突破衍射极限地超高分辨率成像技术发展 (修改)
光学超分辨成像技术研究
光学超分辨成像技术研究【前言】光学超分辨成像技术是指利用纳米结构材料或光学信息处理方法等手段，通过突破传统光学成像的衍射极限，实现对微观结构的高精度成像。
目前，超分辨成像技术已经成为科学研究和工业生产领域中必不可少的重要手段，对人类社会的发展具有重要的推动作用。
【技术原理】传统光学成像的分辨率受到衍射极限的限制，所谓衍射极限就是当光束传过一个缝隙或者通过某个物体时，光通过缝隙或物体边缘的衍射效应所产生的像差。
由于衍射效应的作用，传统光学成像系统所获得的成像图像不仅分辨率较低，而且无法直接显示出微观结构的真实信息。
超分辨成像技术通过采用不同的光学信息处理方法，减轻或避免光学衍射效应的影响，从而实现对微观结构的高精度成像。
目前，超分辨成像技术主要包括以下几种：1.近场光学显微技术近场光学显微技术是指通过利用探针与试样间的非接触作用，实现对微观结构的高分辨观测。
该技术主要应用于生物学、纳米科学、材料科学等领域中的微观结构的观测和研究。
常见的近场光学显微技术包括原子力显微镜、近场光谱学、近场输运显微镜等。
2.超分辨荧光光学显微技术超分辨荧光光学显微技术通过改变荧光标记分子的发射特性，实现对微观结构的高分辨成像。
该技术主要应用于生物学、医学等领域中的细胞和组织的成像和分析。
常见的超分辨荧光光学显微技术包括衍生自荧光簇的单分子定位技术、电子转移率显微镜、双光子荧光显微镜等。
3.计算光学成像技术计算光学成像技术是指通过数学计算和光学模拟技术对成像过程进行预测和仿真，实现对微观结构的高精度成像。
该技术主要应用于工业制造、无损检测等领域。
常见的计算光学成像技术包括逆问题算法、数学建模与仿真、统计建模等。
【应用前景】超分辨成像技术的应用前景广阔，涉及到物理学、化学、生物学、医学等多个学科领域。
未来，超分辨成像技术的发展方向主要包括以下几个方面：1.高分辨材料成像超分辨成像技术可以实现对材料的高分辨成像，为材料科学的研究和工业制造中的无损检测提供了有力的手段。
光学中的超分辨成像技术
光学中的超分辨成像技术超分辨成像技术是目前光学领域的一个热门话题。
光学成像是一种通过光学系统来获取目标物体信息的技术，而超分辨成像技术则是要在前者的基础上，提高成像质量，实现更加细节化的成像结果。
本文将结合理论和实践，对光学中的超分辨成像技术进行深入探讨。
一、超分辨成像技术的理论基础超分辨成像技术的核心在于一种叫做衍射极限的理论。
这个理论认为，在成像中，一个物体在图像中的最小分辨率受到了光波传播的限制，这个极限被称为衍射极限。
达到这个极限，我们才会得到正真意义上的清晰可见的图像。
而在衍射极限外的物体，则会被模糊掉，无法分辨。
为了突破这个限制，科学家们想到了各种办法。
其中主要的两种方法分别是超分辨率显微镜和衍射限制解析成像技术。
二、超分辨率显微镜超分辨率显微镜的发展是在1950年代初期，由Ernst Abbe首先提出的折射率为1.5-1.6的物质是作为透镜的极限。
这一发现将光学成像的空间分辨率极限确定为半波长大小（0.2μm的蛋白质、20-30nm的细胞分子等）。
在此之前的研究中，传统光学显微镜是无法观察到这样小的物体的。
所以人们想到了一些更微小的物体来作为显微镜，例如透射电镜，扫描电子显微镜等。
但是这些显微镜对进行成像的样品要求比较高，而透射电镜还会对样品造成伤害。
因此，人们开始研究超分辨率显微镜。
其中最早的一种是激光荧光显微镜（STED）。
激光荧光显微镜通过对样品进行扫描，然后让样品中的某一部分发光，并快速扫描激光束，从而得到图像。
但是传统荧光信号上的光子数量受到依赖荧光剂分子数目、照射光强度、模糊滤波器和探测器响应等多种因素的影响而受到限制。
为此，科学家通过选择特定波长的激光光束，并在中心光束周围加上一个形状特定的控制激励光束，进一步减小了荧光信号的尺寸。
STED显微镜与传统荧光显微镜相比，具有更高的空间分辨率和更高的信噪比，这意味着它可以获得更清晰的图像，并且可以获得对光学分辨率的一种比较好的突破。
超分辨成像技术的新发展
超分辨显微成像技术的新发展马利红引言人类获得信息的主要器官是眼睛，然而靠人眼观察客观事物的空间分辨率的极限约为4´米，客观世界中人眼不能分辨的所有细微结构称为微观世界。
显微成像技术将310-微观过程或结构成放大图像，以便于人眼能够直接观察。
研究微观世界所涉及的学科领域十分广泛，有生物、医学、材料科学、精密机械、微电子学、分子及原子物理、核物理等等，微观世界中细分的微量尺度原则上是无穷的，因而显微学是跨多学科的，其发展也是无止境的。
1665年，Robert Hooke用原始显微镜发现了池塘水中单细胞有机体，它的出现为人类打开了微观世界的大门。
