几种超分辨率显微术原理及对比
超分辨率显微镜原理
超分辨率显微镜原理
超分辨率显微镜是一种通过克服传统显微镜的分辨率限制，能够达到更高分辨率的显微镜技术。
其原理主要基于超分辨率成像方法，包括以下几种常见方法：
1. 点扩散函数重建（PSF Reconstruction）：该方法通过量子点等微小发光点的扩散效应，测量系统的点扩散函数（PSF），
并利用逆过程重建样品的高分辨率图像。
通过巧妙选择合适的激发强度和探测方式，可以有效地提高显微镜的分辨率。
2. 结构光显微镜（Structured Illumination Microscopy，SIM）：该方法利用具有特殊图案结构的光源照射样品，通过高频投影的多个子光束和频率分析技术，得到叠加图像，从而在频域上提高了分辨率。
SIM可以将衍射极限下的分辨率提高约2倍。
3. 刺激发射退火显微镜（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED）：该方法利用激光在大约50纳米范围内
激发荧光标记物，然后通过使用另一束特定的激光束使被激发的标记物发生受激发射退火（STED），从而限制只有核心激
发点发光，提高了分辨率。
4. 单分子定位显微镜（Single Molecule Localization Microscopy，SMLM）：该方法利用碰撞助熄灭的性质，使被标记的单个分子在短暂亮起的过程中精确地定位，通过多个分子的多次定位获得高分辨率的图像。
SMLM能够将分辨率提高到纳米级别，并广泛应用于生物学研究。
这些超分辨率显微镜原理的引入，使得科研人员在微观世界中获得了更为清晰、准确的图像，从而更深入地理解生物学和物理学的相关问题。
超分辨率显微技术在生物学中的应用
超分辨率显微技术在生物学中的应用在现代生物学领域中，高分辨率成像技术已经成为了许多研究人员不可或缺的工具。
当前，超分辨率显微技术的发展为生物学研究提供了一种更高层次的解析度，使得研究人员可以准确地研究细胞和分子的结构和功能。
本文将从超分辨率显微技术的基本原理、常见类型及其应用三个方面，阐述超分辨率显微技术在生物学中的应用。
一、超分辨率显微技术的基本原理在光学显微镜中，我们通常认为光的衍射限制了我们对样品进行高分辨率成像。
也就是说，衍射极限使得我们无法分辨非常接近物体的结构。
而超分辨率显微技术的基本原理在于突破了这样的衍射极限，这使得我们可以有效地在亚细胞和分子尺度上解析细胞结构及其功能。
比如，在超分辨率显微技术的条件下，分辨率可以达到几个纳米的级别。
超分辨率显微技术可以实现如下两种方式：1. 结构光显微镜结构光显微镜的基本原理在于通过固定的光学模板形状来形成高分辨率学术。
通过光学模板重复的投影，结构光显微镜可以捕捉到样品的细微结构。
它是第一批实现超分辨率的显微镜之一。
今天，像调控点扩散测量法（SPDM）、多相结构光显微镜（PRISM）和峰值SMLM等结构光显微镜技术已经非常成熟。
2. 单分子定位显微镜法单分子定位显微镜法（SMLM）使用一个荧光蛋白，使其可以放置在组织中的一个确定位置。
因为可以确定这些荧光蛋白的位置，再利用计算技术恢复像素信息。
单分子定位显微镜法是一种透过特定的发光标记，予以单颗粒探测、定位并重建成图像。
这种技术还包括“闪烁局部化显微镜”（PALM）、“发光局部化显微镜”（FPALM）和“灰度局部化显微镜”（STORM）。
二、常见超分辨率显微技术及其应用超分辨率显微技术的发展已经为细胞学和分子生物学领域带来了许多的优势。
这种技术被广泛用于观察各种类型的细胞器、蛋白质和DNA分子，从而揭示了它们的细节和结构。
这些技术可以直接揭示生物学现象的机制，并且可以为新型药物开发提供新思路。
以下是几种常见的超分辨率显微技术及其应用：1. 结构、功能和分子分析超分辨率显微技术可以帮助生物学家解析细胞和分子结构的细节。
超分辨荧光显微技术原理
超分辨荧光显微技术原理传统的荧光显微镜受到瑞利准则的限制，即其分辨率受到光学波长和透镜的限制。
超分辨荧光显微技术则通过创新的方法克服了这一限制，实现了超分辨率的荧光成像。
1.非线性显微技术：传统的荧光显微技术采用的是线性成像原理，即通过样品中的荧光物质发射的线性荧光信号来获得图像。
而超分辨荧光显微技术采用非线性成像原理，利用荧光物质的非线性光学效应，提高了分辨率。
例如，通过激光器的脉冲激发，可以使荧光物质在非线性荧光效应下发射高阶谐波信号，从而得到更高分辨率的图像。
2.相干显微技术：传统的荧光显微技术采用的是非相干光源，无法获取相干光的相位信息，从而限制了分辨率的提高。
