实验8酶的分离纯化

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第二节 实验数据的处理 —分析酶促反应速度的作图法
一、Lineweaver-Burk法(双倒数作图法)
将实验所得的一些初速度数据v和[S]取倒数，得各种1/v 和1/ [S]，将1/v对1/ [S]作图，得一直线。该直线纵截距＝ 1/Vmax，斜率＝Km/ Vmax，横截距＝-1/ Km。应用双倒数作图法 处理实验数据求Km和Vmax等动力学常数比较方便，也是最广 泛应用的一种方法，但欲要获得较准确的结果，实验时必须注 意底物浓度范围，一般所选底物浓度需在Km附近。
知识回顾
酶的概念：
酶是生物催化剂，是活细胞合成的
具有高度催化效率和高度特异性的一类 蛋白质。
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酶促反应的特点
它遵守一般催化剂的共同性质：
1. 在化学反应前后都没有质和量的改变；
2. 只能促进热力学上允许进行的反应；
3. 只能加速可逆反应的速率，而不能改变反应的平衡点，
即不改变反应的平衡常数。 4. 酶和一般催化剂都是通过降低反应活化能而使反应速 率加快。
SE
S
Et ES
k1 k 1
ES
ES
k2 P E
[ES]生成速度： v1
k1 Et ESS ，[ES]分解速度： v2 k1ES k2 ES
米 氏 方 程 的 推 导
当酶反应体系处于恒态时： 即： 令：
2.Woolf-Augustinsson-Hofstee作图法
将米氏方程重排为线性方程：
3.Eadie-Scatchard作图法
将米氏方程重排为线性方程
以上三种作图法也应注意选择底物浓度，不要使[S]比 Km高得多或低得多。
上述几种线性作图法各有其优缺点。双倒数作图 法应用最广泛。但此法有两个缺点：第一，在v～ [S] 图上，由相等增值而给出的等距离各点，在双倒数图 上变成非等距离的点，且多数点集中在1/v轴附近，而 远离1/v轴的地方只有少数几个点，恰好这些点又正是 主观目测以确定直线最权重的那些点。第二，在测定v 时产生的小误差，当取倒数时会放大。在低底物浓度 下更为敏感，因在高1/[S]值所得的一两个不准确的点， 会给图的斜率带来显著误差。第一个缺点可通过选择 适当的[S]，使1/[S]为等距离增值而得到克服。对第二 个缺点关键要注意在低底物浓度下使所测初速度误差 尽可能减小。
各种因素对酶反应速度的影响
1、酶浓度
当S足够过量，其它条件固定且无不利因素时，v=k[E]
2、底物浓度
3、pH
（最适 pH的概念）
4、 温度 （最适温度的概念） 5、激活剂 6、抑制剂
第一节
动力学方程推导
酶反应的基本动力学关系，是指酶反应速度 与酶和底物间的动力学关系。因为酶和底物是 构成酶反应系统最基本的因素，它们决定酶反 应的基本性质、酶反应的速度规律，而其他各 种因素也正是通过它们产生影响的；而且，这 种动力学关系是整个酶反应动力学的基础。 描写这种基本动力学关系的是米氏方程 (Michaelis-Menten equation)。
三、酶的转换数
转换数可用两种方法表示。其一是以分子活性(molecular activity)来定义，即在最适条件下、每摩尔酶每分钟所转 变的底物摩尔数(即每微摩尔酶的酶单位数)。其二是许 多酶为寡聚体。含几个亚基，因此可用另一种方式来表 示转换数，即在最适条件下，每摩尔活性亚基或催化中 心每分钟所转变的底物摩尔数。这两个值有时简单以 min-1表示，即：
这样，当[S]为常数时，则初速度v与[Et]成正比。但一个 酶促反应速度，常因[S]的改变而改变。因此反应时间必 须尽可能短，使[S]几乎处于恒态(即只有5％以下的底物 形成产物)，才能得到真正的初速度，v与 [Et]之间的关系 才会是线性的。
二、酶活力单位和比活力
是指酶在一定作用条件下，单位时间内，使底物 转化的量或产物生成的量。也就是说，酶量的多少是 采用其催化能力来度量；换句话说，是采用酶催化反 应的速度来度量，因为在适当的条件下，v∝[E]。 为了使酶单位的文献报道能统一，并具有可比性， 国际酶学会议曾制订了一个标准单位：在特定条件下， 1分钟内能转化1微摩尔底物所需的酶量为一个酶单位。 所谓特定条件，温度定为25℃，pH、底物浓度等其它 条件均定为最适条件。该酶单位称为国际单位〔IU)。 酶制剂中的酶量一般用U/mg或U/ml等表示。 酶的比活力(specific activity)是指每毫克蛋白中所 含的酶单位数，用U/mg蛋白表示。
Lee和Wilson改良双倒数方程对数据的处理