光学显微镜由此成为历代生物学家的主要研究工具之一。
生物学家把显微镜作为一种主要工具来研究生物器官、组织和细胞，由此奠定了细胞学和组织学的基础，并对生物学、遗传学、微生物学、病理学和医学的发展起到了极大的推动作用。
但传统光学显微镜有以下两个主要缺点：(1)受衍射极限的限制，其分辨率与照明波长是同一个数量级，具有一个数值孔径(NA=nsin(q))的传统光学显微镜，分辨极限l，称之为瑞利判据；(2)由于使用的是场光源，观测到的是一个宽视野图像，为0.61/NA从而降低了信噪比，影响了图像的清晰度和分辨率。
随着生物医学、材料科学等的发展对显微提出了更高的要求，不仅希望其具有更高的分辨率，而且能对样品进行无损成像，甚至希望可观察其三维图像。
因此，传统的显微镜已不能满足要求。
电子显微镜的分辨率虽然远高于光学显微镜，但它需要在真空条件下工作，因此很难观察活的生物样品，另外电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。
电子显微镜、的局限以及高分辨显微的需求，迫使人们转向超经典衍射极限的光学超分辨理论和技术研究，利用新原理、新技术、新方法来实现光学高分辨力成像和检测。
第一节基于传统的Rayleigh分辨率意义下的超分辨理论光学系统的空间分辨率是一个非常有用的概念，但是关于它的具体定义和描述却有许多不同的见解。
光学衍射极限的突破
光学衍射极限的突破纪岚森，仵云龙，李岷池，贺杰（青岛大学物理科学学院2011级材料物理1班）摘要：由于光学衍射极限的存在，使得在电子科技上边很难达到人们期望的高分辨率，然而光学衍射极限并不是不能克服的。
除了减小光波长与增加孔径外，我们还可以通过改变光路来突破艾里斑衍射极限。
减小艾里斑在很多的方面都有极其重要的意义，这里讲述的是艾里斑对显微镜技术突破的一些介绍。
关键词：艾里斑，显微镜，光学衍射极限1引言：在大量的电子图像应用领域，人们经常期望得到高分辨率（简称HR）图像。
高分辨率意味着图像中的像素密度高，能够提供更多的细节，而这些细节在许多实际应用中不可或缺。
例如，高分辨率医疗图像对于医生做出正确的诊断是非常有帮助的；使用高分辨率卫星图像就很容易从相似物中区别相似的对象；如果能够提供高分辨的图像，计算机视觉中的模式识别的性能就会大大提高。
同时随着生命科学的迅猛发展三维光学显微技术也已经成为研究生命过程的一种极为有效的工具，但是传统的基于荧光共焦技术的成像方案受到光学衍射极限的限制，其横向和纵向的数量级均在百纳米，因而无法满足科学技术发展的需要，利用各种非线性光学荧光激发方案已经打破光学极限的方案已经实现，然而这种光路较为复杂，通过其他的方法构造出来的奇异光线也是能够实现科学家长期最求的三维远场光学的超分辨成像。
根据瑞利衍射极限任意的光学系统成像就会在像方产生一个光斑，而这个光斑是无法通过改变显微镜的结构来实现的，也就是说，无论是共焦显微镜或是宽场显微镜这个光斑都是存在的，而这个光斑就是我们所说的爱里斑(Airy disc) 由于光的波动性，光通过小孔会发生衍射，明暗相间的条纹衍射图样，条纹间距随小孔尺寸的减少而变大。
大约有84%的光能量集中在中央亮斑，其余16%的光能量分布在各级明环上。
衍射图样的中心区域有最大的亮斑，称为爱里斑。
爱里斑的角度与波长(λ)及小孔的直径(d)满足关系：sinθ=1.22λ/d，θ即第一暗环的衍射方向角（即从中央亮斑的中心到第一暗环对透镜光心的张角），因为θ角一般都很小，有sinθ≈θ，故θ≈1.22λ/d。
论如何突破光的衍射极限,提高光学及电子显微镜的分辨率
学显微镜的分辨率是 ２００ｎｍ。若要提高分辨率就要选择更小波 衍 射 图样 。
长 的电子显 微镜 ，分辨 率可达 ０．５ｎｍ。
为什 么光学显微镜的分辨率是受限于＇ Ⅱ丁见光的波长 ，就是
此光 学显 微镜 的分 辨 率是 ２００ｎｍ。若要 提 高分辨 率就要 选择 更 小波 长的 电子显 微镜 ，分辨 率可达 Ｏ．５ｎｍ。本 文探 讨如何 突破 广德
衍射 极 限 ，从 而提 高光学级 电子 显微镜 的 分辨 率 。
关键 词 ：光 的衍射 ；显微镜 分辨 率 ；提 高
中图分类 号 ：ＴＨ７４２
离 越小 ，分 辨率 越 大 。
于光波的波长时，光子容易绕射过去继续 向前直线传播或绕射
光 学显 微镜 的分辨 率是 受限 于可 见光 的波 长 ，就 是 说 当被 并 撞击 到障 碍 物边 缘 的 正 面或 背 面形 成 反射 从 而 形 成 偏 离 几
观察 的物体 小于 可见 光波长 １／２时 ，就无法 在被 观察 到 。因此 光 何 光学 中直 线传 播 的光 ，并在 屏幕 上 相叠 加 形成 的明 暗 条纹 的
