AdTERT-TRAIL对腺样囊性癌SACC-83靶向转基因作用的研究
TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡机制研究进展
TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡机制研究进展
杨燕;冯作化;张桂梅
【期刊名称】《国际肿瘤学杂志》
【年(卷),期】2004(031)002
【摘要】肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)与死亡受体结合后,可启动凋亡信号转导.在产生一系列凋亡分子的同时,胞内抗凋亡分子也被诱导产生,但单一因素在TRAIL凋亡信号调控网络中并不起决定作用,而是多因素制衡的一个动态过程决定细胞生死.了解TRAIL通路的精确调控机制及肿瘤的遗传背景,对于研究TRAIL在肿瘤治疗中的应用具有决定性作用.现综述近年来TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡胞内机制的研究进展.
【总页数】4页(P83-86)
【作者】杨燕;冯作化;张桂梅
【作者单位】430030,武汉,华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学
系;430030,武汉,华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系;430030,武汉,华中科技大学同济医学院生物化学与分子生物学系
【正文语种】中文
【中图分类】R329.25;R730.3
【相关文献】
1.肿瘤细胞TRAIL信号传递途径中抗凋亡机制的研究进展 [J], 于超;魏莲枝
2.TRAIL及其受体在肿瘤细胞凋亡机制中的作用研究进展 [J], 李强;潘晓华;蔡景龙
3.肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体及其诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展 [J], 方芳;王爱平
4.白藜芦醇诱导前列腺肿瘤细胞凋亡机制研究进展 [J], 许爱辉; 吴双; 苏玉环
5.TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究进展 [J], 高静;金天明
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非增殖型和靶向增殖型腺病毒携带TRAIL基因治疗肝癌的实验研究
ｅｏｉ ｓ ｄａｒｐ ｃｔ ｎｄｆ ｔ ｅａｅｏｉ ｓｅｐｅｓ ｎｈ ｍ ｎｓｌ ｌ Ｔ Ｉ（ Ｔ Ｉ）ｇｎ ｎｈ ｐｔ ｅ ｕ ｒ ａｃ ｏ ｅ ｎ ｎｖ ｕ ｅｌ ａｏ —ｅ ｃｖ ｄ ｎｖ ｕ ｘ ｒｓｉ ｕ ａ ｏ ｂｅ Ｒ Ｌ ｈ Ｒ Ｌ ｅｅｏ ｅａ ｃｌ ｌ ｒ ｉ ｍａｃｌｌ ｅ ｒ ａ ｎ ｉ ｉ ｅｉ ｒ ｏ ｕ Ａ Ａ ｏ ｌａ ｃ ｎ ｌｉ
体外沉默ICMT基因对人唾液腺腺样囊性癌细胞侵袭和迁移的影响
体外沉默ICMT基因对人唾液腺腺样囊性癌细胞侵袭和迁移的影响陆洲;宫文红;许晓;陈正岗【期刊名称】《口腔疾病防治》【年(卷),期】2023(31)6【摘要】目的探讨异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶(isoprene cysteine carboxymethyl transferase,ICMT)基因对唾液腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)细胞迁移和侵袭的影响及相关机制,为SACC的分子靶向治疗提供实验依据。
方法体外培养腺样囊性癌细胞SACC-LM和SACC-83,采用脂质体载体瞬时转染的方法,将ICMT siRNA转染至人SACC-LM和SACC-83细胞中(实验组),并分别设置空白对照组和阴性对照组(转染NC-siRNA)。
