相机，比如最近火起来的sCMOS相机（每个感光像素尺寸为微米），只需要使用放大倍率为65倍的物镜就足够了。
那么是否可以通过提高物镜的放大倍率来观察低于200纳米的物体，比如细胞里面微管呢？答案是不可以。
2.光学衍射极限由于光是一种电磁波，具有衍射和干涉的特性。
图1.光学显微镜简化示意图如上面的简图所示，紫色箭头表示的物体PQ经过物镜等之后在相机上成像为P'Q'。
由于光的衍射，物体上的点如P、Q，在相机上并不是单独的点，而是一个个有一定大小的斑，被称为夫琅禾费衍射斑（或称艾里斑），如右侧的同心圆所示。
那么，当P'、Q'相距太近的时候，两个斑会叠加导致难以分辨。
这就要求物体上的P、Q要相距一定的距离。
1873年，德国物理学家、卡尔蔡司公司的恩斯特·阿贝（ErnstAbbe）首次推算出衍射导致的分辨率极限。
根据瑞利判据——“当一个像斑的中心落到另一个像斑的边缘时，就算这两个像刚好能被分辨”，显微镜能分辨的物体上两点P、Q的最小距离h为：这个公式就是光学显微镜的分辨率公式，或称为光学衍射极限。
（注意此处的分辨率与通常说的显示器分辨率含义不同）其中，为光的波长，n为物方的折射率，为物体与物镜边缘连线和光轴的夹角。
如上图所示。
为方便起见，其中的通常称为数值孔径，简写为NA。
摄影领域常用f/#或称光圈值来描述镜头，光圈值与数值孔径可以相互换算。
对于一枚光圈为的镜头来说，数值孔径为，其分辨能力约微米。
目前常用的高倍物镜NA最大为，可以算出，对于可见光，比如波长500纳米的绿光，显微镜的分辨率约为200纳米。
所以，即使再提高物镜的放大倍率，也不能提高显微镜的分辨率。
而200纳米这个数值也就通常被称作衍射极限。
.光学衍射极限的动态范围从上面的公式可以看到，光学衍射极限其实并不是一个具体的数值，如果改变上述公式中的参数，是可以有效提高分辨率的。
(1)光的波长可见光波长范围是400~760nm，如果使用更短波长的光，比如紫外线，理论上可以提高分辨率。
但是紫外线能量高，易损伤样品，而且透射能力低，很难透过物镜。
人们想到了使用高能电子束代替光束，比如200keV的电子对应的的布罗意波长为纳米（*米）。
虽然NA相对较小（约为10°），依然可以达到纳米的理论分辨率。
这就是电子显微镜的基本原理。
严格的说，电镜的分辨率依然限制在光学衍射极限的范围内。
只不过这里的“光学”是“电子光学”。
(2)物方折射率n空气折射率为1，水的折射率，玻璃折射率。
目前主要的物镜都是玻璃材质，并在物镜与样品之间用与玻璃折射率一致的油来浸润，以提高分辨率。
2012年Olympus发布了一款NA高达的物镜，光学部分使用蓝宝石（折射率约）制作，并搭配高折射率的镜油（目测成分应该是二碘甲烷Methyleneiodide）。
也许在未来能发明比玻璃更好的材料，折射率更高、易于制作透镜、并且能找到高折射率的油，这样就能进一步提高分辨率。
比如用钻石（折射率大约）打造一枚土豪物镜，并找到同样折射率的透明液体，分辨率可以提高到倍。
当然，由于成本及工艺因素，目前尚不现实。
(3)孔径角看起来的最大值是90°，但是如果在样品的上下两面都放置物镜，相机同时收集这两个物镜中的光呢？这种方法就是StephenHell在1991年发明的4Pi显微技术。
此时衍射极限的公式稍有变化，分辨率能提高一倍。
简单理解，限制分辨率的一个原因是从物体上向四面八方发射的光线在经过透镜时，由于透镜大小（孔径）的限制，所以很多光线没有经过物体，其承载的物体的“信息”丢失了。
而4Pi其实是通过两个物镜收集了更多的光及“信息”。
每个高NA的物镜离物体都非常近，所以几乎能收集到各个角度的光，这也是4Pi这个名称的来历——一个以物体为球心的球体其立体角的大小就是。
另一种“结构照明显微技术（SIM）”很聪明地通过类似摩尔纹的原理，获取到更多“信息”，也可以将分辨率提高一倍。
解释原理需要用到傅里叶光学，在此就不详述了。
它由已故的MatsGustafsson教授于2000年发明。
那么问题来了，是否还有办法“真正”突破衍射极限，使之并不受限于这个公式呢？3.突破光学衍射极限前面的公式推导过程中，有两个隐含条件。
第一个隐含条件是需要用到夫琅禾费衍射，而它也是有条件的，它要求物体与像平面之间的距离远远大于光的波长。