时 ，光才能 发生 明显 的衍射 现象 。由于 可见光波 长范 围为 ４ｘｌ０－Ｔｍ 小于 可见光 波长 １／２时 ，就无法 在被 观察 到 ？
至 ７．７ｘｌ０－Ｔｍ之 间 ，所 以 日常生活 中很少 见到 明显 的光 的衍射 现 由 以上 实 验可 知 ：当 小孔 （窄缝 ）或 障 碍 物 的尺 寸 比光波 的
缝 、一 根细 丝时 ，可以清 楚地 看到 光的衍 射 。用单 色 光照射 时效 宽度 。当小 车的 宽度 大于公 路 的宽度 的时候 ，由于 空间 不够 ，车
果好 一 些 ，如果 用复 色光 ，则 看到 的衍射 图案 是彩 色 的。
超分辨成像方法研究现状与进展
超分辨成像方法研究现状与进展王超;张雅琳;姜会林;李英超;江伦;付强;韩龙【摘要】光电成像系统受到衍射极限和像元分辨率的制约,但研究者们从未停止过脚步来突破这一限制.本文介绍了近年来开展的各种超分辨成像方法和技术,包括应用于荧光显微成像的受激发射损耗技术、结构光照明技术、光激活定位技术与随机光学重构超分辨成像技术;可应用于显微系统、光存储与眼底成像的光瞳滤波技术与径向偏振光超分辨聚焦技术;应用于空间探测的合成孔径技术、光子筛成像技术、超振荡透镜技术、亚像元技术与焦平面编码技术.主要讨论了以上超分辨方法的原理、实现手段与目前发展水平.%Optical imaging system is limited by pixel resolution and diffraction limit,but the researchers try to solve this problem.Various super-resolution imaging methods and techniques in recent years are introduced,including STED technology,SIM technology,PALM technology and STORM technology for the fluorescence microscopy imaging;pupil filtering technology and radially polarizedsuper-resolution focusing technology for microscope,optical storage and retina imaging;synthetic aperture technology,photon sieve imaging technology,super oscillation lens technology,sub-pixel technology and focal plane coding technology for space detection area.The principle,the implementation means and the current development level of these super-resolution imaging methods were discussed.【期刊名称】《激光与红外》【年(卷),期】2017(047)007【总页数】8页(P791-798)【关键词】超分辨率;衍射极限;空间光学系统【作者】王超;张雅琳;姜会林;李英超;江伦;付强;韩龙【作者单位】长春理工大学空间光电技术研究所,吉林长春 130022;长春理工大学光电工程学院,吉林长春 130022;长春理工大学空间光电技术研究所,吉林长春130022;长春理工大学空间光电技术研究所,吉林长春 130022;长春理工大学空间光电技术研究所,吉林长春 130022;长春理工大学空间光电技术研究所,吉林长春130022;长春理工大学光电工程学院,吉林长春 130022【正文语种】中文【中图分类】TN305.7自从光学显微镜和天文望远镜诞生以来,人们在不断寻求着提高光学分辨率的方法,从而观测到更多物体细节。
超分辨光学成像技术及应用
超分辨光学成像技术及应用超分辨光学成像技术和应用，是当前光学领域的一个热门话题。
本文将介绍超分辨光学成像的原理、方法、发展历程以及应用领域。
一、超分辨光学成像技术原理与方法光学成像原理是利用光的波动性进行成像，这是基于物理规律的。
显然，物体的细节是可以通过细小的光束去照亮的，传统光学成像技术的分辨率限制在了光束的物理学衍射极限范围内。
而超分辨光学成像技术则是采用了一系列非常规的手段来对传统的光学成像技术进行了突破，实现了更高的分辨率。
超分辨光学成像技术主要的方法包括：难以实现单个光子探测的模型系统、针对不同颜色波长的双光子激光扫描显微镜、结构性光学抑制与激发淬灭（STED）显微镜、发射光栅旋转开口照相机（ER-C），以及两光子多荧光显微术等等。