通过qRT-PCR检测转染后各组细胞中ICMT和RhoA的m RNA表达并明确沉默效率;Western blot检测各组的ICMT、膜RhoA、总RhoA、Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1(Rho associations contain curly helical binding protein kinase 1,ROCK1)、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达;通过CCK-8实验检测SACC细胞的增殖能力;通过比较细胞划痕实验的相对愈合面积和Transwell实验细胞穿膜数目,分别检测SACC细胞的迁移和侵袭能力。
结果 SACC-LM和SACC-83细胞转染ICMT-siRNA后,实验组相较于空白对照组和阴性对照组,ICMT mRNA和蛋白表达显著下降(P<0.05),但RhoA mRNA和RhoA总蛋白表达均无显著性差异(P>0.05);膜RhoA、ROCK1、MMP-2、MMP-9的蛋白表达显著下降(P<0.05),细胞增殖能力明显下降(P<0.05),迁移和侵袭能力明显降低(P<0.05)。
靶向性重组TRAIL基因诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡的效应
靶向性重组TRAIL基因诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡的效应朱春生;陈剑秋【期刊名称】《山东大学耳鼻喉眼学报》【年(卷),期】2008(22)5【摘要】目的研究TRAIL基因结合端粒酶启动子特异性靶向治疗的作用。
方法刺激人外周血淋巴细胞增殖,提取总DNA。
采用RT-PCR扩增含有IL-2信号肽和TRAIL功能区的融合基因,克隆入pGL3-181hTERT肿瘤特异性端粒酶启动子的下游,构建TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL。
将该重组载体经阳离子脂质体转染入人黑色素瘤细胞株A375中,以台盼蓝拒染法和电镜下细胞形态变化,观察转染的A375细胞的凋亡。
结果构建了肿瘤人可溶性TRAIL基因的重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL,其表达产物能诱导人黑色素瘤细胞株A375凋亡。
结论成功地构建了重组真核表达载体pGL3-181hTERT/TRAIL,为肿瘤的基因靶向治疗提供了可能性。
【总页数】4页(P408-411)【关键词】TRAIL;端粒酶启动子;凋亡;基因治疗【作者】朱春生;陈剑秋【作者单位】济南军区总医院耳鼻咽喉头颈外科【正文语种】中文【中图分类】R739.63【相关文献】1.三氧化二砷对恶性黑色素瘤A375细胞株凋亡的诱导作用 [J], 马佳;陈素莲;陈治文2.苦参碱对黑色素瘤A375细胞株的诱导凋亡作用 [J], 仇萌;邹先彪3.肿瘤特异性凋亡基因对人黑色素瘤细胞A375凋亡诱导作用 [J], 聂晶;赵洪礼;张伟建;宋承辉4.miR-34a-3p通过靶基因YAP1调控黑色素瘤A375细胞的增殖和凋亡 [J], 王桂冬;侯媛溪;王宁;楼伊名5.维A酸诱导人类恶性黑色素瘤细胞株A375凋亡的受体机制研究 [J], 牛新武;冯捷;彭振辉;马惠群;刘超;袁景奕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
腺病毒介导的TRAIL基因诱导腺样囊性癌细胞凋亡研究
Hale Waihona Puke 应 用流式 细胞仪检测肿 瘤细 胞 的凋亡率 。结 果 ：Ａ Ｃ Ｖ Ｅ Ｆ ｄ Ｍ － Ｇ Ｐ在 １００ ｐ ｃｌ时转 染效 率 为 １０ ； Ｔ ０ ／ ｅ ｌ ０％ Ｒ ．
表皮生长因子受体在涎腺腺样囊性癌不同细胞系中的表达
表皮生长因子受体在涎腺腺样囊性癌不同细胞系中的表达马杰;宗志红;王兆元【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》【年(卷),期】2005(014)004【摘要】目的通过检测在涎腺腺样囊性癌两个细胞系中受体型酪氨酸蛋白激酶EGFR的表达,探讨其与腺样囊性癌发生发展的关系.方法采用Western Blot技术并利用电泳凝胶成像分析软件对结果进行量化分析;采用SPSS11.5统计软件对结果进行统计学分析.结果在SACC-83和SACC-LM细胞中,前者胞膜中EGFR的表达明显高于后者,而胞浆中的表达却明显低于后者(均为P<0.01);在SACC-83细胞系中,EGFR在细胞膜中呈现高表达(P<0.01),而在SACC-LM细胞系, EGFR在胞浆中呈现高表达(P<0.01).