第四章酶的提取与分离纯化
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第四章酶工程酶的提取与分离纯化ppt课件
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法： ⑴中性盐沉淀（盐析法） ⑵有机溶剂沉淀 ⑶选择性沉淀（热变性和酸碱变性） ⑷等电点沉淀 ⑸有机聚合物沉淀
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
细菌细胞壁的结构
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：
loSg loS0 g K sI
I：离子强度，I = 1/2∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）； Z：离子价数
S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L） S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L） Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。
b. 添加固体硫酸铵
适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要 达到的盐浓度又很高时。
实际使用时，可直接查表 （各种饱和度下 需加固体硫酸铵的量）。
从使用情况来看，闭胸式的使用比较 广泛。 敞开式 盾构之 中有挤 压式盾 构、全 部敞开 式盾构 ，但在 近些年 的城市 地下工 程施工 中已很 少使用 ，在此 不再说 明。
3. 化学法 应用各种化学试剂与细胞膜作用，
使细胞膜结构改变或破坏。
4.12第四章酶的分离纯化
高 速离心 机 的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等 的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高 速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
酶的分离纯化讲解
➢ 目标酶活力测定方法 ➢ 蛋白质纯度检测方法 ➢ 对杂质的分析方法
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
第二节分离纯化步骤及方法
一、步骤
发酵产品
1、酶的提取
固液分离，破碎，抽 提，浓缩
2、初分离
3、 纯化
精制品
4结晶
保藏
酶分离纯化总体步骤
1、酶液的提取
（1）发酵液的固液分离 （2）细胞破碎
（1）发酵液的固液分离
❖ 常用的分离方法有离心和过滤。 ➢ 离心分离速度快，效率高，操作时卫生条件
转筒真空过滤器
II
1 2
4 III
6 7
5
3
a.转动盘
b.固定盘
I
1－转筒；2－滤饼；3－割刀；4－分配头；5－吸走滤液的真空凹槽； 6－吸走洗水的真空凹槽；7－通入压缩空气的凹槽I－过滤区； II－洗涤脱水区；III－卸渣区
（2）细胞破碎
❖ 按微生物细胞酶的分布分为三类 ❖ 细胞破碎是指通过物理、化学或生物的方法，
❖ 组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的 方法，通常可先用家用食品加工机将组织打 碎，然后再用10000r/min～20000r/min 的内刀式组织捣碎机(即高速分散器)将组织 的细胞打碎。
物理破碎
通过各种物理因素 的作用，使组织、 细胞的外层结构破 坏，而使细胞破碎。
冻结-融化法 压榨法 渗透压法 超声波破碎法
纯度要求 极高纯度（>99%）
高纯度（95%-99%）
一般纯度（<95%）
用途 医疗用途
理化性质研究
生产抗原
2、明确目标蛋白与主要杂质的性质
❖ 检测目标酶蛋白稳定条件，至少检测pH 值和离子强度两个条件。
❖ 了解目标酶和杂质的性质：分子大小、 等电点、溶解度等。
酶的分离纯化
超声波破碎法
化学破碎法： 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等有机溶剂和Triton、
Tween等表面活性剂
酶促破碎法
自溶法 加酶处理
G+菌：溶菌酶 G-菌：溶菌酶、巯基乙醇等 酵母菌：β-葡聚糖酶和溶菌酶 霉菌：几丁质酶
四、抽提 指在一定的条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充
分溶解到溶剂中的过程，也称为酶的提取。
2、按膜孔径或截留物质的大小：
微滤 —— 超滤 —— 纳滤 、电渗析 、透析 —— 反渗透
膜
孔
径大
小
灰尘 细菌
膜
病毒 生物大分子 生物小分子 盐类 水
灰尘 细菌 病毒 生物大分子
生物小分子 盐类 水
微滤（MF）
（0.2-2um）
超滤（UF）
（10-200nm）
灰尘 细菌 病毒 生物大分子 生物小分子
选择性热变性法、选择性酸碱变性法、 选择性表面变性法
亲和层析、亲和电泳
ห้องสมุดไป่ตู้
第三节 酶的沉淀分离
盐析沉淀法√、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法、复合沉淀法
一、盐析沉淀法 1、原理： 2、硫酸铵盐析的优点
优点：①在水中溶解度大，溶解的温度系数小； ②价廉，便宜； ③可保护酶。
缺点：溶解过程随浓度增加的体积变化是非线性的变化。
(25℃)
当溶液体积不大，要达到的盐浓度不高，可以加 入饱和硫酸铵溶液；当溶液体积较大，要达到的盐 浓度又较高，此时加入固体硫酸铵较好。
4、为了得到较好的盐析效果，应控制下列因素
（1）不同酶，盐析时所需的盐浓度各不相同。实际料液中目 标酶的盐析沉淀操作前，所需的硫酸铵浓度或饱和度可通过实 验确定。
（2）加盐操作时，防止局部盐浓度过高，防止产生泡沫。
第四章 酶的分离
主要方法
盐溶液提取 0.02－0.5mol/L 用于提取在低浓度盐溶 液中溶解度较大的酶。 盐溶现象和盐析现象
蛋白质胶体溶液稳定的因素 ——水化膜、表面电荷 破坏胶体溶液的稳定条件，会使蛋白质能 够从溶液中沉淀出来。
水化膜
+ + + + + + +
带正电荷的蛋白质 脱水作用
酸 碱 在等电点的蛋白质 脱水作用 碱
碱 酸
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
脱水作用 酸
+ + + + + + + +
带正电荷的蛋白质
－ － － － － －－ －
带负电荷的蛋白质
不稳定的蛋白质颗粒