改良的双倒数方程形式与双倒数方程相似，为 其中 是t这一段时间内的平均速度； 为反应过程中底物浓度的算术平均值。 由于积分方程对任何反应程度的数据处理都是准确的
用
可以通过
对比：
处理实验数据的准确性如何，
与
从以上计算可以看出，用改良的双倒数方程作图法 处理实验数据时，即使反应已进行到30％，所引入的误 差也不过1％左右。
L-乳酸 H C OH D-乳 酸 H C COOH OH
H3C
COOH
H3C
A
B
C
A
B
C
乳酸脱氢酶
图5-11 乳酸脱氢酶的立体异构特异性
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主要内容

单底物酶处反应动力学 酶的分离纯化
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单底物酶促反应动力学
酶动力学是研究酶促反应的速度问题，即研究各种
因素对酶促反应速度的影响。
酶动力学理论与实验在生物化学领域，特别在酶学 研究中，有十分重要的作用。例如，根据某些因素对酶 促反应速度的影响，可推断该酶促反应的机制。又例如， 要准确测定酶活力单位，就需要对最佳反应条件及各种 因素的影响进行研究。 酶促反应有单底物反应和多底物反应之分。单底物 酶促反应包括异构酶、水解酶及大部分裂合酶催化的反 应。
过氧化氢酶
2 000J
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（二）酶具有高度特异性 1．绝对特异性：有的酶只能作用于特定结构 的底物，进行一种专一的反应生成特定结构的 产 物 ， 称 之 为 绝 对 特 异 性 （ absolute
specificity）。
2 ．相对特异性：大多数酶作用于一类化合物 或一种化学键，这种不太严格的选择性称为相 对特异性（relative specificity）。
酶活力的表示方法
活力单位（active unit）
量度酶催化能力大小
习惯单位（U）: 底物(或产物)变化量 / 单位时间 国际单位（IU）: 1μmoL变化量 / 分钟
Katal（Kat）：1moL变化量 / 秒 比活力（specific activity）
比活力= 总蛋白mg数
总活力单位
量度酶纯度

Et S K m S
由于酶促反应速度由[ES]决定，即 将（2）代入（1）得：
v k2 ES
，所以

ES
Et S v k2 K m S
所以
v
k2 Et S (3) Km S
v k2
(2)
当[Et]=[ES]时，
v Vm
v = vmax[S] / (Km+[S])
单分子酶促反应的米氏方程及Km
k2 ES E S P E k 1
ຫໍສະໝຸດ Baidu
k1
米氏方程:
Vmax S v K m S
米氏常数:
k 1 k2 Km k1
推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照
“稳态平 衡”假说的设想进行推导。
酶的kp值约在50～107min-1。碳酸酐酶是己知转换数最 高的酶之一(36×106min-1)。1/kp=1.7μsec，即该酶一个 催化周期为1.7微秒。
第五节 酶促反应的稳态前动力学 一、快反应技术
酶促反应动力学研究有两条途径：一是稳态动力学。它 是监测整个反应，得到关于反应的笼统信息。二是稳态 前动力学，它能更直接地研究整个反应中的基本步骤或 部分反应，提供可用于分析复杂反应机制的更有效的数 据，但需要特殊的仪器来测量快反应。所谓快反应，是 相对于普通的混合和观察方法所需要的时间而言。完成 总反应量的一半，即所谓反应半时间，为秒或更短时间， 则属快反应。采用手工混合启动反应，用普通的分光光 度计等仪器所能测量的反应半时间为分和小时。而酶促 反应常常是反应半时间短于一秒的快反应，采用普通方 法是不行的。限制仪器测定能力的主要因素有：混合样 品并充满反应池所需的时间，观察和记录变化所需的
很明显，如果所有酶是饱和的，而且反应显著不可 逆，而且没有产物抑制的情况，用改良双倒数法处理实 验数据来测定Km和Vmax，可获得准确结果。如有必要， 可用捕获剂或偶联酶使产物不断移去，迫使反应不可逆， 并使产物抑制成为最小。
酶促反应速度的测定与酶的活力单位
1、测定酶促反应的速度必需测初速度 2、酶活力
[S]在3.3～20 Km的范围的 实验结果而作 出的双倒数图。
3.如果[S]比Km小得多，则所作双倒数图的直线与两 轴的交点都接近原点，使-1/Km 和1/Vmax ，都难以测 准。
[S]在0.033～ 0.2Km的范围的 实验结果而作 出的双倒数图。
二、其它线性作图法