结论 EGFR基因在胞浆中的高水平积累可能在侵袭癌的进展中发挥重要作用,对其深入研究,有望为腺样囊性癌治疗带来新的策略.【总页数】4页(P385-388)【作者】马杰;宗志红;王兆元【作者单位】中国医科大学第二临床学院口腔科,沈阳,110004;中国医科大学生化教研室,沈阳,110001;中国医科大学绍兴华宇医院病理科,绍兴,312000【正文语种】中文【中图分类】R781.7【相关文献】1.EpCAM和CD13在不同肝癌细胞系中的表达和乙型肝炎病毒X蛋白对其表达的影响 [J], 闫霞;江建新;黄早早;吴超;刘平;姚弘毅2.解聚素金属蛋白酶和表皮生长因子受体在涎腺腺样囊性癌中的表达及临床意义[J], 章建国;陆锦标;施公胜;张弘3.不同雌激素受体、人表皮生长因子受体-2表达的乳腺癌组织中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3情况 [J], 肖刚;王振威;戚辉4.表皮生长因子受体在不同民族三阴性乳腺癌患者中的表达差异分析 [J], 蒋威华;李涌涛;张杰;张明帅;王晓文;张晨光;伊丽娜;欧江华5.含不同启动子的GFP载体在不同种属的胚胎干细胞系中的表达效率 [J], 陈红;钱坤;张苏明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
hTERT启动TRAIL基因的腺病毒载体对人舌鳞癌细胞影响
hTERT启动TRAIL基因的腺病毒载体对人舌鳞癌细胞影响臧光祥;孙宏晨;穆亚冰;张泽兵;柯小亮;刘金钟;苏涛【期刊名称】《口腔医学研究》【年(卷),期】2007(23)5【摘要】目的:探讨以凋亡基因TRAIL为靶基因,腺病毒(Ad)为载体,人端粒酶(TERT)启动子引导的重组基因治疗药物AdTERT-TRAIL诱导人鳞状细胞癌细胞(TCa8113)凋亡的作用。
方法:含有绿色荧光蛋白基因(EGFP)的腺病毒载体(AdTERT-EGFP)转染TCa8113细胞,确定重组腺病毒载体转染效率;AdTERT-EGFP为对照组,AdTERT-TRAIL为实验组感染TCa8113细胞,采用RT-PCR方法检测TRAIL的表达。
应用倒置显微镜观察细胞形态,应用MTT检测细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。
结果:AdTERT-EGFP在1000p/cell时转染效率为100%。
RT-PCR可检测到594bp的TRAIL基因。
细胞转染AdTERT-TRAIL和AdTERT-EGFP后,随时间细胞存活率逐渐下降,但AdTERT-TRAIL组较AdTERT-EGFP组下降更快,统计学分析有显著意义(P<0.001)。
AdTERT-TRAIL和AdTERT-EGFP均能诱导TCa8113细胞凋亡,而AdTERT-TRAIL组引起细胞凋亡的程度明显比AdTERT-EGFP组大,统计学有显著差异(P<0.0001)。
结论:AdTERT-TRAIL在体外能明显抑制TCa8113细胞的活性,并能促进其凋亡。
【总页数】4页(P481-484)【关键词】鳞状细胞癌;腺病毒;凋亡基因;基因治疗【作者】臧光祥;孙宏晨;穆亚冰;张泽兵;柯小亮;刘金钟;苏涛【作者单位】吉林大学口腔医学院病理科;湖州师范学院医学院【正文语种】中文【中图分类】Q254【相关文献】1.hTERT启动子驱动TRAIL基因表达载体对结肠癌HT-29细胞的抑制作用研究[J], 周联明;张学利;单远洲;张吉发;朱光辉2.hTERT启动子调控的SEA-CD80基因共表达重组腺病毒载体的构建及在不同肿瘤细胞中的表达鉴定 [J], 司少艳;刘俊丽;王晓菲;谭小青;宋淑军3.腺病毒介导的TRAIL基因对舌鳞状细胞癌细胞株的影响 [J], 臧光祥;穆亚冰;孙宏晨;刘金钟;张泽兵;柯小亮;苗雷英4.hTERT启动子调控的TRAIL基因表达载体的构建及其对肝癌细胞增殖的抑制作用 [J], 李金华;刘扬;王宏芳;王志成;吴嘉慧;龚守良;李娟5.非病毒载体介导的基因转染效率及其对人舌鳞癌细胞生长增殖的影响 [J], 刘习强;黄洪章;曾融生;潘朝斌;张彬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
转化生长因子α及其受体在腺样囊性癌中的表达及相互关系