酸溶液提取 pH3－6的水溶液 用于提取在稀酸溶液 中溶解度大，且稳定性较好的酶。 胰蛋白酶 0.12mol/L的硫酸溶液。 碱溶液提取 pH8－12的水溶液 用于提取在稀碱溶液 中溶解度大，且稳定性较好的酶。 细菌 L-天冬酰胺酶 pH11－12.5的碱溶 液提取。
二、酶的提取
在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原 料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称 作酶的抽提。 多数酶能溶于水，可用有机溶剂、稀酸、 稀碱、稀盐等溶剂提取。提取过程中，为 了保持酶的活性，要控制好温度、pH值等 条件。
溶剂选择原则：
一般来说 极性物质易溶解于极性溶剂中，非极性物 质易溶解于非极性溶剂中； 酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易 溶于酸性溶剂中。
视频演示
超 声 波 细 胞 破 碎 仪
化学破碎法
利用各种化学试剂破坏细胞膜的结构， 增加膜的通透性。 有机溶剂 常用的有机溶剂有：甲苯、丙酮、丁醇 等。 表面活性剂 离子型，非离子型（特里顿、吐温）
酶的提取与分离纯化课件
18
提取目标：
a. 将目的酶最大限度地溶解出来。 b. 保持生物活性。
注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活， 一般采用低温下（0~10℃）操作。
19
提取原则
a. 相似相溶。 b. 远离等电点的pH值，溶解度增加。
20
提取方法：
（一）盐溶液提取 常用稀盐（常用NaCl）溶液（盐溶），
酶的提取与分离纯化
知识回顾
酶蛋白制备
构分
发
分
建离
酵
离
表选
生
纯
达育
产
化
产酶菌株
发酵液
酶制品
2
第四章 酶的提取与分离纯化
预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞 破碎（分离胞内产物）等。
初步纯化（rough fractionation） （提取）：除 去与目的产物性质差异很大的杂质。
高度纯化（fine fractionation） （精制）：除去 与产物性质相似的杂质。
脂蛋白 脂多糖 (11% ~ 22%)
磷脂 蛋白质
葡聚糖(30% ~ 40%) 多聚糖
甘露聚糖(30%) (80% ~ 90%)
几丁质(1% ~ 2%)
脂类
蛋白质(6% ~ 8%) 蛋白质
脂类(8.5% ~ 13.5%)
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细菌细胞壁的结构
10
酵母菌细胞壁的结构 M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖
6
(二）发酵液的固液分离
1 . 影响发酵液过滤的因素 1）菌种 2）培养基组成 2. 提高过滤性能的方法
1）絮凝和凝聚 2）稀释、加热 3）加助滤剂，常用硅藻土等。
7
二、细胞破碎（胞内酶）
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
酶工程 第四章酶的分离纯化 第一节细胞破碎
第一节 细胞破碎
2．表面活性剂处理 表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用， 使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。
表面活性剂有离于型和非离子型之分，对细胞破碎效 果而言，离子型表面活性剂较有效，但由于离子型表面活 性剂会使酶的结构破坏，引起酶变性失活。所以，在酶的 提取方面一般不采用离子型表面活性剂。而采用非离子型 的特里顿(Triton)、吐温(Tween)等表面活性剂。例如，用 特里顿X—100处理诺卡氏菌细胞，从而提取胆甾醇氧化 酶，用胆酸盐处理细胞，提取一种膜结合的葡聚糖酶等。 处理完后，可采用凝胶层析等方法，将表面活性剂除去， 以免影响酶的进一步分离纯化。
•
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
由于溶菌酶等上述列举的酶价格较高，而且外加酶本身混入细胞
破碎液中成为杂质，故此，外加溶菌酶的方法难以用于大规模工业生
产。
第一节 细胞破碎
2.自溶法
将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下保温一段时 间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释 出的方法称为自溶法。
自溶法效果的好环取决于自溶条件。主要有温度、pH 值、离子强度等。自溶时间一般较长，不易控制，为防止 其他微生物在自溶液中滋长，必要时可加入甲苯、氯仿、 叠氮钠等杀菌剂。
第一节 细胞破碎
三、渗透压法
渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗 溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。如红血球在纯水中 会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的多糖细胞 壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方 法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。
四、化学破碎法
化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细 胞膜的结构改变或破坏的方法。
表面活性剂处理法对膜结合酶的提取特别有效，在实 验室和生产中均已成功使用。
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化学破碎法取决于化学试剂的类型以及细 胞壁膜的结构与组成，不同化学试剂对各 种微生物作用的部位和方式有所不同。
常用的化学试剂：有机溶剂和表面活性剂
1、有机溶剂
能破坏细胞壁中的类脂。 常用试剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透
过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞 外。
一、机械破碎法
通过机械运动所产生的 剪切力的作用，使细胞破 碎的方法 1、机械捣碎法： 器械：捣碎机。 常用于动物内脏、植物叶 芽等比较脆嫩的组织细胞 破碎，也可用于微生物， 特别是细菌的细胞破碎。
一、机械破碎法
2、研磨法 器械：研钵、细菌磨等。设备简单，效率较低，常 用于微生物和植物组织细胞的破碎。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
