酶的提取与分离纯化(1)
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
酶的提取与分离纯化(1)幻灯片
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第一节 酶的提取与分离纯化技术路线 第二节 细胞破碎和酶的提取
第三节 酶分离方法 第四节 酶的组合分离纯化策略
第五节 酶的浓缩、干燥与结晶
第一节 酶的提取与分 离
常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚 细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系 数一般在1 ~ 200之间。
（二）离心机的种类
按离心机转速的不同，分为： 常速（低速） 高速 超速
离心机的种类
名称 转速(r/min)
注意事项
低速离心机 6000
常温，注意样品热变性和 离心管平衡
高速离心机 6000〜 25000 冷冻（防止温度升高）， 离心管的精确平衡
（a）离心前的悬浮液 （b）～（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况
2．密度梯度离心
（density gradient centrifugation）
样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降 系数比较接近的组分得以分离的一种区带分 离方法。
常用的密度梯度溶液是蔗糖溶液。
特点：
•区带内的液相介质密度小于样品物质 颗粒的密度。 •适宜分离密度相近而大小不同的固相 物质。
超速离心机 >25000
冷冻＋真空系统（减少空 气阻力和摩擦），
离心管的精确平衡
实验室离心机
温度类型：常温及 冷冻
超速离心机均为冷 冻型。
使用冷冻离心机时 提前降温，预冷离 心头。
使用超速离心机时 先抽真空。
离心的形式
角式及外摆式：外摆式一般为低速，
有。
角式由低速到超速均
酶工程期末复习题
第一章绪论问题：试述木瓜蛋白酶的生产方法？答：木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程菌发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。
(1)提取分离法：从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。
(2)发酵法：通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，在通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。
(3)植物细胞培养法：通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，在通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶。
第二章微生物发酵产酶1、解释酶的发酵生产、酶的诱导、酶的反馈阻遏(产物阻遏)、分解代谢物阻遏。
诱导物的种类？答：酶的发酵生产：利用微生物的生命活动获得所需的酶的技术过程；酶的诱导：加进某些物质，使酶的生物合成开始或加速的现象，称为诱导作用；产物阻遏（反馈阻遏）：指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使该酶的生物合成受到阻遏的现象。
分解代谢物阻遏（营养源阻遏）：是指某些物质经过分解代谢产生的物质阻遏其他酶合成的现象。
诱导物的种类：诱导物一般是酶催化作用的底物或其底物类似物，有的也是反应产物。
2、微生物产酶模式几种？特点？最理想的合成模式是什么？答：（1）同步合成型特点：a.发酵开始，细胞生长，酶也开始合成，说明不受分解代谢物和终产物阻遏。
b.生长至平衡期后，酶浓度不再增长，说明mRNA很不稳定。
（2）延续合成型特点：a.该类酶一般不受分解代谢产物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA是相当稳定的。
（3）中期合成型特点：a.该类酶的合成受分解代谢物阻遏和终产物阻遏。
b.该酶对应的mRNA不稳定。
（4）滞后合成型特点：a.该类酶受分解代谢物阻遏和终产物阻遏作用的影响，阻遏解除后，酶才大量合成。
b.该酶对应的mRNA稳定性高。
选择：在酶的工业生产中，为了提高酶产率和缩短发酵周期，最理想的合成模式是延续合成型。
3、可以添加什么解除分解代谢物阻遏？表面活性剂的作用？答：（1）一些酶的发酵生产时要控制容易降解物质的量或添加一定量的cAMP，均可减少或解除分解代谢物阻遏作用。
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告
溶菌酶的提取分离和纯化实验报告生物工程综合实验溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定实验报告集班级生工1411学号组别7姓名实验室学生守则一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员的指导。
二、严格按照实验要求，做好实验预习,实验之前5分钟进入实验室，及时、准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。
三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。
凡不按教师的指导擅自操作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。
四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。
未经允许不得随便挪动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室外。
五、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和吃东西。
六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管理人员报告。
七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作，经指导老师许可后，方可离开。
预习报告（手写，可自行续页）溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定名称实验目的和要求：实验材料：主要仪器：主要步骤：教师签名：时间：实验报告溶菌酶的提取、分离纯化及其活性测定一、目的对从鸡蛋清中提取并分离纯化出溶菌酶进行活性测定二、原理鸡蛋是溶菌酶的主要来源，等电点约为10.5~11，最适温度50℃，最适pH为6~7左右。