而超分辨荧光显微技术采用相干光源，如激光光源或可调谐激光器，使得可以获取到样品的相位信息，从而提高了分辨率。
例如，通过在激光束上加入相位调制，可以在信号中提取出相位信息，从而实现更高的分辨率。
3.显微镜改进：传统的荧光显微镜在透镜、光路和探测器等方面都存在一定的限制，无法实现超分辨率成像。
超分辨荧光显微技术通过改进显微镜的设计和构造，例如采用高数值孔径物镜、自适应光学元件和高速探测器等，可以克服这些限制，提高分辨率。
4.数据分析和算法：超分辨荧光显微技术的数据量较大，需要进行大量的图像处理和分析。
通过使用高级算法和计算方法，可以将大量数据进行处理和重建，得到超分辨率的图像。
例如，通过拟合和重建点扩散函数，可以实现超分辨率的成像。
超分辨荧光显微技术的应用非常广泛，涵盖了生物医学、材料科学和纳米技术等领域。
例如，在生物医学领域，超分辨荧光显微技术可以用于观察和研究细胞结构、分子过程和疾病发展等，为生物医学研究提供了重要的工具。
在材料科学领域，超分辨荧光显微技术可以用于材料表征和纳米结构研究，为材料科学的发展和应用提供了有力支持。
总之，超分辨荧光显微技术通过创新的光学方法和图像处理算法，突破了传统荧光显微技术的分辨率限制，实现了超分辨率的荧光成像，为生物医学和材料科学等领域的研究提供了重要工具。
超分辨率显微镜的原理和应用
超分辨率显微镜的原理和应用超分辨率显微镜是一种重要的科学仪器，它可以观察到微小到几纳米甚至更小的结构，帮助我们更好地理解物质和生命的基本原理。
本文将介绍超分辨率显微镜的原理和各种应用。
一、超分辨率显微镜的原理传统光学显微镜受到光的衍射极限的限制，无法观察到小于光波长的结构。
而超分辨率显微镜利用的是几种各具特点的技术，突破了光学显微镜的分辨率极限。
1. 点扩散函数重构技术点扩散函数是指一个点光源在成像平面上的像的强度分布，是光学系统成像性能的度量指标。
超分辨率显微镜利用一种称为点扩散函数重构技术的方法，通过控制样品与显微镜镜头之间的距离和形状，使得点扩散函数重合，从而获得高分辨率的图像。
2. 直接结构重建技术直接结构重建技术是通过对样品进行照射，利用样品本身的发光或散射产生的信号，进行三维重建，从而获取超分辨率图像。
这种方法需要高度精确的光学元件和灵敏的探测器，但可以在不破坏生物样品的情况下进行高分辨率成像。
3. 显微镜成像技术超分辨率显微镜也可以通过多种成像技术实现高分辨率，如近场光学显微镜、荧光共振能量转移显微镜等。
这些技术利用样品对光的相应规律进行探测，可以实现纳米级别的分辨率。
二、超分辨率显微镜的应用超分辨率显微镜的应用十分广泛，尤其在生命科学、材料科学和纳米科技等领域。
1. 生命科学生命科学研究中，超分辨率显微镜可以用于观察生物分子、蛋白质和细胞等对象。
例如，超分辨率显微镜可以研究细胞内分子的位置和运动，揭示生物分子相互作用和信号传导的机制。
另外，超分辨率荧光显微镜还可以用于观察单个分子的动态过程和病毒在细胞内的行为。
2. 材料科学超分辨率显微镜在材料科学领域也有广泛的应用。
它可以观察到纳米级别的材料结构和形貌，揭示各种物理和化学过程的机理。
例如，超分辨率显微镜可以研究纳米颗粒的形貌、大小分布和属性，以及材料在热处理和机械应力下的变化情况。
3. 纳米科技超分辨率显微镜在纳米科技领域的应用十分重要。
超分辨率显微镜的原理及应用
超分辨率显微镜的原理及应用超分辨率显微镜是现代生物医学领域中最为重要的技术之一，它可以对细胞和生物结构进行高分辨率成像，从而揭示其分子结构和功能，对生物学和医学研究具有重要的意义。
本文将介绍超分辨率显微镜的原理和应用。
一、超分辨率显微镜的原理传统的显微镜在成像时受到了瑞利判据的限制，即两个点之间的最小可分辨距离等于光的波长。
由于光的波长极小，因此限制了显微镜的成像能力。
而超分辨率显微镜则利用了物理学的一些原理，实现了具有超分辨率成像能力的显微镜。
超分辨率显微镜的原理主要有三种：近场光学显微镜、刺激发射/受体显微镜和结构光遥感显微镜。
1. 近场光学显微镜近场光学显微镜是利用近场光学原理实现的一种超分辨率成像技术。
在普通显微镜中，物体发出的光通过物镜后，进入物镜的后焦面，再通过目镜进入眼睛。
而近场光学显微镜则将样品放在探针的顶端，利用探针末端的纳米尖端，对样品进行扫描成像。
由于探针末端的尖端与样品非常接近，可以通过控制探针的运动，实现对样品进行高分辨率成像。
相比传统显微镜，近场光学显微镜的分辨率可以达到几纳米的水平。
2. 刺激发射/受体显微镜刺激发射/受体显微镜是一种基于荧光成像的超分辨率成像技术。
传统的荧光显微镜在成像时受到了瑞利判据的限制，因此无法达到超分辨率成像的效果。
