超分辨率荧光显微技术
超分辨显微镜的工作原理和应用
超分辨显微镜的工作原理和应用随着科技的飞速发展，人们对于微小的物体的研究越来越深入。
在过去，显微镜可以提供的最高分辨率为200nm左右，然而很多细胞和物质需要更高的分辨率才能被准确的研究。
超分辨显微镜(deconvolution microscopy)因而被应运而生，它的分辨率可以达到20nm以下，是传统显微镜的10倍以上。
下面，本文将为你介绍超分辨显微镜的工作原理和应用。
一、超分辨显微镜的工作原理超分辨显微镜的工作原理是使样品产生的荧光分子处于暗区域退回到明亮区域，通过这种方法，显微镜能够获取比传统显微镜更清晰的图像。
在超分辨显微镜之前，由于空气折射率的限制，显微镜无法将细胞成像到更高的分辨率。
超分辨显微镜通过不同的方法打破了这个技术障碍。
例如，受到今天最先进的高清电视和摄像机技术的启发，超分辨显微镜使用一种称为激发的荧光分子反转的技术（Stimulated Emission Depletion，简称STED）来实现高分辨率显微成像。
基本上，STED方法是通过在激光束之间使用减少荧光过程的抵消光束来使荧光分子处于暗区域"退回"到明亮区域的。
荧光物质只能在光束中的明亮区域发光，当光束聚焦到小于荧光分子的空间大小时，荧光分子会产生干扰，使得分辨率变得模糊。
为了解决这个问题，STED技术增加了所有光束之间的强烈相互作用，目的是将荧光分子拉回到它们本应该出现的明亮区域。
这使得STED显微镜能够放大高达20nm以下的样品。
二、超分辨显微镜的应用超分辨显微镜的应用涵盖了许多生命科学领域，从细胞核到分子水平都有广泛的应用。
（一）细胞功能研究超分辨显微镜的分辨率可以揭示小分子的扩散、细胞器动力学和蛋白质亚细胞位置，在细胞功能研究中有着重要的应用。
例如，在分子分布的研究中，超分辨显微镜可以帮助研究人员观察受体和离子频繁转位的过程。
该技术还可以用于研究神经元的突触功能，因为它可以检测小型生物分子如神经递质的扩散情况。
超分辨率显微镜的使用步骤和技巧
超分辨率显微镜的使用步骤和技巧超分辨率显微镜是一种现代化的显微成像技术，可以提供超过传统显微镜分辨力的图像。
它的使用可以在细胞、分子和材料科学领域带来许多重要的应用。
本文将介绍超分辨率显微镜的使用步骤和一些技巧，确保您能够正确并有效地使用这一先进的仪器。
使用步骤：1. 准备样本：首先，选择适合超分辨率显微镜分辨率的样本。
样本应具备较高的荧光信号和较低的背景噪声水平，以获得清晰的图像。
微胶束、活细胞、单分子和纳米颗粒都是常见的适用样本。
2. 标记样本：在使用超分辨率显微镜之前，样本需要进行荧光标记。
合适的标记方法包括使用荧光探针、染料或免疫标记技术。
确保标记物能够与您感兴趣的结构高度特异性地结合。
3. 调整光路参数：在使用超分辨率显微镜之前，您需要调整光源、检测器和镜片的位置和设置。
请根据仪器的操作手册进行正确设置，以确保光路参数的准确性和优化，以获得高分辨率图像。
4. 调节显微镜焦距：超分辨率显微镜需要在样品和镜片之间形成最佳焦距。
通过调节显微镜的焦距来确保样品在成像时处于最佳状态，并获得最高的分辨率。
5. 选择合适的成像模式：根据样品类型和感兴趣的结构，选择适合的超分辨率成像模式。
常见的成像模式包括结构照明显微镜（SIM）、刺激发射显微镜（STED）和单分子显微镜。
6. 获取图像数据：根据您的设置，在显微镜软件中选择适当的参数并开始图像采集。
确保采集图像时设置适当的曝光时间，以避免图像过曝或过暗。
7. 图像处理和分析：获取图像后，您可以借助图像处理软件进行优化和增强。
常见的图像处理软件包括ImageJ、Fiji和MATLAB等。
对于超分辨率显微镜图像，通过去卷积和增强对比度等方法，进一步提高图像质量。
技巧：1. 样本准备的关键性：在使用超分辨率显微镜之前，样本的准备至关重要。