转化生长因子α及其受体在腺样囊性癌中的表达及相互关系谷建琦;张英怀;张杰英;蒋崇槟;杨威;贾志宇【期刊名称】《现代口腔医学杂志》【年(卷),期】2007(21)1【摘要】目的探讨转化生长因子α(TGF-α)和表皮生长因子受体(EGFR)在涎腺腺样囊性癌(SACC)中的表达及其相互关系.方法应用免疫组化二步法检测41例腺样囊性癌组织和18例正常涎腺组织中TGF-α和EGFR的表达情况.结果腺样囊性癌组织TGF-α和EGFR的阳性率(51.2%,46.3%)高于正常延腺组织(22.2%,16.7%),P ＜0.05,有显著差异,且二者呈明显相关性.结论 TGF-α和EGFR在腺样囊性癌的发生发展中可能发挥重要的作用,二者有协同性.【总页数】3页(P60-62)【作者】谷建琦;张英怀;张杰英;蒋崇槟;杨威;贾志宇【作者单位】河北省人民医院口腔科;050051,石家庄,河北医科大学第二医院口腔科;050051,石家庄,河北医科大学第二医院口腔科;050051,石家庄,河北医科大学第二医院口腔科;050051,石家庄,河北医科大学第二医院口腔科;050051,石家庄,河北医科大学第二医院口腔科【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.趋化因子受体5在唾液腺腺样囊性癌中的表达及意义 [J], 申志远;孙沫逸;张静;杨向明;刘利军;李建虎;梁亮;杨永勤2.转化生长因子β1、丝裂原活化蛋白激酶在唾液腺腺样囊性癌中的表达及临床意义 [J], 谢宏亮;张彬;徐志英;梁启祥3.表皮生长因子受体与雌、孕激素受体在乳腺癌组织中的表达及相互关系 [J], 丁秀敏4.解聚素金属蛋白酶和表皮生长因子受体在涎腺腺样囊性癌中的表达及临床意义[J], 章建国;陆锦标;施公胜;张弘5.神经生长因子受体在涎腺腺样囊性癌中的表达及临床意义 [J], 金善恩;赏金标;王可敬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
pACTERT-TRAIL对涎腺腺样囊性癌SACC-83
pACTERT-TRAIL对涎腺腺样囊性癌SACC-83增殖与调亡的影响1苏涛12，孙宏晨12，苗雷英12，臧光祥121吉林大学口腔医学院（130041）2口腔生物医学工程吉林省重点实验室（130041）E-mail：hcsun@摘要：目的：研究真核表达质粒载体pACCMV-TRAIL 和pACTERT-TRAIL对体外涎腺腺样囊性癌的增殖与调亡的影响。
方法：以pACCMV-TRAIL和pACTERT-TRAIL分别转染SACC-83细胞和HEL细胞，采用RT-PCR和MTT方法及流式细胞仪检测TRAIL基因的mRNA表达、增殖能力和调亡水平。
结果：hTERT启动子可以调控TRAIL基因仅在端粒酶阳性的SACC-83细胞中特异表达，并抑制肿瘤细胞的增殖和诱导凋亡。
而CMV启动子由于缺乏靶向性，使得外源TRAIL基因对SACC-83细胞和HEL细胞均产生细胞杀伤作用。
结论：hTERT启动子体外可以诱导TRAIL基因靶向性调控涎腺腺样囊性癌的增殖与凋亡。
实验结果证明了方法的有效性。
关键词：hTERT 腺样囊性癌涎腺肿瘤基因治疗1．引言转基因治疗是将基因直接导入人体并在靶细胞中表达用于治疗和预防疾病的技术，但基因治疗存在最突出的问题是非特异性问题，即基因传递系统非特异地影响正常细胞，引起一定的毒副作用。
这种不加选择的转染限制了基因对于恶性肿瘤的治疗，因此寻找无毒副作用而且又具有靶向性的载体是基因治疗研究中的新目标。
端粒酶是一种核糖核蛋白酶，能够将端粒重复序列添加到染色体末端，它由自身的RNA模板及数个相关蛋白构成，其中最主要的是其催化亚单位人端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT），研究表明，涎腺腺样囊性癌高表达端粒酶，但在大多数正常体细胞中无活性，因此推测以端粒酶为靶点可能用于涎腺腺样囊性癌的治疗。
为此，我们利用含hTERT启动子的质粒载体，通过转染涎腺腺样囊性癌SACC-83细胞和人红白血病细胞株HEL细胞，观察促凋亡基因TRAIL基因表达及对细胞增殖与凋亡能力的影响，为临床开展高效、定向和无创的涎腺肿瘤基因治疗提供依据。
TRAIL真核表达治疗肝细胞癌作用的研究
TRAIL真核表达治疗肝细胞癌作用的研究薛胜利;冯作化;张桂梅;张慧;黎培员;李东【期刊名称】《中国肿瘤生物治疗杂志》【年(卷),期】2002(9)3【摘要】目的 :构建鼠源TRAIL(mTRAIL)真核表达质粒。
