研究生课程-基因工程考试复习题集

名词解释1、基因组基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。

说的更确切些，核基因组是单倍体细胞核内的全部DNA分子；线粒体基因组则是一个线粒体所包含的全部DNA分子；叶绿体基因组则是一个叶绿体所包含的全部DNA分子。

2、星号活性在非最适的反应条件下，酶的识别特异性降低，产生非特异性带，这种酶切特异性降低的现象，称为星活性。

3、退火是指在温度降低时，DNA发生复性的过程，即变性后的两条单链以碱基互补为原则配对形成氢键，结合成双链。

4、BLASTBLAST是“基本局域联配搜索工具”( Basic Local Alignment Search Tool)的字头缩写, 是最常用的比较核酸和蛋白质同源性的比较工具。

BLAST程序能迅速与公开数据库进行相似性序列比较。

BLAST结果中的得分是对一种对相似性的统计说明。

5、α-互补有的质粒载体上带有β-半乳糖苷酶基因(lac Z)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。

其相应宿主细胞带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。

在各自独立的情况下, 载体和宿主细胞编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。

但它们融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。

这种现象叫α-互补。

简言之，A -互补是指E. coli β-半乳糖苷酶的两个无活性片段( N端片段和C端片段)组合而成为功能完整的酶的过程。

这种lac Z基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。

6、同工酶生物体内催化相同反应而分子结构不同的酶同裂酶：指来源不同但识别相同的核苷酸靶系列，切割位点相同，切割后形成相同的粘性末端的限制性内切酶。

同尾酶：来源不同，识别的靶系列也各不相同，但切割后产生相同的粘性末端的限制酶。

7、质粒质粒(Plasmid) 是细菌菌体内的一种环状DN A分子，是一种染色体外的稳定遗传因子，它可以独立于细菌的染色体DNA 而复制。

8、基因工程在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构建遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的寄生细胞内，而能持续稳定地繁殖。

基因工程：又叫基因操作或重组DNA技术，在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA)，转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。

或：克隆编码特定性状的基因，通过生物、物理和化学等方法，导入到受体生物细胞，然后通过组织培养培育出转基因个体的整个过程。

9、克隆Clone(名词)：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子细胞或个体所组成的特殊的生命群体。

Clone(动词)：产生一个遗传上同一的DNA分子细胞或个体所组成的特殊的生命群体的过程。

10、DNA克隆将某一特定DN A片段通过重组DN A技术插入到一个载体( 如质粒和病毒等)中, 然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该DNA片段的“群体”。

简答题1、TA克隆原理及影响因素。

TA克隆原理：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。

其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。

怎样提高pMD18-T Vector的克隆效率?1. 纯化PCR产物。

切胶回收的PCR片段最好2. 除去残存的引物等杂质。

3. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。

一般情况下，大片段DNA 的克隆效率（连接效率与转化效率）小于短片段DNA，在使用大片段DNA的连接液进行转化时，建议采用电转化方法。

PCR产物难以插入载体，为什么?1. 确认PCR反应使用的DNA聚合酶在PCR产物的3'端是否附加了"A"。

有些DNA聚合酶扩增的PCR产物是平端,如使用本公司的Pyrobest DNA聚合酶 (TaKaRa Code: DR005)等扩增得到的PCR产物不能直接用于TA克隆；PCR产物保存时间不要过长, 长时间保存的PCR 产物会脱去末端的"A"碱基。

2. PCR产物中短片段杂质DNA太多，这时应切胶回收纯化DNA片段，回收时PCR产物不要在紫外线下暴露时间过长。

3. 确认感受态细胞的转化效率，使用的感受态细胞的转化效率最好大于108 cfu/mg pUC118 DNA。

4. 确认Ligation Solution I 的连接效率是否降低，多次反复冻融会降低的Ligation Solution I 连接效率。

5. 确认抗生素的浓度是否过大。

6. 最好使用新配制的平板培养基（T载体技术是比较简便有效的，尤其对于一些多克隆位点的可选择内切酶种类稀少的表达载体该技术特别适用，该方法具有不需对引物进行特殊酶切位点的修饰，既能直接进行PCR产物的克隆，并具有克隆效率高的特点。