而刺激发射/受体显微镜则利用了刺激发射的原理，通过对样品中的发光分子进行单个激发，实现对样品进行高分辨率成像。
刺激发射/受体显微镜可以实现几十纳米甚至更高的分辨率。
3. 结构光遥感显微镜结构光遥感显微镜是另一种超分辨率显微镜技术。
它是基于双光子激发和结构光投影的原理，通过投射一个高频的结构性光束到样品上，使样品只发生双光子吸收和发射，在控制激光束的强度和相位下，获得高分辨率的图像。
结构光遥感显微镜可以达到亚细胞级别的高分辨率成像。
二、超分辨率显微镜的应用超分辨率显微镜在生物医学研究中具有重要的应用价值，主要包括以下几个方面：1. 细胞器和亚细胞结构的研究超分辨率显微镜可以对细胞器和亚细胞结构进行高分辨率成像，对生物学和医学研究具有极大的意义。
超分辨显微技术原理和应用场景
超分辨显微技术原理和应用场景随着科技的不断进步，超分辨显微技术已经成为了现代科学研究中不可或缺的工具。
它可以让我们更加深入地观察和理解生命、物质等领域中的微小细节，为现代科学研究提供更加精确和丰富的数据信息。
一、超分辨显微技术的原理超分辨显微技术是指一系列可以对物质进行高分辨率观察的技术。
这些技术可以让我们在显微镜下看到更加微小的细节，比传统显微技术更加精细。
超分辨显微技术的原理主要有以下几种：1. 结构照明技术结构照明技术通过在样品前加上特殊的光学器件，改变照明光线的传播途径和相位，从而实现更加精细的成像。
2. 荧光共振能量转移技术荧光共振能量转移技术可以用来在单个分子甚至分子集合中的精细定位。
3. 光学斑点技术光学斑点技术是一种通过奇异光束在样品中产生光学斑点的技术。
这种技术可以实现极高的空间分辨率和时间分辨率。
它是超分辨显微技术中最常用的一种。
二、超分辨显微技术的应用超分辨显微技术的应用非常广泛，包括材料科学、生命科学、纳米技术等领域。
下面我们就来看一下超分辨显微技术在不同领域中的应用。
1. 生命科学超分辨显微技术在生命科学中有非常广泛的用途，它们可以让我们更加精细地观察细胞、分子和生物体的内部结构。
其中最广泛使用的超分辨显微技术是荧光显微技术。
荧光显微技术可以用于观察体内特定分子的分布和作用，例如蛋白质、核酸等。
2. 材料科学超分辨显微技术在材料科学中也有广泛的应用。
材料科学中的核心问题之一是探索材料的微观结构和性能，以便更好地设计新型材料。
超分辨显微技术可以提供非常精细的材料结构和性能信息，为材料科学的发展提供了重要的支持。
3. 纳米技术纳米技术是一种基于纳米尺度物质构建和制造的技术。
由于纳米尺度的特殊性质，纳米技术在生物医学、材料科学等领域中有广泛的应用。
超分辨显微技术可以提供非常精细的纳米材料成像，为纳米技术的研究和发展提供重要的支持。
总之，超分辨显微技术的应用和研究已经成为现代科学研究中的重要分支之一。
几种超分辨率显微术原理及对比
⼏种超分辨率显微术原理及对⽐各⼚家超分辨技术1、莱卡公司采⽤的超分辨技术STED2000年，德国科学家StefanHell开发了另⼀种超⾼分辨率显微技术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑⼤⼩，从⽽直接减少点扩散函数的半⾼宽来提⾼分辨率．当特定的荧光分⼦被⽐激发波长长的激光照射时，可以被强⾏猝灭回到基准态．利⽤这个特性，Hell 等开发出了受激发射损耗显微技术(stimulatedemissiondepletion,STED)．其基本的实现过程如图2所⽰，就是⽤⼀束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋⽩)发光的同时，⽤另外的⾼能量脉冲激光器发射⼀束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将第⼀束光斑中⼤部分的荧光物质通过受激发射损耗过程猝灭，从⽽减少荧光光点的衍射⾯积，显著地提⾼了显微镜的分辨率,原理见下图。
STED成像技术的最⼤优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，因此在⽣命科学中应⽤更加⼴泛.2、蔡司公司采⽤的超分辨技术PLAM2002年，Patterson和Lippincott‐Schwartz⾸次利⽤⼀种绿⾊荧光蛋⽩(GFP)的变种(PA‐GFP)来观察特定蛋⽩质在细胞内的运动轨迹．这种荧光蛋⽩PA‐GFP在未激活之前不发光，⽤405nm的激光激活⼀段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿⾊荧光．