研究其体内、外表达对肝癌细胞的诱导凋亡作用 ,抑制肝癌生长作用及与重组人FN多肽真核表达质粒pCH5 10协同抑制肝癌生长作用。
方法 :采用RT PCR及重组DNA技术构建mTRAIL真核表达质粒 ;体内、外进行基因转染 ;用流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡率 ,用TdT mediateddUTPnickendlabeling (TUNEL)法及免疫组织化学技术检测肝癌细胞凋亡 ;小鼠实体瘤块模型研究基因转染抑制肝癌生长作用。
结果 :用RT PCR方法自小鼠脾细胞RNA扩增出TRAIL基因的全长cDNA ,并克隆至真核表达载体pcDNA3 .1中获重组质粒pX1;以pX1转染BHK细胞株后攻击肝癌细胞株H2 2细胞 ,可检测到肝癌细胞凋亡 ;肌肉内注射转染质粒DNApX1,通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肝癌生长 ;pX1与FN多肽真核表达质粒pCH5 10有协同抑制肝癌生长作用。
结论 :质粒pX1可在细胞及小鼠体内表达 ;体内、外表达可诱导肝癌细胞凋亡并可通过该机制抑制肝癌生长 ;与FN多肽真核表达质粒pCH5【总页数】5页(P158-162)【关键词】真核表达;TRAIL;重组FN多肽;肝癌;基因治疗;质粒【作者】薛胜利;冯作化;张桂梅;张慧;黎培员;李东【作者单位】华中科技大学同济医学院医学分子生物学研究室【正文语种】中文【中图分类】R735.7【相关文献】1.TRAIL真核表达质粒诱导胶质瘤细胞凋亡的实验研究 [J], 朱战鹏;罗毅男;张鹏;张兆志2.镇痛抗肿瘤肽基因真核表达载体构建及其体外抗肝细胞癌作用 [J], 金思思;吴金明;黄智铭;吴建胜;申苏建3.人TRAIL cDNA的真核表达和体外肿瘤细胞的凋亡诱导作用 [J], 史须;黄家强;张颖妹;宋泉声;马大龙4.阿霉素协同TRAIL真核表达载体诱导前列腺癌细胞凋亡的研究 [J], 陈朝晖;王华芳;费世宏;肖亚军;曾甫清5.含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用 [J], 郭虹;陈观今;郑焕钦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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AdTERT-TRAIL对腺样囊性癌SACC-83靶向转基因作用的研究1苏涛，孙宏晨，臧光祥，苗雷英吉林大学口腔医学院 口腔生物医学工程吉林省重点实验室（130041）E-mail：hcsun@摘要：目的：观察腺病毒载体AdCMV-TRAIL和pACTERT-TRAIL对腺样囊性癌细胞SACC-83增殖能力与凋亡的影响。
方法：采用磷酸钙沉淀法将pACCMV-TRAIL和pACTERT-TRAIL与pJM17共转染293细胞，得到重组腺病毒AdCMV-TRAIL和AdTERT-TRAIL。
以AdCMV-EGFP、AdTERT-EGFP、AdCMV-TRAIL和AdTERT-TRAIL转染SACC-83细胞和和人胚肺HEL，经RT-PCR、MTT技术和流式细胞仪检测转染细胞TRAIL 基因的mRNA表达、增殖能力以及凋亡水平。
结果：CMV启动子在SACC-83和HEL细胞均可以启动TRAIL基因，从而导致这两种细胞凋亡；hTERT启动子在端粒酶阳性的SACC-83细胞能使TRAIL基因高表达，而在HEL细胞中呈低表达。
结论：成功构建了AdCMV-TRAIL 和AdTERT-TRAIL两种腺病毒载体； hTERT介导的腺病毒载体可以诱导TRAIL基因在SACC-83中高效、特异性表达，并引起此细胞大量凋亡。
关键词：hTERT TRAIL 基因腺病毒载体转基因腺样囊性癌1．引言在肿瘤基因治疗中，目的基因的能否特异表达及表达量的多少是决定基因治疗效果的重要因素之一，我们的研究已初步证实腺样囊性癌细胞中表达端粒酶[1]，而正常涎腺上皮细胞不表达，因此以端粒酶为靶点、治疗腺样囊性癌具有较好的靶向性，但是质粒载体的转染效率比较低[2]，仅为30％－40％，诱导凋亡细胞的百分比不高。
有证据表明[3]，hTERT 在静止期或G0期干细胞中可能不发挥作用，并且干细胞通常处于静止期。
