全内反射荧光成像基本原理
全内反射荧光显微镜概述
3. 物镜型光学成像系统中物镜
由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内 反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值 孔径（NA）必须大于1.38。 当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径 范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围 （最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准 比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔 径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.651.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大， 降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型 全内反射荧光成像系统的关键。
全内反射
全内反射是一种普遍存在的光学现象。 考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射 率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射， 另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满 足关系式n1sinθ1=n2sinθ2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:即所有的入射光 线全部反射出来,称为全内反射。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
2.1棱镜型
棱镜型利用激光经过棱镜并产生全内反射，其隐失波照射已 被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被 CCD相机捕捉。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只 是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光 的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所 以样品大小和样品的放置受到限制。
全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中
消逝波----全内反射荧光镜的关键所在
消逝波 消逝场(evanescent field)
荧光消逝波 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射的仪器组成
全内反射荧光显微成像系统
棱镜型
物镜型
成像系统的消逝场 是通过入射光经棱 镜发生全反射产生 的
基本概念
Title 全内反射荧光显微术：
Title 数值孔径：
全内反射荧光显微术：
全内反射荧光显微术是利用全内反射产 生的消逝波来照射样品，从而致使在样 品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的 荧光团受到激发，使单分子成像。
数值孔径：
数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是 由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径 角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小 由下式决定：N.A=n×sin a/2
全内反射荧光技术发展历程
1965年
Hirsch field 完成了第一个 全内反射荧光 实验
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像.
1996年
Moerner小 组又用这项技 术实现了限制 在丙烯酰胺胶 体的纳米孔中 的单分子的三 维成像。
层析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反 射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么 薄的光学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统 好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜优点：
1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生物样本损伤小
与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统层 析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反射显 微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光 学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜TIRFM介绍
TIRFM 原理
全内反射是一项依赖于消逝波的技术。 在两种不同折射率介质的临界面上，临界角 的光线几乎被完全反射： c= sin-1 (n2/n1) n1 > n2 消逝波只能够传播到盖玻片后几百纳米内 典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm
低折射率 q 高折射率
只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能 被激发。远场分子不受激发。
如何得到消逝波
标本折射率 消逝波 水 n２ =1.33 细胞内液 n２ =1.38
d
盖波片 （n1＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n1＝1.78 for APO100XOHR ） 镜油 （n0＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM） （n0＝1.78 for APO100XOHR ）