确保样品固定、染色和标记过程正确，以避免破坏或变形样品。
2. 避免光破坏：超分辨率显微镜对光的要求很高，所以在进行成像时，应避免长时间暴露在强光下。
超分辨荧光显微技术原理
超分辨荧光显微技术原理传统的荧光显微镜受到瑞利准则的限制，即其分辨率受到光学波长和透镜的限制。
超分辨荧光显微技术则通过创新的方法克服了这一限制，实现了超分辨率的荧光成像。
1.非线性显微技术：传统的荧光显微技术采用的是线性成像原理，即通过样品中的荧光物质发射的线性荧光信号来获得图像。
而超分辨荧光显微技术采用非线性成像原理，利用荧光物质的非线性光学效应，提高了分辨率。
例如，通过激光器的脉冲激发，可以使荧光物质在非线性荧光效应下发射高阶谐波信号，从而得到更高分辨率的图像。
2.相干显微技术：传统的荧光显微技术采用的是非相干光源，无法获取相干光的相位信息，从而限制了分辨率的提高。
而超分辨荧光显微技术采用相干光源，如激光光源或可调谐激光器，使得可以获取到样品的相位信息，从而提高了分辨率。
例如，通过在激光束上加入相位调制，可以在信号中提取出相位信息，从而实现更高的分辨率。
3.显微镜改进：传统的荧光显微镜在透镜、光路和探测器等方面都存在一定的限制，无法实现超分辨率成像。
超分辨荧光显微技术通过改进显微镜的设计和构造，例如采用高数值孔径物镜、自适应光学元件和高速探测器等，可以克服这些限制，提高分辨率。
4.数据分析和算法：超分辨荧光显微技术的数据量较大，需要进行大量的图像处理和分析。
通过使用高级算法和计算方法，可以将大量数据进行处理和重建，得到超分辨率的图像。
例如，通过拟合和重建点扩散函数，可以实现超分辨率的成像。
超分辨荧光显微技术的应用非常广泛，涵盖了生物医学、材料科学和纳米技术等领域。
例如，在生物医学领域，超分辨荧光显微技术可以用于观察和研究细胞结构、分子过程和疾病发展等，为生物医学研究提供了重要的工具。
在材料科学领域，超分辨荧光显微技术可以用于材料表征和纳米结构研究，为材料科学的发展和应用提供了有力支持。
总之，超分辨荧光显微技术通过创新的光学方法和图像处理算法，突破了传统荧光显微技术的分辨率限制，实现了超分辨率的荧光成像，为生物医学和材料科学等领域的研究提供了重要工具。
《超分辨率荧光显微成像技术》
点光源光斑的半高宽
• 其中I是STED 激光器的最大聚焦强度，而I sat 则是当受激荧光强度被减少到1/e时的STED
激光的强度特征值。由此公式可看出，当I/Isat 的值趋近无穷大时，STED 成像的点光源的
半高宽趋近于0，即分辨率不再受光的衍射过
Advatange and Disadvantage
• RESOLFT能够反映出样本的细节，而传统 共焦显微镜做不到。
• 这种“耐疲劳”可切换的探针虽然可以在 荧光和黑暗状态之间来回切换很多次,但仍 然有限,大大妨碍了使用RESOLFT在生物成 像的应用。
近场光学成像技术
传统的光学理论，如几何光学、物理光学等，通常 只研究远离光源或者远离物体的光场分布，一般统称 为远场光学。远场光学在原理上存在着一个远场衍射 极限，限制了利用远场光学原理进行显微和其它光学 应用时的最小分辨尺寸和最小标记尺寸。
a.利用柱面镜增强PALM在z轴分辨率 b.利用液晶空间光调制器增强PALM在z轴分辨率 Science, 2008, 319(5864): 810～813 Proc Natl Acad SciUSA, 2009, 106(9): 2995～2999
多重平面成像
三维成像的另一种办法是将两个或者多 个不同聚焦层面的图像同时送入 CCD中， 提取三维信息。利用这个 原理 ， Hess 和 Bewersdorf 小组开发出来双层 PALM 技 术．
The Rayleigh criterion ① choosing very short wavelengths (UV, x radiation