德国科学家EricBetzig敏锐地认识到，应⽤单分⼦荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋⽩的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2006年9⽉，Betzig和Lippincott‐Schwartz等⾸次在Science上提出了光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)的概念．其基本原理是⽤PA‐GFP来标记蛋⽩质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表⾯，⼀次仅激活出视野下稀疏分布的⼏个荧光分⼦，然后⽤488nm激光照射，通过⾼斯拟合来精确定位这些荧光单分⼦．在确定这些分⼦的位置后，再长时间使⽤488nm激光照射来漂⽩这些已经定位正确的荧光分⼦，使它们不能够被下⼀轮的激光再激活出来．之后，分别⽤405nm和488nm激光来激活和漂⽩其他的荧光分⼦，进⼊下⼀次循环．这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分⼦的精确定位．将这些分⼦的图像合成到⼀张图上，最后得到了⼀种⽐传统光学显微镜⾄少⾼10倍以上分辨率的显微技术，原理如下：PLAM通过定位细微结构乃⾄单分⼦，实现 20 nm 的横向分辨率和 50 nm 轴向分辨率。
超分辨显微镜的原理与应用
超分辨显微镜的原理与应用超分辨显微镜是一种专业显微镜，可以在微观尺度下获取高质量的图像。
它的原理是利用高分辨率的镜头和光学技术，以及计算机图像处理技术，将显微镜的分辨率提高到更高的水平。
本文将讨论超分辨显微镜的原理、不同类型的超分辨显微镜、以及它们在不同领域的应用。
1. 原理传统的显微镜分辨率受到光的衍射极限的限制，即衍射极限 =光波长/2倍数口径。
在可见光范围内，约为200nm。
这意味着，如果要观察更小的物体或细节，必须使用具有更高分辨率的显微镜。
超分辨显微镜通过控制光源，镜头和样品之间的距离，以及使用相干/非相干光等技术，来突破衍射极限，提高显微镜的分辨率。
其中一个超分辨技术是“局部化发光显微镜（STED）”。
它利用一个圆形光束，中心较亮，离中心越远光强越弱，将样品的荧光杂乱的发光压缩到仅微小的区域，然后只在需要的区域内发光，来取得超高分辨率的图像。
2. 类型超分辨显微镜有许多不同类型。
例如：（1）近场扫描光学显微镜（NSOM）：使用尖端放大光线并将其聚焦到样品表面，通过扫描探针与样品表面之间的交互，可以获得比传统显微镜更高的分辨率。
（2）荧光共焦显微镜（FLIM）：通过观察样品中发射的荧光，将物质的一些基本特性转化为显像检测。
FLIM 的目标是识别被标记的蛋白质并检测其位置和数量。
这是神经科学和生命科学领域中研究单个分子的最常用术语之一。
（3）结构光三维显微镜：使用光栅，如果满足振动条件，则会实现照明图案的重叠。
当将此技术与场深远比其深的荧光片复合使用时，可以获得高分辨率、三维成像。
（4）单分子显微镜（SMM）：可以捕获单个光点的显微镜技术，并因此提供高解析度、高灵敏度、高可扩展性并且适用于广泛的样品类型。
3. 应用超分辨显微镜可以在许多领域发挥作用。
其中一些包括：（1）药物研究：用于分析不同药物分子的数量、结构和活性，寻找更好的药物设计概念。
（2）生命科学：用于研究分子交互、细胞结构和生物过程，提供有关生命科学中基本生物物理学原理的理解。
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各厂家超分辨技术
1、莱卡公司采用的超分辨技术STED
2000年，德国科学家StefanHell开发了另一种超高分辨率显微技术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率．当特定的荧光分子被比激发波长长的激光照射时，可以被强行猝灭回到基准态．利用这个特性，Hell 等开发出了受激发射损耗显微技术(stimulatedemissiondepletion,STED)．其基本的实现过程如图2所示，就是用一束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋白)发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率,原理见下图。
STED成像技术的最大优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，因此在生命科学中应用更加广泛.