安装简单 可用于膜片钳实验 物镜数值孔径受限制
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全内反射照明的切换
宽场荧光照明
盖波片
物镜
激光
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高灵敏度冷CCD --- EMCCD Rolera-MGi
背感光、高量子效率，>90% 芯片增益EMCCD，不放大读出噪音 高速度，全幅30fps，最高300fps以上 低温制冷CCD
EM CCD在以下应用具有无可比拟的优势： 1。单分子成像：Single molecule imaging 2。全内反射：Total internal reflection 3。转盘式共聚焦：Spinning Disk 5。Ca等的离子测定 6。快速时间序列的荧光3D成像
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全内反射荧光显微镜90613113
TIRFM的发展历程
❖ 上世纪80年代初，Axelrod和Daniel等生物 物理学家对TRIFM技术及基本原理进行描述， 他们利用TIRFM对荧光脂质标记的人类皮肤 成纤维细胞的细胞-基膜连接进行了研究，另 外几乎是在同一时间，科学家也通过TIRFM 和FRAP(荧光漂白恢复技术)的结合使用对生 物分子表面的动力学进行了研究。
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TIRFM的发展历程
❖ 上世纪90年代初，随着新型物镜透镜、聚光 镜和超灵敏探测器的出现，使TRIFM技术得 到充分发展。
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TIRFM的发展历程
❖ 1995年，Yanagida等人第一次用TIRFM技术， 将单位时间（秒）单位区域（以一个衍射极 限面积为单位，微米级别）内的背景信号降 低到3个光子，在液体溶液中得到了荧光标记 的单个肌动球蛋白质分子的成像，并且探测 到了单个ATP酶的翻转反应。从此TIRFM开 始广泛应用于单分子的成像研究。
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传统光学显微镜在生物样本显微方面 的缺点
❖ 信噪比不高，分辨率不高，同时光学显微镜 有空间分辨极限，约为250 nm。从生物学应 用的角度，传统的光学显微镜显然无法满足 更高的空间分辨率要求，并且研究过程中需 要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在 活细胞生理条件下实时地对细胞内蛋白质-蛋 白质间相互作用进行动态研究。
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TIRFM的发展历程
❖ 21世纪以来，全内反射荧光法的方法多种多 样，包括时间分辨全内反射荧光、多重内反 射荧光和全内反射荧光相关光谱等方法。它 研究的内容也很广泛，包括观察表面分子或 近表面分子的取向、旋转和荧光寿命，肌球 蛋白酶活性测量，单个蛋白分子对之间的荧 光共振能量转移，基因芯片荧光检测等等。
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物镜型TIRFM系统
各荧光检测方法简介(流式、荧光显微镜、共聚焦、全内反射与双光
各荧光检测方法简介（流式、荧光显微镜、共聚焦、全内反射与双光很多细胞实验都要检测荧光，为方便大家选择合适的方法，在此简单说一下各种荧光检测方法的特点。
不足的地方，欢迎大家补充：1、流式，优点是速度快，非常适合做大数量统计，且样品只被检测一次，完全不用担心荧光淬灭的问题。
缺点是只能检测荧光的有无、强度大小，无法提供空间定位信息，无法做荧光定位变化的实验；由于样品只被检测一次，因此无法对同一个样品进行连续观察。
例如，做膜蛋白定位时会得到这么一个结果——用流式可以检测出信号，但是用显微镜却看不到东西，排除仪器和滤光片选择问题，很可能是核的自发荧光或非特异标记造成流式的假阳性结果。
2、荧光显微镜，刚好与流式互补，可很好地进行空间观察，判断目标蛋白的定位，但是不适合做大流量检测，估计没人能经得起时间的考验。
有不同倍率的物镜选择，可以使用高倍物镜看精细结构，或用小倍率物镜做少量统计。
与之搭配的CCD和软件，是系统能否发挥性能的关键。
尤其是CCD，从那么多商品里选一款合适的不容易，需要了解很多知识否则只能听别人忽悠。
3、共聚焦，荧光显微镜的升级产品，具有很好的光学层切效果，能得到很好三维定位信息。
但是，如果使用共聚焦的目的仅仅是为你的样品拍一张靓照，取得一张好看的图片，就让人觉得可惜了。
共聚焦基本都是全自动系统，可随意定义照明区域、选择多个荧光通路和设定定时取图，所以，做Time-laps、FRAP和FRET有其独到的优势。
另外，4Pi和 STED又是其中的极品，具有超高的空间分辨率，只是使用不方便，未必适合做生物实验。
4、全内反射，荧光显微镜的另一种升级产品，属于近场光学范畴，只适合且最适合做膜研究，无法看到胞内信息。
也是用CCD成像，但是对CCD的要求更高——个人甚至觉得对CCD的要求是没有上限的。
5、双光子，另一种共聚焦，因使用长波激发荧光，故能做深层检测（突破共聚焦的100微米极限），最典型的应用是观察活体脑组织。
荧光成像的原理和方法
荧光成像的原理与方法荧光成像在基因组学和蛋白质组学等生物学领域应用中的独特优势：高灱敏度：灱敏度进超比色法，在大部分应用中其灱敏度近乎放射性同素。
多组样品一次成像：将不同样品（如：对照、处理）通过不同发射波长的荧光素标记（如 Cy3或 Cy5等）可以同时检测多样品荧光信号。
稳定性高：较放射性同位素相比，荧光素标记的抗体、杂交探针、PCR引物等的信号稳定性优势明显，可稳定存在数月以上，这使需要大规模标记并多阵列之间的标准化比较成为了可能。
低毒性成本低：多数情况下，荧光标记和检测的全过程试验用手套即可对实验者提供足够的保护。
易于运输和实验后处理，多数情况下实验成本低于放射性同位素。
商业可获得性：许多重要的荧光标记型生物大分子如各种单抗、多抗、CAT等及荧光标记用试剂盒都可以方便获得,同时一些公司提供荧光标记的外包服务。
荧光信号的产生及信号捕获原理：荧光物质被特定外界能量激发（如激光等高能射线），引起其电子轨道向高能轨道跃迁，并最终释放能量回归基态的过程中会产生可被检测的荧光信号。
当然不是所有的物质都能被激发产生荧光，只有当该物质与激发光具有相同的频率并在吸收该能量后具有高的荧光效率而非将能量消耗于分子间碰撞过程中，其荧光信号才可被光学设备所检测（Fig.1）。
