酶的提取与分离纯化
酶的分离提纯实验原理
酶的分离提纯实验原理酶的分离提纯是指从复杂的混合物中获得纯净的酶样品的过程。
此过程旨在去除其他杂质，并提高酶的比活性和纯度。
酶的分离提纯实验原理可以分为以下几个方面：1. 根据酶的生理特性进行分离：酶的分离可依据酶对pH值、温度、离子浓度、底物特异性等因素的敏感性进行。
常用分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、电泳等。
2. 分离的物理性质利用：酶可根据其分子大小、电荷、溶解度等物理性质进行分离。
例如，凝胶过滤层析通过选用合适的孔径筛选凝胶，使大分子酶无法进入凝胶孔隙，进而实现分离。
3. 分离的化学性质利用：酶可通过与其他物质的特异性相互作用来实现分离。
亲和层析是一种常用的方法，利用酶与某些配体（如某种金属离子、亲合剂等）的特异性结合来分离酶。
在实验中，通常采用以下步骤进行酶的分离提纯：1. 细胞破碎：从生物体中获得酶源，如细胞、组织、分泌物等。
通常使用超声波破碎、搅拌破碎、离心等方法破碎细胞，并保持样品低温以防止酶的失活。
2. 酶提取：将破碎的细胞溶液用适当的缓冲液进行提取，并添加必要的辅助物质（如阻聚剂、金属离子等）以保持酶的稳定和活性。
3. 初步分离：通常先进行粗提，包括沉淀、超滤、离心、酒精沉淀等方法，目的是将酶与其他细胞组分分离开来。
4. 层析：根据酶的物理性质或化学性质选择适当的层析方法。
离子交换层析是常用的方法之一，根据酶与离子交换基质之间的相互作用进行分离。
5. 亲和层析：利用酶与特定配体之间的结合进行分离。
例如，选择性地将酶与亲和基质（如亲和剂或金属离子）结合，然后利用特定条件（如改变pH值或添加竞争性配体）来解离酶。
6. 离心和浓缩：通过离心和浓缩等操作，将目标酶进一步分离和提纯。
7. 再结晶：通过结晶或沉淀等方法进行酶的最终纯化。
8. 活性测定和纯度检验：测定酶的比活性，评估酶的纯度和活性。
总之，酶的分离提纯实验原理基于酶对物理、化学条件的敏感性，通过适当的分离方法和步骤，去除杂质，提高酶的纯度和比活性。
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
简述酶提取的过程及其原理
简述酶提取的过程及其原理酶提取是一种将酶分离、纯化和富集的方法。
它是一项关键的生物技术，广泛应用于医学、食品工业、生物工程和农业生产等领域。
酶提取的过程涉及样品的处理、细胞破碎、分离纯化和稳定等步骤，并且其原理基于酶在化学环境中的特性和提取技术。
酶提取的过程主要包括以下几个步骤：1. 样品的处理：在进行酶提取之前，需要对样品进行必要的处理。
这可能包括去除杂质、脂肪、蛋白质以及其他可能影响酶纯化的成分。
此外，在酶提取之前，还需要对样品进行预处理，如搅拌、离心、过滤等，以达到更好的分离和纯化效果。
2. 细胞破碎：将细胞破碎是酶提取的关键步骤之一。
细胞破碎的目的是释放酶并将其分离出来。
常见的破碎方法有物理破碎、化学破碎和酶解破碎等。
物理破碎主要依靠高压机械力、超声波或高压抗冻聚能技术等。
化学破碎可以使用酸、碱或酶等化学物质来破坏细胞膜结构。
酶解破碎则利用酶的特性来破坏细胞膜。
3. 分离纯化：分离纯化是酶提取的重要步骤之一，目的是从复杂的混合物中高效地分离目标酶。
常见的分离技术有沉淀、过滤、离心、柱层析等。
其中，柱层析是一种常用且有效的方法，根据酶的特性和物理化学性质，通过选择性吸附和洗脱的方法实现酶的纯化。
柱层析常用的分离材料有凝胶过滤、离子交换、亲和层析和凝胶过滤等。
4. 稳定性评估：提取酶之后，需要对酶的稳定性进行评估。
酶在提取过程中常常会受到温度、pH、离子浓度和蛋白质浓度等环境因素的影响，从而导致酶的活性损失或失活。
稳定性评估试验可以通过测定酶的活性来评估其在不同条件下的稳定性，并找出最适宜的储存和使用条件。
酶提取过程的原理主要基于酶分子的特性和物理化学性质，如分子量、电荷、亲和性等。
不同的酶在提取过程中会因其特性的不同而选择不同的提取方法。
下面是几个常见的酶提取原理：1. 溶液条件：酶在某一特定条件下，如适宜的pH、离子浓度、温度等，具有较高的活性和稳定性。
通过调整溶液条件，可以提高酶的活性和稳定性，从而更好地提取酶。
酶的提取与分离纯化
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酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞
酶提取( 粗提) 酶分离纯化
发酵液
酶浓缩 酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
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酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均 质打破细胞 → 抽提出全蛋白，多使用 盐析沉淀 法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。
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3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
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表4-1 细胞破碎方法及其原理
分类
细胞破碎方法
捣碎法
机械破碎法 研磨法
匀浆法
温度差破碎法
压力差破碎法 物理破碎法 超声波破碎法