）2、PCR的原理及基本过程。

原理：原理类似于DNA的天然复制过程。

人工合成与待扩增的DNA片段的两翼相互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，可将目的DNA扩增上百万倍。

3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。

从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增10 6-10 9倍。

过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成PCR模拟DNA的天然复制过程，在试管内创造合适的条件，以给定的DNA为模板，以恰当的寡聚核苷酸为引物，以四种脱氧核糖核苷酸为底物，由DNA聚合酶催化特定DNA链进行合成（扩增）。

①变性(denaturation)是指通过加热使DNA双链间的氢键断裂，形成两条单链DNA的过程。

通常加热到92～95℃可使一切复杂的DNA发生变性。

②退火(annealling)是指在温度降低时，DNA发生复性的过程，即变性后的两条单链以碱基互补为原则配对形成氢键，结合成双链。

③延伸(extention)是指从引物的3’端开始，沿DNA模板，按碱基配对与半保留复制原理，由DNA聚合酶催化合成一条新的与模板DNA链互补的复制链3、Southern印记杂交的基本原理及应用。

Southern杂交：DNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。

被检对象为DNA，探针为DNA或RNA。

步骤：Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列，它包括下列步骤:（是以DNA或RNA为探针，检测DNA链，用于鉴定基因的存在或整合）(1) 酶切DNA, 凝胶电泳分离各酶切片段,然后使DNA原位变性。

(2) 将DNA片段转移到固体支持物(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。

(3) 预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。

(4) 让探针与同源DNA片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针。

(5) 通过显影检查目的DNA所在的位置。

4、谈谈如何用双酶切鉴定外援DNA在重组质粒中的插入方向，说说其原理并用图表示。

在基因插入的邻近末端部位选择一个单酶切位点（B），在载体上选择一个单酶切位点（A），用这个内切酶分别酶切两份重组质粒，正反两个方向的插入将产生不同大小的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳即可鉴定插入片段的方向是否正确。

5、在抗生素平板上筛选阳性转化子，为什么会出现假阳性现象？如何防止这种现象？x-gal没有涂均匀，IPTG也混合不均匀；载体自连；质粒载体的质量问题；连接反应不充分，反应液混合不均匀；涂完菌液后，培养基平板未正放至菌液完全干；培养时间过长，细菌产生一些酶降解Amp，使非转化子单菌落长出来防治假阳性的产生：生长够16-24小时后，在4℃下放置3-4小时，有些假阳性会变成蓝色；实验时防止污染；连接反应液一定要摇匀，且在合适条件下反应；使用高效率的感受态细胞；严格按照操作步骤进行，尤其是各步处理时间一定要够。

6、在植物基因工程中，农杆菌作用遗传转化的原理。

冠瘿瘤的形成是根癌农杆菌染色体外的遗传物质Ti质粒上的一段DNA(T—DNA)转移到植物细胞，整合到染色体组并进行表达的结果。

这种具有天然转基因功能的质粒，改造后，在基因工程中可以用作基因转移的载体。

根癌农杆菌中诱导植物产生肿瘤的质粒，简称Ti质粒。

野生型根癌农杆菌的Ti质粒含有2个与致瘤有关的区域：一个是T-DNA区，含有致瘤基因；另一个是毒性区，在T—DNA的切割、转移、整合过程起作用．用于植物基因转化的农杆菌Ti质粒中致瘤基因删除。

并在T—DNA 区域插入适当的选择标记和多克隆位点。

Ti质粒的特点：Ti质粒上的T-DNA区域直接参与转移并整合到植物染色体基因组上；但T-DNA区域内部的所有基因与转移无关，只与左右边界有关。

（将T-DNA最右端的25 bp 的序列称为右边界，最左端的25 bp的序列称为左边界。

）在不破坏左右边界的前提下，将天然Ti质粒上T-DNA区域中的的致瘤基因全部缺失即卸甲（disarm）后，将目的基因、选择标记基因或其他序列插入到这个区域内，形成的重组的TDNA仍可将左右边界内的序列转移并整合到植物染色体基因组上。

7、CTAB法提取DNA各种试剂的作用是什么？原理：通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

1、Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；2、EDTA-2Na 螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；3、NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；4、CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；5、β- 巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除8、聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶的异同。