骨髓细胞中原始干细胞及其分化成熟的细胞具有较低的端粒酶活性，而其前体细胞则有较高的端粒酶活性，提示hTERT启动子如果对干细胞有毒性作用也是短暂的，而且干细胞对腺病毒的感染具有耐受性，即使使用高浓度的腺病毒载体，并延长细胞－载体的作用时间，也只有少量的干细胞被感染。
因此，如果把hTERT启动子和转染干细胞效率低的腺病毒载体一起使用的话，由hTERT启动子介导的促凋亡基因在干细胞中表达产生的毒性将是很小的。
为此，我们构建了含有hTERT启动子的腺病毒载体，以此介导TRAIL基因的表达，旨在提高载体的对细胞的转染效率和诱导凋亡的能力。
2．材料与方法2．1主要试剂293细胞（Clontech公司），含TRAIL基因的穿梭质粒pACCMV-TRAIL和pACTERT-TRAIL、腺病毒质粒pJM17、AdCMV-EGFP和AdTERT-EGFP（美国NIH郑长玉博士馈赠）。
2．2实验方法1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20030183068）资助- 1 -2．2．1重组腺病毒载体的构建分别将pACCMV-TRAIL和pACTERT-TRAIL与pJM17采用磷酸钙沉淀法共转染293细胞，约7－10d左右，可以看到边界清楚的噬斑，挑取噬斑，得到重组腺病毒AdCMV-TRAIL和AdTERT-TRAIL。
-70℃/+37℃反复冻融3次以裂解细胞，离心后收集含病毒的上清，部分上清用于鉴定重组腺病毒基因组DNA，其余上清重新感染293细胞大量扩增病毒，重复扩增3次，用氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒载体，再经Pierce Slide-A-Lyzer透析盒进行透析，除菌后分装，-70℃保存备用。
2．2．2转染滴度（multiplicity of infection, MOI）测定取生长良好的SACC-83细胞，0.25%胰酶消化，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种至12孔板中，接种细胞密度为5×104个/孔。
从－70℃冰箱中取出AdCMV-EGFP、AdTERT-EGFP 腺病毒，分别按照MOI值为10 particles/cell、100 particles/cell、1000 particles/cell、2000 particles/cell、5000 particles/cell和10000 particles/cell进行转染，每种病毒各转染6个孔，每孔为一个MOI值，另有1个孔不转染病毒作为对照。
然后将细胞放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。
次日在荧光显微镜下观察转染情况，通过计算机分析系统统计每个MOI值的转染效率，以转染率达到80％以上的MOI值作为转染时腺病毒的转染滴度，即所使用的腺病毒用量。
2．2．3MTT法分析细胞活力SACC-83细胞和HEL细胞设4组，分别为转染腺病毒AdCMV-TRAIL、AdTERT-TRAIL、AdCMV-EGFP组和未转染腺病毒的空白对照组。
取生长良好的SACC-83细胞和HEL细胞，调整细胞浓度至2.5×104个/ml，在96孔细胞培养板中各加入0.2ml含上述细胞的DMEM培养液，每孔细胞数为5×103个，每个组设3个孔，按照确定好的MOI值加入腺病毒进行转染，第1、3、5和7d进行MTT检测。
2．2．4流式细胞仪测定细胞凋亡细胞分组同上，于96孔板内接种细胞，密度为1×106个/孔，然后加入腺病毒转染，于第3d收集细胞，固定在70％的冷乙醇中过夜。
上机检测前离心，PBS洗涤3次后经过0.1％的Triton X-100和5μg/ml RNase A处理后，用50μg/ml的碘化丙啶（PI）4℃染色，PI 的发射波长为675nm，测定细胞凋亡百分比。
2．2．5RT-PCR检测TRAIL 基因mRNA表达取生长良好的SACC-83细胞和HEL细胞，分别将未转染腺病毒组、转染AdCMV-TRAIL组和AdTERT-TRAIL组置于6孔细胞培养板，按每孔细胞数为5×104个进行转染。
72h后，收集未转染组、转染AdCMV-TRAIL和AdTERT-TRAIL组的SACC-83细胞和HEL细胞。
参照mRNA提取试剂盒说明，提取细胞总RNA，反转录合成cDNA，以β-actin为对照，利用逆转录得到的cDNA为模板，根据设计的TRAIL引物进行PCR扩增：95℃ 变性50s，64℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃温育10min。