Fig.1 ①激发能②无辐射弛豫能③荧光发射能。
三种荧光素（绿色：fluorescein；黄色：DNA-bound TOTO TM；红色：DNA-bound EB）的激发光波长(a)和发射光波长(b)。
荧光成像系统的组件和工作原理：荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定范围内是与荧光素存在的量成线性关系的，这是荧光成像系统应用于生物学研究的理论基础，激光扫描系统的性能指标主要有：系统分辨率、线性范围、均一性、灱敏度。
为了实现荧光信号的激发、捕获和放大的检测过程，按照顺序荧光成像系统主要包括以下组件：激发源（Excitation resource）、激光传输组件（Light delivery optics）、荧光收集组件（Light collection optics）、发射滤镜（Emission filter）和信号检测放大组件（Detection and amplification）（Fig.2）。
全内反射荧光成像基本原理
hv H**
H hv
S2
吸
放
收
热
S0
精品课件
S1
放
荧
热
光
分子荧光的产生
激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光：10-7-10-9s 磷光：10-4-100s
精品课件
电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态）
在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（n, π）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述：
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：109—10-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射， 荧光马上会消失。
磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（104—10s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。
精品课件
全内反射荧光显微镜结构
目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类 型：棱镜型和物镜型(或无棱镜型)。
精品课件
由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利用 隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光团， 而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了 显微成像的对比度和信噪比。
d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的 距离。
精品课件
精品课件
隐失波强度成指数衰减曲线
M＝2S＋1＝1 电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或－ 1/2，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能级 通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，M=1，成 为单重态。
精品课件
当成对电子中的一个被激发到S1、S2等电子能级激 发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电子 成对 。这些能态都被称为单线态或 单重态(singlet state)。
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
全内反射荧光显微术原理与应用1. 引言全内反射荧光显微术（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的显微技术，利用全内反射限制激光光束的传播范围，使其仅激发样品表面附近的荧光染料，并通过荧光显微镜观察和记录表面附近的高分辨荧光信号。
该技术具有高灵敏度、高空间分辨率和实时监测能力等优点，广泛应用于生命科学研究中。
本文将详细介绍TIRFM的原理和应用。
2. 全内反射原理光在由一个折射率较大的介质（如光具）射入折射率较小的介质（如空气）时，当入射光线的入射角大于一个特定的临界角时，光线将会完全发生反射，不再穿透进入折射率较小的介质中。
这个现象被称为全内反射（Total Internal Reflection，TIR）。
当一个光束从高折射率的物质射入低折射率的物质时，入射角大于临界角时，发生全内反射。
通过调控入射角，可以使光线沿着介面传播，从而形成衰减系数很小的光束。
这个现象可以被用来实现TIRFM的照明光路。
3. 全内反射荧光显微术系统TIRFM系统主要由以下几个部分组成：激光光源、调制器、目标镜、物镜、荧光滤光片、成像系统和数据采集分析系统等。
激光光源：一般使用高功率激光器，如氩离子激光器或二极管激光器。
激光通过光纤输入到光路系统中。
调制器：用于控制激光的工作模式，常用的包括振荡镜或振荡腔。
目标镜：一般是具有高折射率的玻璃片或光具，用于实现全内反射，常用的目标镜材料有石英、玻璃等。
物镜：用于聚焦激光到样品表面，并收集荧光信号。
物镜的选择要考虑到激光的聚焦效果和空间分辨率。
荧光滤光片：用于选择性地阻挡激发光和透射荧光信号。
成像系统：一般是荧光显微镜或全内反射显微镜。
能够观察并记录样品表面的荧光信号。
数据采集分析系统：可以对观察到的荧光图像进行实时处理和分析，如图像增强、图像叠加、荧光强度计算等。
4. TIRFM原理TIRFM的原理可以通过以下步骤进行解释：1.激光从物镜聚焦到样品表面。
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＝21＋1＝3，这种电子激发态称为三重态(triplet
state)。
能 量
Π*
Π*
Π*
Π
S0 单重基态
Π
S1 单重激发态
Π
T1 三重激发态
分子荧光的产生 （雅布隆斯基分子能级图）
