酶的分离与纯化注意事项

酶的分离与纯化注意事项及酶分离纯化 为什么进行酶活力和酶比活力测定
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酶的提取、 酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 酶提取 酶分离纯化 酶浓缩 酶贮存 离心分离，过滤分离， 离心分离，过滤分离，沉淀分 层析分离，电泳分离， 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。 取分离，结晶分离等。 动物、 动物、植物或微生物细胞 发酵液
酶活
酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力 单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分 钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的 有关基团的酶量。
酶的比 活力Байду номын сангаас
1、在特定条件下，单位重量（mg）蛋白质或RNA所具有的酶 活力单位数。 2、比活力(性)(Specific Activity)是酶纯度的量度,即指: 单位重量的蛋白质中所具有酶的活力单位数,一般用IU/mg蛋 白质来表示.一 般来说,酶的比活力越高,酶越纯.。 3、比活力 为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用 酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来 衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度 越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋 白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。
本章 目录
酶的提取： 酶的提取：
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶 原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质 选择适当的溶剂。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。 酶的结构和溶解性质， 一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非 极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易 溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸 稀碱、 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行 水或稀酸、 提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有 提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有 机溶剂提取。
提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓 度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注 意控制好温度、pH值等提取条件。
酶提取过程中应注意事项 ：
根据酶提取时，所采用的溶剂或溶液的不同， 根据酶提取时，所采用的溶剂或溶液的不同，酶抽提的 方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取， 方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机 溶剂提取等。 溶剂提取等。 • 盐溶液提取： 盐溶液提取： • 大多数酶在一定浓度的盐存在条件下，酶的 大多数酶在一定浓度的盐存在条件下， 溶解度增加，即盐溶，但盐浓度不能太高， 溶解度增加，即盐溶，但盐浓度不能太高，否则溶解度反 而降低，即盐析。 一般采用稀盐溶液进行酶的提取， 而降低，即盐析。故：一般采用稀盐溶液进行酶的提取， 盐浓度控制在0.02 0.5mol/L。 盐浓度控制在0.02—0.5mol/L。 0.02 0.5mol/L • 例如：用固体发酵生产的麸曲中的α--淀粉酶 淀粉酶， 例如：用固体发酵生产的麸曲中的α--淀粉酶， 糖化酶、蛋白酶等胞外酶， 0.15mol／ 糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol／L的氯化钠溶液或 0.02～0.05mol／L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用 0.02～0.05mol／ 的磷酸缓冲液提取； 0.5～0.6mol／ 的磷酸氢二钠溶液提取；有少数酶， 0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；有少数酶，如霉 菌产生的 •
在酶的分离纯化过程中为什么进行酶活力及酶比活力测定
1、防止酶变性失活。一旦活力明显下降，就要考虑换一种纯 化方法；
2、计算纯化效率。通过总活力和比活，评估纯化效率，寻找 最佳方法。
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为 的纯化过程， 个阶段： 三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质 抽出全蛋白， 打破细胞 → 抽出全蛋白， 沉淀法 多使用 盐析沉淀法；可 以粗略去除蛋白质以外的 物质。 物质。 (2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化， 初步的纯化，使用各钟 析法。 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶 一步精制纯化， 的进一步精制纯化，可用 制备式 HPLC。 制备式电泳 或 HPLC。
在酶的提取过程中，为了提高提取率并防止酶变性 失活，须注意以下几点：
1．温度： 温度： 通常抽提温度应控制在0 10oC（ oC）。对某些耐温的酶， ）。对某些耐温的酶 通常抽提温度应控制在0-10oC（0-4 oC）。对某些耐温的酶，如胃蛋 白酶等，可适当提高抽提温度， oC下保温抽提 效果较好。 下保温抽提， 白酶等，可适当提高抽提温度，在37 oC下保温抽提，效果较好。因 为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度， 为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提 取。 2.试剂 2.试剂 接着要注意的就是避免使用一些会造成酶变性的试剂， 接着要注意的就是避免使用一些会造成酶变性的试剂，比如说重金属 有机试剂。严格意义上来说，要提取活性酶， 盐，有机试剂。严格意义上来说，要提取活性酶，任何可能使蛋白质 沉淀的试剂和方法都要避免使用。最好就是直接在液体环境下进行， 沉淀的试剂和方法都要避免使用。最好就是直接在液体环境下进行， 比较理想的方法就是色谱柱层析。然后， 比较理想的方法就是色谱柱层析。然后，实际上为了防止蛋白质在提 取过程中被释放的内源性蛋白酶（木瓜蛋白酶，枯草蛋白酶等等） 取过程中被释放的内源性蛋白酶（木瓜蛋白酶，枯草蛋白酶等等）降 解蛋白质，还需要在提取环境中加入适当的蛋白酶抑制剂。 解蛋白质，还需要在提取环境中加入适当的蛋白酶抑制剂。