1%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物。
2．2．6统计学分析使用SPSS统计软件，采用χ2检验进行各组间差异分析。
- 2 -3．结果3．1重组腺病毒载体的鉴定以腺病毒DNA 区及TRAIL 区双引物将蚀斑提取物进行PCR 扩增，获得两条分别为312bp 及594bp 的特异性片断。
获得的重组腺病毒再感染293细胞后，48h 出现明显的细胞病变（CPE），表现为。
用分光光度仪测得扩增纯化后的腺病毒的滴度分别为：AdCMV-TRAIL7.8×1012 viral particles/ml，AdTERT-TRAIL 1.4×1012 viral particles/ml。
3．2MOI 值的确定腺病毒转染4-5h 后，荧光显微镜观察可见EGFP 表达后发出绿色荧光的细胞（图1，2），转染72h 后荧光强度达到最大，此后逐渐减弱，至1w 时仍可见发绿色荧光的细胞，未转染腺病毒组细胞未见荧光着色。
每个孔取3个不同的视野分别在普通光和紫外光下照相，然后在计算机上分析转染效率，MOI 值为2000 particles/cell 时转染效率最高，达到了85％。
图1. AdCMV-EGFP转染72h，转染效率达85％(MOI 2000 particles/cell) ×400图2. AdTERT-EGFP转染72h，转染效率达85％(MOI 2000 particles/cell) ×400 3．3腺病毒载体转染对SACC-83和HEL细胞形态的影响SACC-83细胞转染AdCMV-TRAIL和AdTERT-TRAIL后，于1－3d开始出现细胞皱缩、变圆，突起减少，呈浮起状等凋亡的形态学改变。
HEL细胞只在转染AdCMV-TRAIL后出现类似凋亡的形态改变，转染AdTERT-TRAIL后没出现明显的形态学改变（图3、4、5）。
- 3 -图3. SACC-83细胞转染AdCMV-TRAIL前后形态变化（×40）图4. SACC-83细胞转染AdTERT-TRAIL前后形态变化（×40）（×100） （×40）图5. HEL细胞转染AdCMV-TRAIL前后形态变化3．4腺病毒介导的TRAIL基因对SACC-83细胞和HEL细胞增殖的影响 SACC-83细胞和HEL细胞转染AdCMV-EGFP腺病毒7天后，细胞存活率为92.40％，HEL细胞组为90.70％，差别不大。
转染腺病毒AdCMV-TRAIL后，对肿瘤细胞和HEL细胞均产生了较明显的细胞杀伤效应， HEL细胞存活率为55.70%，SACC-83细胞的存活率为50.20%，二者相当。
与AdCMV-EGFP组相比差异显著（P＜0.05）。
而转染腺病毒AdTERT-TRAIL后，端粒酶阳性的SACC-83细胞增殖受到明显抑制，7d时细胞存活率最低为49.70%。
与AdCMV-EGFP组差异显著（P ＜0.05），端粒酶阴性的HEL细胞存活率下降不明显（84.30%），与AdCMV-TRAIL组差异显著（P＜0.05）(表1)。
- 4 -表1. 转染7d后MTT法检测细胞相对活性group SACC-83 HEL Blank control 100% 100%AdCMV-EGFP 92.40% 90.70%AdCMV-TRAIL 50.20%a 55.70%aAdTERT-TRAIL 49.70%a b 84.30%c da P＜0.05，vs AdCMV-EGFP group；b P＞0.05，vs AdCMV-TRAIL groupc P＞0.05，vs AdCMV-EGFP group；d P＜0.05，vs AdCMV-TRAIL group3．5流式细胞仪检测细胞凋亡以AdCMV-TRAIL和AdTERT-TRAIL腺病毒转染SACC-83细胞，第3d诱导细胞凋亡的比例相似，分别为32.98％和30.49％，差异不显著（P＞0.05），但都明显高于AdCMV-EGFP阴性对照组(2.49%)和未转染腺病毒的空白对照组（2.91％），差异显著（P＜0.05）；但在HEL细胞中，用AdCMV-TRAIL转染引起明显的细胞凋亡（34.98％），与AdTERT-TRAIL组（3.37％）、阴性对照组（2.59％）和空白对照组（2.87％）之间差异均有显著性（P＜0.05）（表2，图6、7）。