其中，最具代表性的超分辨光学成像技术是双光子扫描显微镜。
其原理是利用皮秒激光通过非线性荧光效应实现的高分辨扫描和成像，扫描和成像分辨率比常规光学显微镜的分辨率高出2-3个量级，最好的表现接近5纳米。
同时，这种技术可以应用于任何生物或非生物样品，而不需要进行特殊的样品制备。
二、超分辨光学成像技术的发展历程本节主要介绍超分辨光学成像技术的发展历程。
1. 1986年，海尔曼和科瑞芬（Hell和Cremer）首次提出了光学表面反射抑制显微镜（SIM）的概念。
2. 1994年，焦激光微刻技术诞生。
3. 1997年，康奈尔大学的加深和雨果·哈特的团队开发出了遥感显微技术，该技术可以图像透明样品。
4. 2000年，艾森伯格在遥感显微技术的基础之上开发了针对生命科学的双光子显微技术。
5. 2006年，STED显微镜实现了分辨率在20nm以下的成像。
6. 2014年，皮秒脉冲激光技术实现了超分子和器官级别的成像。
三、超分辨光学成像技术的应用领域超分辨光学成像技术的应用领域非常广泛，主要可以应用于以下几个方面：1. 生物医学领域。
超分辨光学成像技术可以实现对细胞、蛋白、DNA等微观结构和功能的详细观察和研究，可以帮助科学家更好地理解和解决某些疾病的发生机制。
超高分辨率荧光显微镜
研究重点在于分子间如何相互作用、组装形成 复合物。
1.通过观察蛋白质之间的组合关系来了解它们 的作用，并能为后续的细胞功能试验打下基础 2.SR成像有助于人们更好地了解分子间的差异 3.SR成像技术还能用于在单分子水平研究蛋白 动态组装过程
图3-1 蛋白质组装示意图
22
应用前景
15
基于点扩散函数调制的超分辨技术
环状光的孔径理论上可以通过增加激光强度无限缩小 获得一个小于衍射极限的荧光激发点
更改了阿贝的衍射极限公式:
d
2nsin 11/ l
可见，随着 I 的增加，STED 技术的分辨 率可以无穷小
16
基于点扩散函数调制的超分辨技术贡献
2000 年，用一束激光激发荧 光分子发光，再用另一束环状 激光消除激发光周边的荧光， 通过二维点扫描实现了超高分 辨率成像，将光学显微镜分辨 率提高了近 10 倍实现了 1994 年提出的想法
在生物领域的应用一直没有发展
后期努力均在远场条件下发展
10
超高分辨率显微成像
几种超高分辨显微成像技术原 理示意及成像结果
超高分辨率显微成像——一般指在远场条件下基
于荧光的、“突破”衍射极限的光学显微成像技
术
荧光——物质吸收光照后发出的一类光
成为
低背景：利用了荧光发射光波长比吸收光波长较 生物
长这一重要原理，通过光路设计，分开激发光和 学研
荧 发射光，大幅降低了成像的背景
究中
光 高灵敏度：结合灵敏的检测器件，在优化条件下， 最常
显 微 镜
荧光显微镜还可以检测单个荧光分子发出的极其 微弱的荧光，成为单分子成像的最佳选择，其发 展也奠定了这次诺贝尔化学奖的半壁江山
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结课论文题目突破衍射极限的超高分辨率成像的技术进展学生学号学院专业班级二〇一五年十二月一引言1.1选题意义光学显微成像具有极为悠久的历史，但一直以来，光学成像一直受到衍射极限的限制而分辨率无法突破200 nm。
后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，但是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。
值得庆贺的是近年来，超高分辨率显微技术的发展使得光学显微成像分辨率达到了20 nm以下。
其中德国科学家Stefan Hell、美国科学家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率显微技术方面的突出贡献获得了2014年的诺贝尔化学奖。
在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术的发展和应用，并对诸位大师致以敬意。
1.2技术指标显微技术成像优劣一般通过X-Y平面分辨率与Z轴分辨率大小来判定，分辨率越高数值越小。
下表是各种显微成像技术的分辨率指标。
普通光学显微镜200-300 500-700 4Pi显微镜100-150 STED显微技术50-70STED+4技术50 50 PALM技术20 303D STORM技术20-30 50-60 dSTORM技术30 502D SSIM技术503D SSIM技术100 200 电子显微镜0.05X光衍射仪0.03-10二衍射极限2.1 衍射极限我们能看到什么？看到多小的围？看得有多清楚？几百年来，依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而可以进行研究。
