第7章 植物基因转化及检测(植物基因工程)

① 编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；
② 基因较小，可构成嵌合基因； ③ 能在转化体中得到充分表达； ④ 检测容易，并能定量分析。
1. 抗生素类选择标记基因
新霉素磷酸转移酶基因 (Neomycine phosphptransferase-II ， NptII) 、 氯 霉 素 乙 酰 转 移 酶 (Chloraphenicol acetyltransferase ， Cat) 基 因 、 潮 霉 素 磷 酸 转 移 酶 (Hygromycin phosphortransferase，Hpt)基因等。 新霉素磷酸转移酶基因是植物基因转化中应用最广泛的选 择标记基因。用卡那霉素（ Kanamycin ）、新霉素作为选 择性物质加入培养基中，可对转化植株进行筛选。
（4）胚状体受体系统
胚性细胞具有很强的接受外源DNA的能力，转化获 得的转基因植株嵌合体少，遗传背景一致、无性系 变异小、胚的结构完整、成苗快、数量大。
优点 接受外源DNA能力强，繁殖容易，转化率高
个体间遗传背景一致，无性系变异少
目前认为胚状体是较理想的转化受体
2、基因导入植物细胞的方法
（1）载体导入法：用改造的质粒或其 它载体携带脱氧核糖核酸DNA进入植 物细胞 （2）直接导入法：靠物理或化学方法 将植物细胞“打个洞”，然后让外源的 脱氧核糖核酸DNA进入。
叶盘转化法（leaf dish transformation）
农杆菌的培养及活化 剪有伤口的叶片预培养（2~3d）
农杆菌浸染（20min） 共培养（2~3d） 筛选（培养基中加入50mg/l的卡那和100mg/l的羧卞青霉素） 抗性芽的获得 生根培养基（其中加入50mg/l的卡那）中生根后 转基因植株的移栽
分子生物学及抗虫性检测
1. 共培养
2. 在选择培养基上筛选
3. 筛选获得的抗性愈伤
F
5. 胚萌发成苗
6. 转基因植株移栽大田
4. 抗性愈伤分 化成胚状体
DNA直接导入的基因转化方法
化学法：PEG法和脂质法
物理法：基因枪法、电击法、超声波法、激光 微束法和显微注射法
基因枪转化法
原理：利用高速飞行的微米或亚 微米级惰性粒子(钨或金粉)，将 包被其外的目的基因直接导入受 体细胞，并释放出外源DNA，使 DNA在受体细胞中整合表达，从 而实现对受体细胞的转化。 金属：金粉，钨粉
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1、植物基因转化的受体系统及遗传转化
• • • • • （1）原生质体受体系统 优点 外源DNA易于到入细胞 转化细胞为单克隆，再生植株中嵌合体少 可适用于多种转化方法，如电击法、PEG法、显 微注射法和脂质体法 • 缺点 • 原生质体培养所产生的细胞无性系变异大，遗传 稳定性差 • 原生质体培养培养难度大，植株再生频率低
2. 除草剂类选择标记基因
例 如 草 甘 磷 是 EPSP 合 成 酶 (5-enolphyruvylshikimate 3phosphate synthase) 的 抑 制 剂 、 磺 酰 脲 是 乙 酰 乳 酸 (acetolactate)合成酶(Als)的抑制剂。
3. GUS基因(β-葡萄糖苷酸酶基因)
转基因方法
DNA间接转化法
转化的优点
受体种类，可以在原生质体 、蛋细胞和细胞团、组织器 官或整株等多级水平上进行 ，方法成熟可靠，简便易行 ，周期短，转化率高；
转化的缺点
转化双子叶植物为主。大 多数单子叶植物和裸子植 物对农杆菌的侵入不敏感 ，限制了该法在禾谷类作 物中的应用。 转化体常出现“嵌合”现 象，需在严格条件下加以 选择以淘汰未转化细胞 转化效率低，需要专门设 备（电击仪、显微操作仪 或基因枪），多数需要原 生质体与愈伤组织，周期 太长（电击法）
Reporter gene without start codon Reporter gene with start codon 0 = no reporter gene, 1 = gusA, 2 = gfp, 3 = gusA:gfp, 4 = gfp:gusA Polylinker derivatives 0 = from pUC18 8 = from pUC8 9 = from pUC9 Resistance gene for selection in bacteria 2 = chloramphenicol resistance gene 3 = kanamycin resistance gene Resistance gene for selection in plants 1 = hygromycin resistance, hptII gene 2 = kanamycin resistance, nptII gene
4. 荧光素酶基因
荧光素酶（Luciferase, Luc）基因是生物体催化自身发光 的一种蛋白质。 Luc 基因可以作为报告基因，检测与 Luc 基因嵌合的目的基因的表达情况。
5. 无选择标记基因的转化系统
在植物的遗传转化中，通常利用抗生素类、除草剂类及有 毒物质基因作为选择标记，从非转化细胞中选择转化体。 但其表达的产物会带来一些不良后果。 ① 筛选剂影响转化细胞的增殖及分化； ② 选择标记基因可能对健康和环境产生负面影响问题； ③ 应用相同的选择标记基因向植物叠加外源基因存在一定的 困难。
解决这一问题的根本途径就是剔除转基因植物中的选择标 记基因。
（1）无选择标记转基因植株的获得