这个条件称为远场条件。
如果离物体足够近，衍射极限便不遵循上述公式。
研究波长以内光传播特性的领域叫近场光学。
EricBetzig在1986年发明的近场扫描光学显微技术（NSOM）就是使用距离物体远小于波长的光学探针来扫描物体，以达到超分辨的显微图像。
4.超分辨荧光成像另一个条件则非常隐蔽。
这也是为什么本次诺奖会颁发给几乎没做过超分辨显微技术的WilliamMoerner的原因。
首先简单插播一下荧光成像的原理：荧光分子（如获得2008年的诺贝尔理综奖的绿色荧光蛋白GFP）在吸收一个高能量的短波长（如蓝光，称为激发光）跃迁到高能态之后，很快会发射一个低能量的长波长（如绿光，称为发射光）光子回到基态能级。
所以我们可以用蓝光照射样品上标记的GFP，而接收其发射的绿光，来对物体进行成像。
这样的一个好处就是图像对比度会非常高，只有带有GFP的部位会被成像，其它部位都是黑色。
每个荧光分子的发光是完全独立的。
WilliamMoerner的工作就是推动了对单个分子的成像等研究。
回到前面说的第二个隐藏条件，它假定了图1中的物体上的两点P、Q同时发光，所以二者的衍射斑才会叠加在一起导致难以区分。
但如果P、Q是在不同的时间分别发光，那么可以（通过点扩散函数拟合或者去卷积的方法）精确地定位到每个衍射斑的中心点位置P'、Q'。
那么也就不存在这样的衍射极限了，理论上即使P、Q相距再近都可以被分别定位而加以区分。
更进一步，广义地来说，只要是P、Q两点处在可以探测到的不同状态或是不同特征，那么就可以超越衍射极限。
分辨率并不仅仅是关于波的，而且是关于不同状态的！"Resolutionisaboutwavesandstates."--byStefanHell意识到了这一点，就可以发明很多种真正突破衍射极限的显微技术了。
比如：(1)区分荧光分子的不同构象/能态荧光分子处在不同构象或能态时，可以发射不同波长的光子，或者不发光。
受激发射耗损显微术（STED）：激发光周围套上一圈耗损光，使中心区域的荧光分子处于激发态发光，周围的分子处于耗损态不发光。
这样可以使图1中的同心圆表示的衍射斑变小，以此来区分两个相距在衍射极限以内的分子。
这个方法由StefanHell在1994年发明。
随机光学重构显微术（STORM）、光活化定位显微术（PALM）、荧光活化定位显微术（fPALM）：它们的共同特征是使样品中每次仅有少量随机、离散的单个荧光分子发光，通过拟合，找出每个荧光分子中心点的位置。
重复拍摄多张图片之后，就可以把所有荧光分子的中心点位置叠加起来形成整幅图像。
这些技术是由庄小威、EricBetzig等人在2006分别独立发明的。
图2.庄小威发明的STORM超分辨光学成像效果图。
a,b为传统光学显微镜拍摄，c,d为相同区域经STORM技术拍摄并重构。
b,d为a,c的局部放大。
图中的结构是细胞内的支架——微管蛋白。
图片来自。
RESOLFT：由于STED中，耗损光需要很强的亮度，激光器造价昂贵，而且对样品损伤较大，如果借鉴STORM/PALM/fPALM的原理，不需要使周围分子处于“耗损态”，而是采用类似于STORM等的特殊荧光分子，用较弱的光强使其处于其它能态，也可以实现超分辨。
这也是StefanHell发明的。
(2)荧光分子闪烁的不同周期SOFI：有些荧光分子在持续的激发光照射下，并不是持续发光，而是会闪烁。
由于每个荧光分子随机闪烁的时间不一样，可以通过连续拍摄一段录像，分析比较图像中每个像素点记录到的荧光强度在这段时间内的闪烁情况，来区分不同的荧光分子，实现超分辨。
2009年发明。
(3)荧光分子的极性/朝向不同SPoD/ExPAN：荧光分子都是偶极子，可以理解成有着不同的朝向。
当用不同朝向的偏振光激发时，荧光分子的亮度也会随之不同。
可以周期性地改变偏振光朝向，连续拍摄一段录像，分析比较图像中每个像素点荧光强度的周期变化情况，来区分不同荧光分子，实现超分辨。
2014年发明。
……STED/RESOLFT的理论分辨率与激发光、耗损光强度有关；STORM/PALM与单个荧光分子发射的光子数有光；SOFI/SPoD与相机的像素尺寸有关（采样定理决定）。
在固定的波长、NA下，理论上的分辨率依然可以达到任意高。