人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。
1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观察薄薄的软木塞切片。
虎克看到了残存的植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起，这就是“细胞”一词的由来。
此后，显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。
那么，光学显微镜是否可以无止境地“放大”下去，让我们想看到多小就能看到多小？科学家为此做了很多尝试，最终发现，存在一道法逾越的“墙”—衍射极限。
1873年，德国科学家阿贝提出了衍射极限理论：光是一种电磁波，由于存在衍射，一个被观测的点经过光学系统成像后，不可能得到理想的点，而是一个衍射像，每个物点就像一个弥散的斑，如果这两个点靠得很近，弥散斑就叠加在一起，我们看到的就是一团模糊的图像。
阿贝提出，分辨率的极限近似于入射光波长的二分之一(d=λ/2)。
可见光的波长通常在380~780纳米之间，根据衍射极限公式，光学显微镜的分辨率极限就在200纳米（0.2微米）左右。
如果物体小于0.2微米，你仍旧看到的是一个模糊的光斑。
这就是很长一段时间，光学显微镜的分辨极限——衍射极限。
2.2 突破衍射极限为了更深入的观察世界，后来有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，人们借助它们可以看得更“细”。
但是这些设备依然没有突破衍射极限，他们依然遵循着阿贝衍射极限。
这些设备使用的是电子束等波长非常短的入射光，自然，它们的分辨率就高。
比如电子显微镜，分辨率可以达到0.5埃（一埃等于十分之一纳米），这样就可以看到一粒一粒的原子。
由于生物学、医学方面的研究，更希望在生命体存活的自然状态下进行观察，在这方面，光学显微镜有它不可比拟的优势。
因此，光学显微镜的研发还是世界科学家的研究热点。
突破性的进展发生在本世纪初，近年来，随着新的荧光探针和成像理论的出现，研究者开发了多种实现超出普通共聚焦显微镜分辨率的三维超分辨率成像方法。
较成熟的有基于单分子成像的超分辨率显微成像方法，包括光激活定位显微技术 (photoactivated localization microscopy, PALM) 和随机光学重构显微技术 (stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。
以及两大类通过改造光源的点扩散函数来提高成像分辨率的方法，分别是受激发射损耗显微技术(stimulated emission depletion, STED)和饱和结构照明显微技术。
(参考文献：吕志坚，陆敬泽.几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展)以上这些进展,都让光学显微镜突破了衍射极限，我们称之为“超分辨成像技术”。
美国光学学会把它列为21世纪光学五大研究计划之首。
三超高分辨率显微技术3.1光激活定位显微技术PALM当显微镜需要分辨两个或者更多点光源的时候，很难突破光学分辨率的极限来进行精确定位．而当显微镜的物镜视野下仅有单个荧光分子的时候，通过特定的算法拟合，此荧光分子位置的精度可以很容易超过光学分辨率的极限，达到纳米级．如上所述，尽管单分子的定位精度可以达到纳米级，但它并不能提高光学显微镜在分辨两个或者多个点光源时的分辨率．2002年，Patterson和Lippincott-Schwartz首次利用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种(PA-GFP)来观察特定蛋白质在细胞的运动轨迹．这种荧光蛋白PA-GFP在未激活之前不发光，用405 nm的激光激活一段时间后才可以观察到488 nm激光激发出来的绿色荧光．德国科学家Eric Betzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2006年9月，Betzig和Lippincott-Schwartz等首次在Science上提出了光激活定位显微技术( photoactivated localization microscopy, PALM) 的概念．其基本原理是用PA-GFP来标记蛋白质，通过调节405 nm 激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488 nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子．在确定这些分子的位置后，再长时间使用488 nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来．之后，分别用405 nm和488 nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环．这个循环持续上百次后，我们将得到细胞所有荧光分子的精确定位．将这些分子的图像合成到一图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10 倍以上分辨率的显微技术，如图 1 所示。