1、溶菌酶分离纯化原理：（1）等电点法利用溶菌酶等电点较高，在酸性条件下除去一些杂蛋白（2）阳离子树脂柱层析法进一步除去杂蛋白2、溶菌酶鉴定分析（1）考马斯亮蓝法测蛋白含量（2）分光光度法测定酶活性（3）使用SDS-PAGE 鉴定溶菌酶纯度三、实验材料与方法1、实验材料与试剂鸡蛋清，PBS缓冲液，40%甘油、冰醋酸、氢氧化钠，D152大孔弱酸性阳离子交换树脂、透析袋，考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸，溶菌酶标准品、底物微球菌粉，蛋白质分子量Marker 、SDS、聚乙二醇-20000等2、实验仪器低速离心机、高速冷冻离心机、离心管、分光光度计，玻璃层析柱，Bio-Rad垂直电泳系统，移液枪、移液管，培养皿、玻璃棒、普通漏斗、滤纸、量筒、刻度试管及试管架、冰箱、摇床、烧杯、止水夹等。
酶工程复习
酶工程复习一、名词解释1、诱导与阻遏：诱导是加进某种物质，使酶的生物合成开始或加速进行的过程。
阻遏是容易利用的碳源的分解代谢的产物阻遏某些酶（主要是诱导酶）生物合成的现象。
2、最适生长温度与最适生产温度：最适生长温度是在该温度下，微生物细胞的生长速率最大。
最适产酶温度低于最适生长温度，在较低温度下，提高酶的稳定性，延长细胞产酶时间。
3、生长因子：细胞生长繁殖不可缺少的微量有机化合物，如aa, 嘌呤，嘧啶，激素4、等电点沉淀利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电点沉淀。
5、盐析沉淀是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特点，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离的过程。
6、酶分子修饰：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。
7、分子内交联修饰：含有双功能基团的化合物（双功能试剂）如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定性的修饰方法称为分子内交联修饰。
8、酶的有限水解修饰：在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为肽链有限水解修饰。
9、酶的定点突变技术：定点突变技术是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的的操作技术。
10、侧链基团修饰：采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法称为侧链基团修饰。
11、抗体酶（Catalytic antibody) ，又称催化抗体，是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学性质，还类似于酶，能催化某种活性反应,是一种新型人工酶制剂，是一种具有催化功能的抗体分子。
酶工程-04-酶的提取与分离纯化
三足离心机 32 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
1、差速离心
采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒 先后分离的方法。
应用范围:大小和密度有较大差别的颗粒。
大
中
小
33 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
2、密度梯度离心
在离心管中用5~60%的蔗糖溶液，形成由管底到液面逐渐 降低的梯度，将样品放在密度梯度溶液的表面，经过离心，不 同大小、具有一定沉降系数差异的颗粒在密度梯度溶液中形成 若干条不连续的区带。
广泛应用于生物工程、化学、制药、 饮料、电力、冶金、海水淡化、资源 再生等领域。
渗出液 40
膜分离技术的地位和影响
美国官方文件曾说“18世纪电器改变了整个工业进程 ，而20世纪膜技术将改变整个面貌”，“目前没有一 种技术，能像膜技术这么广泛地被应用”
日本和欧洲则把膜技术作为21世纪的基盘技术进行研 究和开发。
常用的离心介质：铯盐，如CsCl，Cs2SO4，CsBr
36 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
先把一定浓度的铯盐溶液与样品液混合均匀，也可将一定量 的铯盐加到样品液中使之溶解。 在选定的离心力作用下，经过足够时间的离心分离。 铯盐在离心力的作用下，在离心力场中沉降，自动形成密度 梯度。 样品中不同浮力密度的颗粒在其各自的等密度点位置上形成 区带。
梯度介质：蔗糖密度梯度系统
34 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
密度梯度的制备：密度梯度混合器
35 武汉生物工程学院生物工程系酶工程教研室
3、等密度梯度离心
当欲分离的不同颗粒的密度范围处于离心介质的密度范围 时，在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒一直移动到与他 们各自的浮力密度恰好相等的位置，形成区带。
酶的提取与分离纯化
整理课件
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三、化学破碎法
应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的 结构改变或破碎的方法。
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活 性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞 壁和膜的通透性（渗透性），从而使细胞内物 质有选择地渗透出来。
适用范围：
膜结合的酶、细胞间质酶等的提取 无壁或壁破坏
整理课件
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3、超声波破碎法
超声波：通常人的耳朵可听到的 声音频率范围为16-20kHz，频率 高于20 kHz的波。
其破碎机理可能与空化现象引起 的冲击波和剪切作用有关。在超 声波作用下，细胞膜由于空穴作 用而破碎。
由于空化作用而使液体形成局部 减压引起液体内部发生流动，旋 涡生成与消失时，产生很大的压 力使细胞膜破裂到达破碎细胞的 效果。
整理课件