反复冻融法
干燥法
细胞破碎原理
通过机械运动产生的剪切力， 使组织、细胞破碎
通过各种物理因素的作用，使 组织、细胞的外层结构破坏， 而使细胞破碎
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化学破碎法
添加有机溶剂、 通过各种化学试剂对细胞膜 添加表面活性剂 的作用，而使细胞破碎
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2、表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞 的破碎。表面活性剂可与细胞膜中的磷脂及脂蛋白 作用而破坏膜结构，增加膜的通透性。
酶的分离纯化过程中要注意什么问题
酶分离纯化过程中的问题以及进行酶活力等测定的意义班级:生物技术133 组别：第六组姓名：董冰夏学号：2013013906酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
因为酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
酶的提取及纯化
1，盐析
■ 盐对蛋白质溶解度的影响：
● 盐溶 Salting-in:
加盐使蛋白质溶入水溶液中
● 盐析 Salting-out:
加盐使蛋白质由水溶液中沉淀出來
■ 提高盐浓度会增加蛋白质的溶解度：
溶
pI [NaCl]
解
0.005M
度
0.02M
pH > 5.2
2
0.01M
1
0.001M
pH = 5.2
3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可 达数年之久。
4) 价格便宜。
盐析剂用量的确定
盐浓度的表示法
盐析法中的盐浓度通常以盐溶液的饱和度表示，饱 和的溶液成为100%饱和度。
影响盐析的因素
蛋白质浓度 离子强度和类型 pH 温度
1、动植物酶、微生物胞内酶的酶液制备流程
收集细胞 细胞破碎 固液分离 酶液浓缩
酶液
一、酶液的制备
2、微生物胞外酶的酶液制备流程
发酵液预处理 固液分离 酶液浓缩 酶液
3、细胞破壁的方法：
● 干式： 液态氮研磨, 磨粉机, 球磨机 (ball mill)
● 湿式： 均质机, 果汁机 (Waring blender), Polytron, 研砵,
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
(NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4
0℃ 70.6 4.9 1.6
20℃ 75.4 18.9 7.8
80℃ 95.3 43.3 93.8
100 ℃ 103 42.2 101
2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一 步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
Chapter 3 酶的提取与分离纯化
Chapter 3 酶的分离与纯化我们要研究或使用一种酶，首先要采用相关方法先得到它，因此酶的分离与纯化是酶的生产、应用及酶学性质研究的基础。
Section 1 酶制剂的制备过程一个完整的酶制剂制备方案应该包括：酶活力测定体系的建立、材料的选择、材料的预处理、酶的酶学性质初步研究、酶的分离与纯化、酶制剂的保存。
一、材料的选择注意把握植物的季节性、微生物的生长期（对数生长期）和动物的生理状态等。
二、材料的预处理（一）细胞破碎上节课我们提到根据酶的分布，可将酶分为胞内酶和胞外酶。
若是胞外酶，就不存在细胞破碎的问题，但是胞外酶的种类很少，绝大多数酶都属于胞内酶。
要想获得胞内酶，就得先进行细胞破碎，使酶从细胞内释放出来，这样才能进一步进行酶的提取和分离纯化。
细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶溶法。
在实际使用时，我们要根据细胞的特性和酶的特性选择适宜的方法，有时也可以联合采用2种或2种以上的方法，以达到细胞破碎的效果，而又不影响酶的活性。
1、机械破碎法按照所用破碎机械的不同，又可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法。
（1）捣碎法：常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。
（2）研磨法：常用于微生物和植物组织细胞的破碎。
（3）匀浆法：常用于破碎易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。
大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。
2、物理破碎法根据物理力的不同，可分为冻融法、渗透压法和超声波破碎法。
（1）冻融法：适用于易于破碎的细胞，如革兰氏阴性菌。
如将-20℃冷冻的细胞突然放进沸水浴中，或沸水浴中的热细胞突然放进-70℃冷冻，这样都可以使细胞破坏。
但是，在酶的提取时，要注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。
（2）渗透压法：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞或革兰氏阴性菌。
使用时，先将细胞分离出来，悬浮在高渗透压的溶液中，平衡一段时间后，将细胞迅速转入低渗透压的蒸馏水或缓冲溶液中，由于渗透压的作用而使细胞破碎。