in the case of electromagnetic fields or more efficiently, propagating electrons); ② working in very high index materials for increasing n. increasing the aperture angle of the microscope
超分辨率显微镜技术解析
超分辨率显微镜技术解析随着科技的不断发展，科学家们对于生命现象的研究需求也日益增强。
而作为现代生命科学研究的一项重要技术，显微镜具有不可替代的地位。
然而，由于传统光学显微镜的探测受到物理光学分辨率极限的制约，导致直接观察单细胞、细胞器级别的分子水平生命现象变得相当困难。
幸运的是，现代科技的进步，为分辨能力的提高提供了可能。
其中，超分辨率显微镜技术的出现为生命科学领域的研究提供了重要的新工具。
超分辨率显微镜技术是指通过光学手段使得成像分辨率达到甚至超出达到物理光学分辨率极限的技术方法。
最早由斯蒂芬.荣格等科学家于2008年提出。
而通过这项技术的运用，科学家们可以在细胞层面将生命现象展现出来，并实现对分子间微观运动机理的观察。
超分辨率显微镜技术的前沿和应用超分辨率显微镜技术主要可以分为三类，即：刺激发射荧光显微镜，结构亚波长光学显微镜和单分子荧光恢复成像技术。
刺激发射荧光显微镜是指，在样品中标记荧光物质，在经过激光刺激后荧光物质会跃迁到激发状态，并再次跃迁回来时放出一束较短波长易于观察的荧光，从而实现高分辨率成像。
同时，该技术还可以大幅度减少对活细胞的有害影响，适用于活体成像。
结构亚波长光学显微镜是一类将微小结构体前处理成周期性的光学反射镜，利用构成反射镜的光学结构的亚波长周期性特征，恢复高频率在物体表面上的连续波，以得到高分辨率的显微观测图像。
一般而言结构亚波长光学显微镜对于成像分辨率能够提高约一半。
而单分子荧光恢复成像技术是一种能够很好地消除荧光物质团簇和光漂白的影响的技术，它是基于单个荧光物质的发光，通过记录多次成像造成的多幅图像融合而成的超分辨率图像。
除了上述的具体应用，超分辨率显微镜技术在生命科学领域的研究中也具有广泛的应用。
它可以在形态学、生物化学、生物物理学等领域中，对生命现象从分子水平到细胞层次的演变进行实时的高分辨成像。
通过该技术，甚至可以对纳米尺度的生命分子结构进行三维可视化，进而探索生命现象的机理与规律。
超分辨率荧光显微技术的原理和进展
超分辨率荧光显微技术的原理和进展超分辨率荧光显微技术是一种用于观察细胞和生物分子的显微镜技术，具有比传统荧光显微镜更高的分辨率，可以更清晰地分辨出细胞和生物分子的结构和功能。
其原理基于物理学原理和计算机算法，通过精确的荧光标记和高分辨率成像技术，实现了对生物结构的超分辨率观察。
本文将介绍超分辨率荧光显微技术的原理和进展。
1.超分辨率荧光显微技术的原理抑制光的衍射：传统光学显微镜无法突破维恩衍射极限，限制了其分辨率。
超分辨率荧光显微技术利用光的非线性响应和光学调制技术，使得衍射限制得以突破。
例如，利用单分子荧光显微技术，可以将荧光标记的分子在时间上进行“开关”，只有少数分子发出荧光，可以精确定位每个分子的位置。
利用这种方法，可以获得超分辨率的图像。
图像重建算法：超分辨率荧光显微技术还依赖于一系列图像处理技术，如重建算法和数据解析算法。
这些算法能够在获得低分辨率图像的基础上，通过处理和分析图像数据，恢复出高分辨率的图像。
常见的算法有结构光超分辨率显微镜（SR-SIM）、单分子定位显微镜（SMLM）等。
这些算法通过统计学原理和概率分析等方法，提高图像的分辨率和清晰度。
2.超分辨率荧光显微技术的进展（1）结构光超分辨率显微镜（SR-SIM）：这种技术是利用结构光的干涉原理，通过调整光源的相位和频率，实现对样本的超分辨率成像。