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酶溶法的优点：
选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
酶溶法的不足：
1、溶酶价格高，限制了大规模应用，若回收溶酶则又需要 增加分离纯化溶酶的操作和设备，其费用也不低；
因为加入的溶菌酶、几丁质酶等价格高，而且外加酶本身混 入细胞破碎液中成为杂质，所以只适于实验室采用。
2、酶溶法通用性差，不同菌种需选择不同的酶，且不易确 定最佳的溶解条件。
整理课件
36
第二节 提取（ Extraction ）
酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液 处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。 也称为酶的抽提。
酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当 的溶剂：
极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极 性的有机溶剂中，
酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶 剂中。
Chapter 3 酶的提取与分离纯化
Chapter 3 酶的分离与纯化我们要研究或使用一种酶，首先要采用相关方法先得到它，因此酶的分离与纯化是酶的生产、应用及酶学性质研究的基础。
Section 1 酶制剂的制备过程一个完整的酶制剂制备方案应该包括：酶活力测定体系的建立、材料的选择、材料的预处理、酶的酶学性质初步研究、酶的分离与纯化、酶制剂的保存。
一、材料的选择注意把握植物的季节性、微生物的生长期（对数生长期）和动物的生理状态等。
二、材料的预处理（一）细胞破碎上节课我们提到根据酶的分布，可将酶分为胞内酶和胞外酶。
若是胞外酶，就不存在细胞破碎的问题，但是胞外酶的种类很少，绝大多数酶都属于胞内酶。
要想获得胞内酶，就得先进行细胞破碎，使酶从细胞内释放出来，这样才能进一步进行酶的提取和分离纯化。
细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶溶法。
在实际使用时，我们要根据细胞的特性和酶的特性选择适宜的方法，有时也可以联合采用2种或2种以上的方法，以达到细胞破碎的效果，而又不影响酶的活性。
1、机械破碎法按照所用破碎机械的不同，又可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法。
（1）捣碎法：常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。
（2）研磨法：常用于微生物和植物组织细胞的破碎。
（3）匀浆法：常用于破碎易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。
大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。
2、物理破碎法根据物理力的不同，可分为冻融法、渗透压法和超声波破碎法。
（1）冻融法：适用于易于破碎的细胞，如革兰氏阴性菌。
如将-20℃冷冻的细胞突然放进沸水浴中，或沸水浴中的热细胞突然放进-70℃冷冻，这样都可以使细胞破坏。
但是，在酶的提取时，要注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。
（2）渗透压法：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞或革兰氏阴性菌。
使用时，先将细胞分离出来，悬浮在高渗透压的溶液中，平衡一段时间后，将细胞迅速转入低渗透压的蒸馏水或缓冲溶液中，由于渗透压的作用而使细胞破碎。
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③ 层析柱的制备与层析操作
★
●柱层析的设备:
层析柱、蠕动泵（恒流泵）、紫外检测仪、
部分收集器、梯度洗脱器。
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层析装置： 梯度混和器 蠕动泵 层析柱 监测仪 记录仪 收集器
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微滤
截留颗粒 直径
0.2-2m
操作压力 <0.1MPa
应用 除菌
超滤 反渗透
20A-0.2 m <20A
0.1-0.7MPa 分离病毒及生 物大分子
0.7-13MPa 纯水制备
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6
微滤 ●
(Microfiltration，MF)
一种静态过滤，
随过滤时间延长，膜
面上截流沉积不溶物，
引起水流阻力增大，
第三章 酶的提取与分离纯化
第三节 酶的精制 (纯化)
酶纯化的基本原则： ①建立一个方便灵敏的分析方法； ②选择有效的纯化方法，尽可能减少纯化步骤； ③常在低温（4℃）条件下进行纯化，以避免酶的变 性。
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1
★
一、膜分离
借助一定孔径的高分子薄膜，将 不同大小、形状、性质的颗粒或分子 进行分离的技术。
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13
★
① 层析法的基本原理
利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如 吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分 在流动相和固定相中的分布程度不同，并以不同 的速度移动而达到分离的目的。
流动相：携带样品流过整个系统的流体.有两种状态： *液体作为流动相 *气体作为流动相
交联度越小，孔径越大，分离范围越广。
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★
葡聚糖凝胶层析介质的有关参数
凝胶型号 颗粒大小 /μm
19
低温层析柜
记录仪
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20
★
2 吸附层析（adsorption chromatography）
①原理:利用固定相的固体吸附剂表面对 不同组分吸附力的大小及洗脱液对它的溶解 作用（解吸作用）的差异进行分离。