PALM 显微镜的分辨率仅仅受限于单分子成像的定位精度，理论上来说可以达到 1 nm 的数量级。
2007 年，Betzig 的研究小组更进一步将PALM技术应用在记录两种蛋白质的相对位置，并于次年开发出可应用于活细胞上的PALM成像技术来记录细胞黏附蛋白的动力学过程。
（参考文献：Patterson G H, Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells；Betzig E, Patterson G H, Sougrat R, et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution；Shroff H, Galbraith C G, Galbraith J A, et al. Dual-color superresolution imaging of genetically expressed probes within individual adhesion complexes）图1：应用PALM技术定位单个荧光分子最后实现超分辨率成像的示意图A， B， C， D， E， F 展示了实际实验过程及得到的原始数据；A′，B′，C′，D′，E′，F′ 展示了用高斯拟合确定荧光分子的中心，叠加产生了超分辨率图像；(A, A′) 未激活任何荧光分子时；(B, B′) 用405 nm 的激光激活了 4 个荧光分子；(C, C′) 用 488nm 的激光观察一段时间后漂白了第一轮激活的 4 个荧光分子；(D, D′)第二轮重新激活的另外的几个荧光分子；(E, E′) 两轮激活的荧光分子总和组成的图像；(F, F′)E 图的局部放大3.2多色随机光学重构显微法PALM 的成像方法只能用来观察外源表达的蛋白质，而对于分辨细胞源蛋白质的定位无能为力。
但是利用化学小分子Cy3和Cy5、Cy7等荧光分子对的光转换效应同样可以达到突破光学极限的效果。
这项技术被称为“随机光学重建显微术” (stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。
其发明人是哈佛大学的庄小威教授。
这项技术是用很弱的光激发荧光分子，使细胞的一小部分荧光分子发光，而不是全部。
这样由于发光的点分布比较分散，重叠比较少，因此每个光晕可以近似为一个荧光分子。
在一次激发中，可以确定一部分光晕的中心，在下一次激发中，可以确定另外一部分光晕的中心，把这许多次激发的结果叠加，就是完整而清晰的图像（图2）。
因此，STORM需要利用荧光发色团标记抗体对靶蛋白进行识别，可以检测到源性蛋白，避免由于外源性表达偶联荧光蛋白的靶蛋白对其定位产生的可能的影响，但是在活细胞应用中受到限制，并且也有可能受到免疫荧光染色过程的影响。
随后，他们又利用光学像散性实现了3D STORM，达到了平面20~30 nm，纵向50~60 nm的成像精度。
（参考文献：夏鹏，窦震.超高分辨率显微技术研究进展；Huang B, Wang W, Bates M, et al. Three-dimensional superresolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy）利用某些荧光小分子自身可被反复激发淬灭的性质，通过与STORM相似的操作方法，可以实现单一荧光分子的超高分辨率成像，这一方法大大简化了原始STORM的样品制备过程，被称为dSTORM(direct STORM)。
值得一提的是，庄小威研究组将SNAP标签与靶蛋白融合表达，同时将荧光分子偶联到可以结合SNAP标签的小分子化合物上，进而标记靶蛋白，再通过降低溶解氧消耗系统以及脂肪族巯醇的添加量，成功地在三维超高分辨率的成像中实现了空间分辨率平面30 nm，轴向50 nm，时间分辨率1~2 s的优异效果。
有意思的是几种细胞膜标记物也被鉴定出具有光转换性质，并被用于超高分辨率显微成像，在活细胞中得到了30~60 nm的空间分辨率和1~2 s的时间分辨率。