SR-SIM技术能够将样本的分辨率提高到约100 nm，从而观察到更细微的结构。
（2）单分子定位显微镜（SMLM）：SMLM技术利用荧光标记的分子在时间上进行“开关”，只有少数分子发出荧光，可以精确定位每个分子的位置。
通过收集大量分子的位置信息，可以恢复出高分辨率图像。
SMLM 技术的分辨率可以达到10 nm左右，成为最高分辨率的超分辨率显微技术之一（3）受限激发荧光显微镜（STED）：STED技术是一种利用激光束的光强分布来抑制荧光的发射，从而实现超分辨率成像的方法。
STED技术的分辨率可以达到几十纳米，可以观察到更小的细胞结构和分子组装。
细胞生物学中的高分辨率显微技术
细胞生物学中的高分辨率显微技术随着科技的不断发展，细胞生物学领域也在不断地进步和创新。
其中，高分辨率显微技术是细胞生物学领域中的一项重要的技术手段，其能够为科学家们提供更加准确、详尽的细胞图像，使得对细胞结构、组成、功能等方面的研究更加深入和精细。
高分辨率显微技术是指在显微镜的帮助下，能够对样本进行更加细致的观察、分析和测量，将分辨率提高到纳米级别。
这项技术在细胞生物学领域中的应用十分广泛，主要可以分为以下几个方面：一、超分辨率显微技术超分辨率显微技术是指通过改进显微镜的光学系统，使得其分辨率可以达到甚至超过传统显微镜（近200nm）的极限。
同时，该技术还能够对样本进行三维成像，得到更为准确的结构信息。
其中比较常见的技术包括：STED显微镜、SIM显微镜、PALM显微镜等。
以SIM为例，该技术是通过将样本分成很多个小区域，每个小区域内是一定模式的荧光点。
在显微镜中，通过改变激光照射的位置，能够得到不同的荧光图像。
将这些图像进行处理和拼接，就可以得到一个高分辨的三维结构成像图。
二、电子显微技术电子显微技术是通过不同方式对样本进行电子束的照射，使得细胞内的结构被电子束激发，从而成像。
其中常用的有透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）。
该技术分辨率可达到亚纳米级别，相对于超分辨率显微技术，电子显微技术对样本的制备要求更高，而且需要在真空环境下进行。
以TEM为例，该技术的原理是将样本制成超薄切片，使电子经过样本后发生互作用。
电子束通过样本后，会被光学透镜重新调焦，从而形成放大的图像。
三、荧光显微技术荧光显微技术是指将样本标记上荧光物质，并通过激光的照射，使荧光物质发光，从而获得细胞的图像。
该技术主要适用于活细胞的研究，可以对细胞内的分子运动、交互、信号传递等进行实时观察。
其中常用的技术有荧光共聚焦显微镜（confocal microscopy）和荧光剪切显微镜（FLIM）等。
以confocal microscopy为例，该技术是通过将激光束聚焦到样本上，并对样本通过一个扫描镜，得到三维空间上的图像。
几种超分辨率显微术原理及对比
各厂家超分辨技术1、莱卡公司采用的超分辨技术STED2000年，德国科学家StefanHell开发了另一种超高分辨率显微技术，其基本原理是通过物理过程来减少激发光的光斑大小，从而直接减少点扩散函数的半高宽来提高分辨率．当特定的荧光分子被比激发波长长的激光照射时，可以被强行猝灭回到基准态．利用这个特性，Hell 等开发出了受激发射损耗显微技术(stimulatedemissiondepletion,STED)．其基本的实现过程如图2所示，就是用一束激发光使荧光物质(既可以是化学合成的染料也可以是荧光蛋白)发光的同时，用另外的高能量脉冲激光器发射一束紧挨着的、环型的、波长较长的激光将第一束光斑中大部分的荧光物质通过受激发射损耗过程猝灭，从而减少荧光光点的衍射面积，显著地提高了显微镜的分辨率,原理见下图。