1.Hanes-Woolf作图法 即把米氏方程重排成线性方程
1.下图是根据[S]在0.33～2.0Km范围时的实验结果而作 的双倒数图，从此图可准确地测量出-1/Km和1/Vmax等。
[S]在0.33～ 2.0 Km的范 围的实验结 果而作出的 双倒数图。
2.如果所选底物浓度比Km大得多，则所得双倒数图的 直线基本上是水平的。这种情况虽可测得1/Vmax ，但 由于直线斜率近乎零， -1/Km则难以测得。
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NH2 O C NH2 尿素 NH CH3 O C NH2 甲基尿素 + H2O
脲酶
2NH3 + CO2
脲酶 + H2O
绝对特异性
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相对特异性
蔗糖酶 果糖—葡萄糖 蔗糖 蔗糖酶 果糖—葡萄糖—半乳糖 棉子糖 果糖 + 葡萄糖—半乳糖 蜜二糖 果糖 + 葡萄糖
图5-9 蔗糖酶的水解作用
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3．立体异构特异性：一些酶仅能催化一种立体异 构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异 构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异 性（stereospecificity）。
= U(或IU) mg蛋白
转换系数（Kcat）
量度转换效率
底物（ μ moL）/ 秒· 每个酶分子
第四节 酶的分析和检测
一、酶促反应初速度随[Et]的变化
酶促反应的初速度随[Et]的变化而变化。通常在离体测 定条件下， [Et]一般为10-12～ 10-7 mol/L，而[St]为106～ 10-2mol/L。 可将米氏方程转变为以下形式：
[S]/v对[S]作图，[S]未取倒数。另两个线性作图 法，v未取倒数。前者对等距离 [S]增值所测数据 作图较双倒数法更优越。后者在低底物浓度下 测定误差较大时使用，比其它方法更可靠。
三、Eisenthal-Cornish-Bowden作图法
这是根据米氏方程的性质而提出的一种直接作图法。该 法是把[S]值标在横轴的负半轴上，而把测得的v值标在 纵轴上，然后把相应的v和[S]连成直线，这样所得的一 簇直线交于一点，该交点坐标为Km和Vmax。
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酶不同于一般催化剂的特点：
（一）酶的催化效率极高 通常比非催化反应高 108 ～ 1012 倍；比一般催化 剂高 107～1013倍。
催化剂 无 胶态钯 过氧化氢酶
每摩尔需活化能 18 000J 11 700J 2 000J
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过氧化氢分解反应所需活化能
催化剂 无 胶态钯
每摩尔需活化能 18 000J 11 700J
Vm k2 Et
(4)
将（4）代入（3），则：
v
Vmax S K m S
酶反应速度与底物浓度的关系曲线
V
Vmax
[S] 当底物浓度较低时 反应速度与底物浓度成正比。
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V
Vmax
[S]
随着底物浓度的增高 反应速度不再成正比例加速。
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V
Vmax
[S]
当底物浓度高达一定程度 反应速度不再增加，达最大速度。
k1 Et ESS k1ES k2 ES
k1 k2 Km k1
Et S ESS k1 k2 ES k1 则： Km ES ESS Et S
(1)
v1 v2
经整理得：
ES
检测酶含量及存在，很难直接用酶的“量”（质量、体积、 浓度）来表示，而常用酶催化某一特定反应的能力来表示酶量，
即用酶的活力表示。
酶催化一定化学反应的能力称酶活力，酶活力通常以最适条件 下酶所催化的化学反应的速度来确定。
3、酶活力的表示方法
4、酶活力测定方法：终点法 动力学法
酶活力测定方法
终点法: 酶反应进行到一定时间后终止其反应， 再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。 动力学法:连续测定反应过程中产物\底物或辅酶 的变化量，直接测定出酶反应的初速度。