共转化法（co-transformation） 同时使用两个独 立的 DNA 载体对植物进行转化，一个含有目的基因， 一个含有选择标记基因，可以获得共整合有目的基 因和选择标记基因的植株。当2个基因分别整合在受 体的不同染色体上时，转化植株后代经过有性阶段 的遗传重组，使选择标记基因与目的基因分离，即 可获得只含有目的基因而不带选择标记基因的转化 植株。 双T-DNAs系统（超级双元载体），即将分别带有 目的基因和选择标记基因的两个 T-DNA 装载在同一 个载体中进行转化，能较大地提高共转化频率。
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T－DNA
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Nomenclature for pCAMBIA Vectors
lacZ in presence (Promoter cloning vectors only)
Za pCAMBIA1381 X
Reading frame (a/b/c) for gene fusion
PEG
电 击 法
（2）愈伤组织受体系统
几乎适用于每一种通过离体培养途径再生植株的植物，转化 率较高 。缺点是获得的愈伤组织分化的不定芽嵌合体比例 高，再生植株无性系变异性较大。 优点 外源DNA易于导入细胞 可适用于多种转化方法，如电击法、PEG法、显微注射法和脂 质体法 通过继代培养获得大量的再生植株 缺点 愈伤组织培养的再生植株无性系变异大，遗传稳定性差 愈伤组织由多细胞组成，再生植株中嵌合体多，筛选难度大
整株感染法
用刀切或针刺幼嫩植株产生伤口
携带外源DNA的农杆菌菌液直接涂在伤 口上
生长3-6周，形成3-10mm的冠瘤
切去冠瘤，诱导愈伤组织的培养基上培 养2-3周
转移到选择培养基上培养一段时间，获 得转化组织
转移到含适当激素的培养基上诱导再生 植株
转化率低，为1.5%
表1 几种植物转基因方法比较
GUS 基因不具有正选择标记，而是产生荧光物质 4- 甲基伞 形酮，因而可以荧光光度计进行定量测定。 GUS 基因被广
泛使用于植物基因转化实验中。
例 Gus检测
原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催 化β－葡萄糖苷酯类物质水解。其中很多水解 产物具有发色团或形成荧光物质。 例：组织化学法测定Gus活性 作用底物为X-gluc,产物是一种不可溶的5,5二溴，4,4-二氯靛蓝；
标记基因
报告基因(Report gene)
β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus) 荧光素酶基因(Luc) 氯霉素乙酰转移酶基因(Cat) 绿色荧光蛋白基因(Gfp) ……
一、植物基因工程中常用的标记基因
选择标记基因是筛选和鉴定转化的细胞、组织和转基因植 株的有效方法，在有选择压力的情况下，从大量非转化克 隆中选择出转化细胞，从标记基因的表达了解目的基因的 表达情况。 标记基因须具备以下四个条件：
（3）种质受体系统
植物生殖细胞如花粉粒、卵细胞受体； 花粉管通道法、花粉粒浸泡法、子房注射法 优点 生殖细胞具有全能性，接受外源DNA能力强，易于获 得转基因植株 单倍体，外源DNA无显隐性区分，加倍后可获得纯合 二倍体 缺点 单倍体育种难度大 时间局限性大，如花期短
花粉管通道法（pollen-tube pathway） 花粉管通道法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直 接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早 期胚胎细胞,实现目的基因转化. 简单易行，但转化效率低，而且授粉后的时间要掌握好。 生殖细胞浸泡法(germ cell imbibition transformation) 将供试外植体（如种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗悬 浮细胞培养物等）直接浸泡在外源 DNA 溶液中，利用渗透作 用把外源基因导入受体细胞并稳定地整合、表达与遗传。 花浸法(flower infiltration) Beehtold等创立的简单、高效的拟南芥浸花转化法。将花组 织在含有 5 ％蔗糖和 0.05 ％表面活化剂的农杆菌菌液中浸一 下，可获得0.5％的转化种子。
根癌农杆菌
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）的Ti质粒（Tumor-inducing plasmid） 的改建与利用，从而开创了植物基因工程的新纪元。
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Байду номын сангаас
载体pBIn19的结构
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共 整 合
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植物转化的双元系统
目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即 穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti 质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整 合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主 复制并保留下来。