STED成像技术的最大优点是可以快速地观察活细胞内实时变化的过程，因此在生命科学中应用更加广泛.2、蔡司公司采用的超分辨技术PLAM2002年，Patterson和Lippincott‐Schwartz首次利用一种绿色荧光蛋白(GFP)的变种(PA‐GFP)来观察特定蛋白质在细胞内的运动轨迹．这种荧光蛋白PA‐GFP在未激活之前不发光，用405nm的激光激活一段时间后才可以观察到488nm激光激发出来的绿色荧光．德国科学家EricBetzig敏锐地认识到，应用单分子荧光成像的定位精度，结合这种荧光蛋白的发光特性，可以来突破光学分辨率的极限．2006年9月，Betzig和Lippincott‐Schwartz等首次在Science上提出了光激活定位显微技术(photoactivatedlocalizationmicroscopy,PALM)的概念．其基本原理是用PA‐GFP来标记蛋白质，通过调节405nm激光器的能量，低能量照射细胞表面，一次仅激活出视野下稀疏分布的几个荧光分子，然后用488nm激光照射，通过高斯拟合来精确定位这些荧光单分子．在确定这些分子的位置后，再长时间使用488nm激光照射来漂白这些已经定位正确的荧光分子，使它们不能够被下一轮的激光再激活出来．之后，分别用405nm和488nm激光来激活和漂白其他的荧光分子，进入下一次循环．这个循环持续上百次后，我们将得到细胞内所有荧光分子的精确定位．将这些分子的图像合成到一张图上，最后得到了一种比传统光学显微镜至少高10倍以上分辨率的显微技术，原理如下：PLAM通过定位细微结构乃至单分子，实现 20 nm 的横向分辨率和 50 nm 轴向分辨率。
超高分辨率荧光显微镜
研究重点在于分子间如何相互作用、组装形成 复合物。
1.通过观察蛋白质之间的组合关系来了解它们 的作用，并能为后续的细胞功能试验打下基础 2.SR成像有助于人们更好地了解分子间的差异 3.SR成像技术还能用于在单分子水平研究蛋白 动态组装过程
图3-1 蛋白质组装示意图
22
应用前景
15
基于点扩散函数调制的超分辨技术
环状光的孔径理论上可以通过增加激光强度无限缩小 获得一个小于衍射极限的荧光激发点
更改了阿贝的衍射极限公式:
d
2nsin 11/ l
可见，随着 I 的增加，STED 技术的分辨 率可以无穷小
16
基于点扩散函数调制的超分辨技术贡献
2000 年，用一束激光激发荧 光分子发光，再用另一束环状 激光消除激发光周边的荧光， 通过二维点扫描实现了超高分 辨率成像，将光学显微镜分辨 率提高了近 10 倍实现了 1994 年提出的想法
在生物领域的应用一直没有发展
后期努力均在远场条件下发展
10
超高分辨率显微成像
几种超高分辨显微成像技术原 理示意及成像结果
超高分辨率显微成像——一般指在远场条件下基
于荧光的、“突破”衍射极限的光学显微成像技
术
荧光——物质吸收光照后发出的一类光
成为
低背景：利用了荧光发射光波长比吸收光波长较 生物
长这一重要原理，通过光路设计，分开激发光和 学研
荧 发射光，大幅降低了成像的背景
究中
光 高灵敏度：结合灵敏的检测器件，在优化条件下， 最常
显 微 镜
荧光显微镜还可以检测单个荧光分子发出的极其 微弱的荧光，成为单分子成像的最佳选择，其发 展也奠定了这次诺贝尔化学奖的半壁江山
超分辨率荧光显微技术
发明光激活定位显微镜（PALM） 通过叠加图像超越阿贝衍射极限
三、原理
1.The principle of STED microscopy
三、原理
左：传统光学显微镜获得的大肠杆菌图像， 右：STED显微镜获得的图像。
三、原理
2.The principle of single-molecule microscopy
Super-resolution fluorescent microscopy
----2014 Nobel Prize in Chemistry
邵晨雯 MG1630099
