酶的分离纯化

微 滤（MF） 0.2~2um
超 滤 （UF） 10nm~200nm
纳滤 （NF） 反渗透 （RO）
生物大分子及以上 超滤膜
2nm~10nm
生物小分子及以上 纳滤膜
<2nm
盐类及以上
反渗透膜
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二、酶分离纯化中几种常见的膜分离技术 （一） 微 滤(MF)
又称微孔过滤，是以微滤膜作为过滤介质的膜分离技术。 （1）截留颗粒直径：0.2~2 um。 （2）操作压力：低于0.1 MPa。 （3）应用： 实验室和生产中通常利用微滤技术除去或收集酶发酵 液中的细胞。 无菌水、矿泉水、纯生啤酒的生产。热敏性药 物和营养物质的过滤除菌等
3、盐析操作 （1）硫酸铵的饱和度 实际浓度 饱和浓度
（NH4）2SO4 的饱和度（%）=
×100%
0.4S = 40%（饱和度）
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例：将2升0.2S的硫酸 （2）调整盐浓度的方法 铵溶液提升至0.5S，需加饱 和硫酸铵多少升？溶液体积 加饱和（NH4）2SO4 溶液： 增加多少倍？ V0（S2 - S1） 1 - S2
（3）调pH值 二、固液分离
方法：（1）离心分离；（2）过滤；（3）双水相萃取
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三、细胞破碎
捣碎法：捣碎机 研磨法：研钵、细菌磨、石磨、球磨等 匀浆法：匀浆器
机械破碎法
温度差破碎法：冻融交替法
物理破碎法
压力差破碎法：高压冲击法、突然降压法、渗透压变化 超声波破碎法
（三） 反渗透(RO)
在压力作用下，溶剂（通常是水）透过膜，而溶质被阻 挡于膜壁外。 （1）截留颗粒直径：小于2 nm。 （2）操作压力：1~8 MPa。 （3）应用：主要用于分离各种离子和小分子物质。 在酶液的浓缩、无离子水的制备、海水淡化等方面广泛 应用。
膜 膜
溶质 水 水
溶质 水 水
渗透
反渗透
再者，在纯化工作中，往往不宜重复采用相同的步骤和 条件。 最后，要严格控制操作条件。随着酶的逐步纯净，杂蛋 白含量亦逐步降低，蛋白质之间的相互作用力随之下降, 酶更不稳定，因此,更要防止酶变性。
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三、酶分离纯化的基本原则
（一）酶分离纯化包括三个基本环节 抽提 纯化ห้องสมุดไป่ตู้精制
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（四） 电渗析
在电场作用下，带电离子透过膜向两极移动，而达到分离 的目的。
+
膜 膜
酶液
-
+
应用：电渗析主要用于酶液或其他溶液的脱盐、海水淡化、 纯水制备等
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（五） 透析
应用：在生物分离方面，主 要用于生物大分子溶液的脱盐。 由于透析过程以浓差为传质推 动力，膜的透过通量很小，不 适于大规模生物分离过程，而 在实验室中应用较多。
大多数酶的回收纯化过程成本约占70%； 医用酶的生产回收过程的成本高达85%； 基因工程表达产物的回收纯化过程成本一般占85-90%以上；
青霉素回收过程成本约占50%；
乙醇的回收过程成本仅占14%。
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二、分离纯化的一般流程
原料液
细胞分离（离心、过滤）
线路1 线路2
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（二）等电点沉淀
1、原理
2、实际操作 与其他方法一起使用（盐析、有机溶剂沉淀、复合沉淀）。 单独使用时，主要是用于从粗酶中除去某些等电点相距较 大的杂蛋白 。 3、注意 加酸碱调节pH值时，防止局部酸碱过高。
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（78.3%）
凝胶电泳
（88.9%）
共六步，总收率仅为16%
staehelin等人： 硫酸铵盐析 免疫亲和层析 阳离子交换层析 仅三步，总收率达81.0%
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在实践工作中选择方法时:
首先，应对被纯化的酶的理化性质有—个比较全面的了 解; 其次，判断采用的方法和条件是否得当，始终以测定酶 活性为标准。
V0 — 原来溶液的体积 V— 所需加入饱和硫酸铵的体积
V
=
S1 — 原来溶液的硫酸铵饱和度
S2 — 所需达到的硫酸铵饱和度
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加固体（NH4）2SO4 ：
例：某酶制剂厂生产15吨蛋 白酶发酵液，用硫酸铵进行盐析, 要求硫酸铵的饱和度达到40%， 计算需要加入固体硫酸铵多少kg? （25℃）
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PAA + 酶 + Ca 2+ PAA- Ca 2+ + SO4 2-
（五）选择性变性沉淀法