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21
★
吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关
吸附层析的关键是吸附剂医学和课件洗pp脱t 剂的选择。
层析法也称色谱法，是1903年俄国植物学 家Michael Tswett发现并命名的。将植物色素 溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用 石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动
后形成不同的色带而被分开。
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12
色谱起源
色素
碳酸钙颗粒
石油醚
★
色谱
组分
用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography) 。
通过反渗透膜而从溶液中分离出来的过程。
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10
渗透与反渗透
★
3. 电场膜分离
电渗析： 在半透膜的两侧分别装上正、负电极。
离子交换膜电渗析： 用离子交换膜代替一般的半透膜。
应用： 脱盐，海水淡化，纯水制备，从发酵液中分 离柠檬酸、谷氨酸及凝胶电洗脱。
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★
二、层析法
1 概况
8
★
超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯 化中有广泛的应用。 利用超滤膜在一定压力下使溶液中大分子 滞留，而小分子及溶剂滤过的方法。
(A)
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(B)
9
常规过滤(A)和超滤(B)的示意图
●反渗透（Reverse osmosis，RO）
★
利用反渗透膜选择性地只能透过溶剂
(通常是水)的性质，对溶液施加压力，使溶剂
22
★
②吸附剂
吸附剂通过范德华力、静电引力、疏水作用等 与待分离物质的极性官能团作用。 ●吸附剂的选择：
根据吸附能力强弱分为： 弱吸附剂：蔗糖、淀粉 中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等 强吸附剂：氧化铝、活性炭
作业:1膜分离的原理﹑有哪些类型
2层析法的原医理学课﹑件pp有t 哪些类型
23
★
3 凝胶过滤层析
凝胶过滤（gel filtration）又称分子筛层析 （molecular sieve chromatography）、排阻层析 （exclusion chromatography）,是以各种多孔凝胶为 固定相，利用溶液中各组分的分子量不同 而进行分离的技术。
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★
①基本原理
大分子物质不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；
固定相: 静止不动的一相.两种状态 *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相
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② 层析法的分类
●按两相所处的状态分类：
液相层析 液-固层析 液-液层析
气相层析 气-固层析 气-液层析
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★
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★
●按层析过程的机理分类：
吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附 性能的差异。
透水速率下降，直至
微孔全被堵塞；
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★
原 料 液
渗 透 液 无 流 动 操 作
7
超滤 ●
(ultrafiltration，UF )
★
一种动态过程，由泵提供推动力，在膜
表面产生两个分力：一个是垂直于膜面的法
向分力，使水分子透过膜面，另一个是于膜
面平行的切向力，把膜面截流物冲掉。
超滤医原学理课件的pp示t 意图
分配层析：利用不同组分在流动相和固定相 之间的分配系数的不同。
离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂 亲和力的不同。
凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小 的组分阻滞作用的不同。
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★
●按操作形式不同分类：
柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向 移动而达到分离。
纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动 相展开，以达到分离鉴定的目的。
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2
1 扩散膜分离
★
——透析（dialysis）
溶质分子Y 从高浓度一医侧学课通件p过pt 膜向低浓度一侧移动
3
★
蛋白质透析
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4
透析膜 材 料：纤维素衍生物 袋的形状: 管状 目 的: 除杂质 保 存: 防腐剂＋冷藏。
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★
5
★
2 加压膜分离
根据所截留物质颗粒大小的不同，分为：
小分子物质可自由出入凝胶孔，流程长而后流 出层析柱。
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Size-exclusion chromatography
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★
② 凝胶的种类和性质
▼交联葡聚糖凝胶（dextran gel) 商品名:Sephadex 型号 Sephadex G－10至G-200 G 后的数字为凝胶吸水值的10倍。数字越大，