药剂学
目录
一、获奖理由 二、获奖者简况 三、技术原理 四、应用
一、获奖理由
19世纪末，恩斯特·阿贝将光学显微镜的极限定义为0.2微米； 单个细胞、细胞器 √ 普通尺寸的病毒、单个的蛋白质 ×度
一、获奖理由
“获奖者在超分辨率荧光 显微技术领域取得的成就使 得实时研究分子过程变为可 能。”
——Sven Lidin
二、获奖者简况
Eric Betzig
美国应用物理学家和发 明家，目前在美国霍华 德·休斯医学研究所珍利 亚农场研究园区工作
Stefan W. Hell
罗马尼亚出生的德国物 理学家，现在担任德国 马克斯·普朗克生物物理 化学研究所所长
W. E. 美国M单o分er子ne光r 谱和荧光
光谱领域的著名专家， 从1998 年至今一直在斯 坦福大学担任教授
二、获奖者简况
挑战了半年既定法则 提出“受激发射减损技术” 开发出了STED显微镜
三、原理
溶酶体膜 左：常规显微镜拍摄的图像， 中：单分子显微镜拍摄的图像， 右：扩大的膜图像。
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首位成功测量单个荧光分子光吸收 发现了光激活
发明光激活定位显微镜（PALM） 通过叠加图像超越阿贝衍射极限
2020/inciple of STED microscopy
2020/6/24
三、原理
左：传统光学显微镜获得的大肠杆菌图像， 右：STED显微镜获得的图像。
Stefan W. Hell
罗马尼亚出生的德国物 理学家，现在担任德国 马克斯·普朗克生物物理 化学研究所所长
W. E. 美国M单o分er子ne光r 谱和荧光
光谱领域的著名专家， 从1998 年至今一直在斯 坦福大学担任教授
2020/6/24
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二、获奖者简况
挑战了半年既定法则 提出“受激发射减损技术” 开发出了STED显微镜
Super-resolution fluorescent microscopy
----2014 Nobel Prize in Chemistry
2020/6/24
邵晨雯 MG1630099
药剂学
1
目录
一、获奖理由 二、获奖者简况 三、技术原理 四、应用
2020/6/24
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一、获奖理由
19世纪末，恩斯特·阿贝将光学显微镜的极限定义为0.2微米； 单个细胞、细胞器 √ 普通尺寸的病毒、单个的蛋白质 ×
超越光学显微镜的局限——超高分辨率荧光显微镜的发展 荧光分子 →纳米尺度
2020/6/24
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一、获奖理由
“获奖者在超分辨率荧光 显微技术领域取得的成就使 得实时研究分子过程变为可 能。”
——Sven Lidin
2020/6/24
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二、获奖者简况
Eric Betzig
美国应用物理学家和发 明家，目前在美国霍华 德·休斯医学研究所珍利 亚农场研究园区工作
2020/6/24
11
2020/6/24
12
2020/6/24
三、原理
2.The principle of single-molecule microscopy
2020/6/24
三、原理
溶酶体膜 左：常规显微镜拍摄的图像， 中：单分子显微镜拍摄的图像， 右：扩大的膜图像。
2020/6/24
四、应用
脑的两个神经细胞之间分子如何产生突触； 在导致帕金森病和亨廷顿舞蹈病的蛋白质聚集时进行跟踪； 在受精卵分裂成胚时跟踪单个蛋白质； ......