选择一定的条件使酶液中存在的某些蛋白质等杂质变性 沉淀，而不影响所需的酶。 1、热变性法：根据目的酶与杂蛋白热稳定性差异，可以在 较高温度下，使杂蛋白变性沉淀，而酶则保持可溶状态。 2、酸碱变性法：与热变性原理类似，目的酶与杂蛋白的酸 碱稳定性不同，可以调整不同的pH使杂蛋白变性沉淀。
第四章 酶的分离纯化及产品成型
本章知识点： （1）酶的抽提 的 纯 度 监 测 （ ） 酶 纯 化 过 程 4
（2）酶的分离纯化：沉淀分离、离心分离、
膜过滤、层析分离、电泳分离
（3）酶液的浓缩、结晶、干燥、成型
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一、生物下游加工技术
下游加工过程包括目标产物的提取、浓缩、纯化及成品化 等过程。 生物产物从原料（培养液或细胞）生产到产品的后处理技 术（分离纯化技术）的发展，使低成本、高收率地纯化目标 产物成为现实。
膜 膜
透析袋
酶溶液
盐类 水
蒸馏水
水
渗透
透析
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三、膜分离技术的基本流程
浓缩液（回流液）
料液罐
渗出液
泵
膜组件
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四、生产中常用的膜分离装置
中空纤维超滤器 中空纤维膜分 离装臵是将成束的中空纤维装入 一筒内，两端封闭。当轴流通过 管腔时，造成高剪切力，在截留 溶质分子的同时，将浓度降至最 低限度。每根中空纤维内腔直径 为0.2mm,中空纤维由惰性的非离 子聚合物制成．具有各向异性、 抗堵塞性，运用成束纤维表面积 大，流量大、阻留溶质的浓度范 围(4％一20％左右) 如右图。
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第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法
1、原理：
2、硫酸铵盐析的优点 优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
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（二） 超 滤(UF)
可截留溶液中溶解的大分子物质，而透过小分子物质。 （1）截留颗粒直径：10~200 nm。 （2）操作压力：0.1~0.7MPa。 （3）应用：一是分离纯化，从高分子物质与低分子物质的溶 液中，使低分子物质透过膜；二是溶液的浓缩。
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纳滤（MF）
（2-10nm）
反渗透滤（RO）
（＜2nm）
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各种膜分离法的原理和应用范围
膜分离法 截留的颗粒大小 截留的主要物质 灰尘、细菌 过滤介质 微孔滤膜 应用举例 除菌，回收 菌 蛋白质、多 肽和多糖的 回收和浓缩 脱盐、浓缩 盐、氨基酸、 糖的浓缩、 淡水制造
细胞（胞内产物） 细胞破碎 碎片分离 粗分离 纯化 成品化
清液（胞外产物）
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人干扰素、是一种重要蛋白类生物药品，具有抗癌和治疗 肝炎等作用。
Yonehara等人：
醋酸锌盐析
（83.0%）
离子交换层析
（62.7%）
硫酸铵盐析
（96.2%）
铜螯合层析
（46.0%）
疏水层析
膜 孔 径
大
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小
灰尘
灰尘 灰尘 细菌 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
细菌
灰尘 病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
病毒
生物大分子 生物小分子 盐类
细菌
膜
病毒
生物大分子
生物小分子 盐类 水
水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂 自溶法 G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
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酶促破碎法
加酶处理
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充 分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。 （一）抽提方法 四稀：稀酸、稀碱、稀盐、稀有机溶剂
渗出液
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
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一、膜分离的类型
1、按推动力不同可分为： （1）扩散膜分离：渗透、透析 （2）压力差膜分离：微滤、超滤、纳滤、反渗透 （3）电位差膜分离：电渗析 2、按膜孔径或截留物质的大小： 微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
（三）有机溶剂沉淀法