2、蔡司公司采用的超分辨技术PLAM
2002年，Patterson和Lippincott‐Schwartz首次利用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种(PA‐GFP)来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹．这种荧光蛋白PA‐GFP在未激活之前不发光，用405nm的激光激活一段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿色荧光．德国科学家EricBetzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2006年9月，Betzig和Lippincott‐Schwartz等首次在Science上提出了光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)的概念．其基本原理是用PA‐GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子．在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂
白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来．之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环．这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位．将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，原理如下：
PLAM通过定位细微结构乃至单分子，实现 20 nm 的横向分辨率和 50 nm 轴向分辨率。
大鼠少突胶质细胞线粒体
3、尼康公司采用的超分辨技术STROM和SIM
STROM:
2006年底，美国霍华德‐休斯研究所的华裔科学家庄晓薇实验组开发出来一种类似于PALM的方法，可以用来研究细胞内源蛋白的超分辨率定位．他们发现，不同的波长可以控制化学荧光分子Cy5在荧光激发态和暗态之间切换，例如红色561nm的激光可以激活Cy5发射荧光，同时长时间照射可以将Cy5分子转换成暗态不发光．之后，用绿色的488nm激光照射Cy5分子时，可以将其从暗态转换成荧光态，
而此过程的长短依赖于第二个荧光分子Cy3与Cy5之间的距离．因此，当Cy3和Cy5交联成分子对时，具备了特定的激发光转换荧光分子发射波长的特性．将Cy3和Cy5分子对胶联到特异的蛋白质抗体上，就可以用抗体来标记细胞的内源蛋白．应用特定波长的激光来激活探针，然后应用另一个波长激光来观察、精确定位以及漂白荧光分子，此过程循环上百次后就可以得到最后的内源蛋白的高分辨率影像，被他们命名为随机光学重构显微技术(stochasticopticalreconstructionmicroscopy,STORM)．2007年，他们进
一步改进STORM技术，发展了不同颜色的变色荧光分子对，可以同时记录两种甚至多种蛋白质的空间相对定位，从而阐明笼形蛋白clathrin形成的内吞小泡与细胞骨架蛋白之间的精确空间位置关系，两种颜色的分辨率都可以达到20～30nm,原理如下图：
STORM通过一对染料对通过随机发光空间定位，实现了XY 20 nm分辨率。
SIM:
改变光学的点扩散函数来突破光学极限的另一个方法是利用饱和结构照明显微技术(saturatedstructureilluminationmicroscopy,SSIM)．早在1963年，Lukosz和Marchand就提出了特定模式侧向入射的光线可以用来增强显微镜分辨率的理论2005年，加州大学旧金山分校的Gustafsson博士首先将非线性结构性光学照明部件引入到传统的显微镜上，得到了分辨率达到50nm的图像．SSIM技术的原理是将多重相互衍射的光束照射到样本上，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨率的信息.如图所示.
SIM通过结构照明莫尔纹原理实现了任何荧光染料都可以达到XY
100nm .
EMCCD拍摄 SIM拍摄
4、奥林巴斯公司采用的OSR技术
图像超分辨率重构(super resolution,SR)是指利用计算机将一幅低分辨率图像(low resolution,LR)或图像序列进行处理，恢复出高分辨率图像(high resolution，HR)的一种图像处理技术。
奥林巴斯超分辨技术通过高倍60X或者100X油镜通过缩小共聚焦上的针孔用强激光将样品扫描20~50次后通过软件进行运算重构，此技术存在一定的局限性：
1、必须使用高倍油镜低倍不适用
2、因缩小针孔需使用强激光对样品损伤比较大。
3、对样品扫描20~50次，样品荧光淬灭严重，更不适用于活细胞。
4、环境要求较高，在做20~50次的过程中因环境振动等引起最后
软件运算不准确。
5、共聚焦图片均为软件着色，不能做多色荧光标记，容易引起串
色。