分子荧光的产生 荧光发射：电子由第一激单重态的最低振动能级到基 态，多为S1-S0。由于基态中也有振动弛豫跃迁，这使得发 射荧光的能量比分子吸收的能量要小，所以，荧光的特征 波长比入射波长要长。 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：109—10-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射，
与传统的荧光显微镜相比，使显微成像在Z轴上的空间
分辨率得到了显著改善，大大提高了图像的信噪比和对比度。
全内反射荧光显微成像系统
分子荧光的产生
当一束特定波长的光照射到物质时，物质分子与光量
子发生“碰撞”。如果这次碰撞时有效的：
S2
S1
吸 收
放 热
放 热
荧 光
H
hv
S0
hv
H**
分子荧光的产生
激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光：10-7-10-9s 磷光：10-4-100s
光学隧道效应
光强度并不发生全反射,而是有隐失波存于介质2中。 当光疏介质薄膜的厚度小于隐失波的渗透深度时,这个波 不仅穿过了光疏介质,而且会促进邻近高折射率介质3中的 电子作受迫振动,由此产生了新的次波,隐失波的形态发生 了显著改变,全反射被破坏,能量发生了流动,导致了光学 隧道效应的产生。
全内反射荧光显微技术，是利用光发生全内反射时产生 的隐失波照明样本，仅激发样本表面薄层范围内的荧光基团。
隐失波的频率与入射光线的频率相同，其强度随临界 面的垂直距离呈指数衰减：
其中：Z是离开分界面的距离，I(z)表示距离界面Z处 的强度；I(0)表示临界面处的强度。
由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利
用隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光
团，而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提 高了显微成像的对比度和信噪比。
荧光马上会消失。 磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（104—10s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。
全内反射荧光显微镜结构 目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类
型：棱镜型和物镜型(或无棱镜型)。
棱镜型
全内反射荧光显微镜结构
物镜型使用高数值孔径(NA≥1．4)的物镜作为荧光信号的接受器，
d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的距离。
隐失波强度成指数衰减曲线
隐失波的渗透深度d12是入
射角及相对折射率的函数。 d12是渗透深度,它等于从 分界面处到光强衰减到分界面 处数值l/ e的处的距离。对于
可见光波长而言，浸透深度约
质做的棱镜中间夹一薄层空气层(光疏媒 质)。 如果不断减少空气层的厚度,由于空气层中有透射 波,这透射波进人第二块棱镜。
当成对电子中的一个被激发到 S1、S2等电子能级
激发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电
子成对。这些能态都被称为单线态或单重态 (singlet state)。 但如果处于第一电子激发态最低振动能级的电 子 通 过 无 辐 射 跃 迁 （ 系 间 跨 越 ， intersystem crossing) 改变自旋方向，则因消耗部分能量而降至 另一种激发态：S＝1/2＋1/2＝1，多重度 M＝2S＋1
同时又作为发生全内反射的光学器件，样品的放置非常方便，并且可
与多种技术联用，例如纳米操纵、光镊技术、原子力显微镜等。
该系统的关键是高数值孔径物镜的使用。由于细胞的 典型折射率为1．33～1．38，因此要实现全内反射，物镜 的NA必须大于1．38，表达式为： NA = n sinθ n sin θ > n sin θc
其中，NA为物镜的数值孔径 ，n， θ分别为物镜的折 射率(浸没油)和孔径角。θc为发生全内反射时的临界角。
物镜的数值孔径越高，则有更多的孔径范围可被利用，且
容易校准光束。
物镜型全内反射荧光显微镜示意图
全内反射荧光成像基本原理
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)
全内反射荧光显微镜(TIRFM)
目前用于单分子研究的检测技术主要有两大类：扫描 探针显微技术（SPM）和光学技术。其中：
SPM
原子力显微技术（AFM） 扫描隧道显微技术（ STM） 扫描离子电导显微技术（ SICM）
n2
n1
当入射角不断增大，透射角为增大 90°时，入射角达 到临界角 θc。依据 Snell 定律得出：
90º
n2
TIR
n1
当入射角继续增大时，光不再透射进水溶液，即发 生了全内反射。
隐失波
隐失波
90º
n2
TIR
n1
实际上，由于光的波动效应，有一部分光的能量会透过 临界面渗透到水溶液中，平行于界面向水溶液中传播，这一 部分透过的能量场则称之为“隐失波” 或“隐失场”。
生物化学家及药理学家。 1970年他与 卡茨冯奥伊勒共享了诺贝尔生理学和医
学奖。于美国卫生研究院度过其大部职
业生涯。他研究药物及激素的作用、神 经冲动传播的化学方面，并特别研究松
Axelrod,Julius
果体的功能。
光反射和折射示意图
全内反射示意图
光的反射和折射
Snell定律：
Refracted n1>n2 TIR
电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态）
在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子 （n, π ）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述： M＝2S＋1＝1 电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或－ 1/2，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能级 通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，M=1，成 为单重态。
共聚焦荧光显微技术 （LSCM） 扫描近场光学显微技术 （SNOM） 全内反射荧光显微技术 （TIRFM）
光学显微镜成像 光学技术 光学操纵
发展历程 上世纪80 年代，Axelrod 等生物物理学家对 TIRFM 技 术及基本原理进行描述，并探索了其在生物方面的应用。
阿克塞尔罗德（Axelrod,Julius) 美国