超声波细胞粉碎机（液晶显示）
3、超声波破碎法
一、机械破碎法
3、匀浆法 器械：匀浆器。 通常用于破碎那些易于 分散、比较柔软、颗粒 细小的组织细胞，细胞 破碎程度较高，其机械 切力对酶的破坏也较少， 但难于在工业生产上应 用。
二、物理破碎法
各种物理因素：温度、压力、声波等的作用， 使组织细胞破碎的方法。
多用于微生物细胞的破碎。
1、温度差破碎法
利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用使 细胞破碎。
温度差破碎法对那些较脆弱、易破的细胞破碎 效果好，但在酶的提取时，不能在过高的温度 下操作，以免酶失活。
此法难以用于工业生产。
2、压力差破碎法
高压细胞破碎机
（1）高压冲击法 （2）突然降压法
取决因素： a.压力差 b.压力减低的速度 c.细胞种类和生长期
超声波破碎法特点：
处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失 少、效果好；
是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物 细胞的破碎。
超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常 在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却 剂进行冷却。
4、反复冻融法
将待破碎的细胞放在低温下（-15～-20℃）突然 冷冻，然后在室温（或40℃）下缓慢地融解，如 此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞 液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
酶的提取与分离纯化定义
将酶从细胞或其它酶原料中提取出来，再 与杂质分开，而获得所需酶制品的技术过 程，主要包括细胞破碎、提取、离心分离、 过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电 泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
酶提取( 粗提) 酶分离纯化
干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活 性物质变性。
三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
三、化学破碎法
发酵液
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破 细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可 以粗略去除蛋白质以外的物质。
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使 用各种 柱层析法。
只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需 反复多次。
在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
5、干燥法
多种方法使细胞干燥，如气流干燥、真空干燥、 喷雾干燥和冷冻干燥等。
通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变 细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对 干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出 来。
此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌效果较佳，最 好使用对数生长期的细胞。
（3）渗透压差法
步骤：
高渗平衡→转入低渗溶液→低渗溶胀破裂
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。 影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。 必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频10 kHz或20 kHz；功率100～150W；温度 0～10℃；pH4～7；处理时间3～10 min，最好间隔几次操作；细 胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破 碎。细胞浓度一般以1 g湿菌体加1～2 mL缓冲液为宜。
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制 纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。
第一节 细胞破碎（Cell Disruption ）
细胞破碎：是通过各种方法使细胞外层结构破 坏的技术过程。
表4-1 细胞破碎方法及其原理
分类
细胞破碎方法
捣碎法 机械破碎法 研磨法
匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 物理破碎法 超声波破碎法 反复冻融法某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞 的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白 作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。
例如，TritonX-100（特里顿）是一种非离子型清洁 剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶 解磷脂，其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层， 从而使某些胞内物质释放出来。
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎
化学破碎法
添加有机溶剂、 添加表面活性剂
通过各种化学试剂对细胞膜 的作用，而使细胞破碎
酶促破碎法
自溶法 外加酶制剂法
通过细胞本身的酶系或外加 酶制剂的催化作用，使细胞 外层结构受到破坏，而达到 细胞破碎
常用的化学试剂：有机溶剂和表面活性剂
1、有机溶剂
能破坏细胞壁中的类脂。 常用试剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。 可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透
过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释放出胞 外。
一、机械破碎法
通过机械运动所产生的 剪切力的作用，使细胞破 碎的方法 1、机械捣碎法： 器械：捣碎机。 常用于动物内脏、植物叶 芽等比较脆嫩的组织细胞 破碎，也可用于微生物， 特别是细菌的细胞破碎。
一、机械破碎法
2、研磨法 器械：研钵、细菌磨等。设备简单，效率较低，常 用于微生物和植物组织细胞的破碎。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
超声波细胞粉碎机（液晶显示）
3、超声波破碎法
一、机械破碎法
3、匀浆法 器械：匀浆器。 通常用于破碎那些易于 分散、比较柔软、颗粒 细小的组织细胞，细胞 破碎程度较高，其机械 切力对酶的破坏也较少， 但难于在工业生产上应 用。
二、物理破碎法
各种物理因素：温度、压力、声波等的作用， 使组织细胞破碎的方法。
多用于微生物细胞的破碎。
1、温度差破碎法
利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用使 细胞破碎。
温度差破碎法对那些较脆弱、易破的细胞破碎 效果好，但在酶的提取时，不能在过高的温度 下操作，以免酶失活。
此法难以用于工业生产。
2、压力差破碎法
高压细胞破碎机
（1）高压冲击法 （2）突然降压法
取决因素： a.压力差 b.压力减低的速度 c.细胞种类和生长期
超声波破碎法特点：
处理少量样品时操作简单、快捷、液量损失 少、效果好；
是最常用的物理破碎法，特别适用于微生物 细胞的破碎。
超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作时常 在细胞悬浮液中加入冰块或在夹套中通入冷却 剂进行冷却。
4、反复冻融法
将待破碎的细胞放在低温下（-15～-20℃）突然 冷冻，然后在室温（或40℃）下缓慢地融解，如 此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞 液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。
酶的提取与分离纯化定义
将酶从细胞或其它酶原料中提取出来，再 与杂质分开，而获得所需酶制品的技术过 程，主要包括细胞破碎、提取、离心分离、 过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离、电 泳分离、萃取分离、浓缩、干燥、结晶等。
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
酶提取( 粗提) 酶分离纯化
干燥法条件变化剧烈，容易引起蛋白质或其他活 性物质变性。
三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
三、化学破碎法
发酵液
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段： (1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打破 细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀法；可 以粗略去除蛋白质以外的物质。
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化，使 用各种 柱层析法。
只适用于细胞壁较脆弱的菌体，破损率低，常需 反复多次。
在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。
5、干燥法
多种方法使细胞干燥，如气流干燥、真空干燥、 喷雾干燥和冷冻干燥等。
通过干燥使细胞壁膜的结合水分丧失，从而改变 细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对 干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出 来。
此法对大肠杆菌等革兰氏阴性菌效果较佳，最 好使用对数生长期的细胞。
（3）渗透压差法
步骤：
高渗平衡→转入低渗溶液→低渗溶胀破裂
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。 影响因素：细胞浓度、溶液粘度、pH值、温度以及离子强度等。 必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。 一般操作条件为：音频10 kHz或20 kHz；功率100～150W；温度 0～10℃；pH4～7；处理时间3～10 min，最好间隔几次操作；细 胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破 碎。细胞浓度一般以1 g湿菌体加1～2 mL缓冲液为宜。
(3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶的进一步精制 纯化，可用制备式电泳 或 HPLC。
第一节 细胞破碎（Cell Disruption ）
细胞破碎：是通过各种方法使细胞外层结构破 坏的技术过程。
表4-1 细胞破碎方法及其原理
分类
细胞破碎方法
捣碎法 机械破碎法 研磨法
匀浆法
温度差破碎法 压力差破碎法 物理破碎法 超声波破碎法 反复冻融法某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞 的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白 作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。
例如，TritonX-100（特里顿）是一种非离子型清洁 剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶 解磷脂，其作用主要是破坏内膜的磷脂双分子层， 从而使某些胞内物质释放出来。
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎
化学破碎法
添加有机溶剂、 添加表面活性剂
通过各种化学试剂对细胞膜 的作用，而使细胞破碎
酶促破碎法
自溶法 外加酶制剂法
通过细胞本身的酶系或外加 酶制剂的催化作用，使细胞 外层结构受到破坏，而达到 细胞破碎