支原体染色液(Dienes染色液)
支原体污染及其检测
支原体污染及其检测支原体污染在细胞培养中最为常见，培养体系中支原体污染的最可能途径是经已被支原体污染的细胞蔓延和传扬，据报道目前约有11％的二倍体细胞和传代细胞存在支原体污染；支原体污染的另一重要来源是培养液中加入了被支原体污染的血清。
支原体是一种介于细菌和病毒之间的能自立生活的微生物，它无细胞壁，形态呈多形性。
最小的支原体直径约200nm，可通过滤菌器。
支原体污染后培养基普通不发生混浊，细胞形态无显然变幻，但事实上细胞已受到各方面的潜在影响，如影响DNA合成，代谢减慢，生长被抑制等。
这种污染造成的危害较大，但支原体污染不易被发觉，因此对支原体的污染必需引起足够的重视，应严加防范。
支原体污染常用的检查办法如下。
1．形态学检查常用相差显微镜检测取洁净载玻片，滴加少许待检的细胞悬液，压上盖片，用相差显微镜油镜观看。
如有支原体污染，镜下可见暗色极小颗粒，类似布朗运动，可位于细胞表面或细胞之间。
要注重支原体与细胞破裂后溢出的内容物如线粒体等相区分。
电镜检测：用普通染色办法难以确定时，可用电镜检查。
详见电子显微镜技术一节。
2．支原体染色镜检支原体经低张处理后用地衣红染色观看，本法简便易行，不仅适用于检测支原体，亦可用于检查真菌和细菌。
【材料】 (1)待检疑有支原体污染的培养物； (2）检测用试剂：低张处理液（0.45%），Carnoy固定液（配方：60ml纯加30ml和10m1）,2％的地衣红染液（配方：2g地衣红，60ml加蒸馏水至100m1 )。
【办法】 (1)取材：吸取待检培养液1 ml, 500～800r/min，离心5分钟后去上清液，余留0.2m1备用。
(2）低张处理：用新奇配制的0.45％溶液0.2m1，加入上述待检标本中，静止低张处理10分钟，然后离心去上清液，留取沉淀物0. 2m1，涂片2～3张，晾干。
(3）固定：用新配制的Carnoy液固定2次，共10分钟。
(4）染色：将晾干的涂片用2％的地衣红染5分钟。
支原体污染的检测方法
本产品仅供科学研究使用！请勿用于临床、诊断、食品、化妆品检测等用途！
细胞被支原体污染后，不论从外观上有无变化，均会严重的影响各种实验的结果。被支 原体感染的细胞其正常的生长和代谢会受到影响。部分细胞虽然表面变化不十分明显，实际 上潜伏着多方面的危险。而细胞重组表达的蛋白质，其活性也会受到影响，甚至完全失去活 性。支原体可以通过消耗培养基中的精氨酸，抑制细胞 DNA、RNA 的合成，降低细胞的抵抗 力。支原体感染会对细胞造成的影响是多方面的：包括代谢、免疫或生化特性、生长状况、 酶的作用途径、细胞膜的组成、染色体结构、转染效率、以及细胞存活等多方面的改变。因 此，支原体污染会对培养细胞的分子水平研究带来偏差或假阳性的实验结果。
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产品说明书
菌群）、培养基的污染、污染支原体的细胞造成的交叉污染、实验器材带来的污染和用来制 备细胞的原始组织或器官的污染。支原体污染细胞后，特别是重要的细胞株，有必要清除支 原体。
贝博支原体检测试剂盒为预防或清除细胞培养过程中支原体污染而精心研发的一个高 效的支原体检测产品。该产品能快速检测细胞是否有支原体污染。本产品可以为科研、生产 中的细胞培养工作提供有力的安全保障，防止和解决细胞污染带来的各种成本浪费。
支原体
支原体的性状特点以及标本的采集2010-05-14 00:00 来源：点击次数：318 关键词：支原体2010求购有奖：“赠送丁香园十周年纪念笔记本”分享到：∙收藏夹∙腾讯微博∙新浪微博∙开心网支原体（mycoplasma）：又称霉形体，为目前发现的最小的最简单的原核生物。
支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体（支原体是原核细胞，原核细胞的细胞器只有核糖体）。
支原体是在1898年发现的，是一种简单的原核生物。
其大小介于细菌和病毒之间。
支原体结构也比较简单，多数成球形，没有细胞壁，只有三层结构的细胞膜，故具有较大的可变性。
支原体可以在特殊的培养基上接种生长，用此法配合临床进行诊断。
一、性状形态与结构支原体的大小为0.2～0.3um,可通过滤菌器，常给细胞培养工作带来污染的麻烦。
无细胞壁，不能维持固定的形态而呈现多形性。
革兰氏染色不易着色，故常用Giemsa染色法将其染成淡紫色。
细胞膜中胆固醇含量较多，约占36%，对保持细胞膜的完整性具有一定作用。
凡能作用于胆固醇的物质（如二性霉素B、皂素等）均可引起支原体膜的破坏而使支原体死亡。
支原体结构支原体基因组为一环状以双链DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的五分之一），合成与代谢很有限。
肺炎支原体的一端有一种特殊的末端结构（terminal structure），能使支原体粘附于呼吸道粘膜上皮细胞表面，与致病性有关。
培养特性营养要求比一般细菌高，除基础营养物质外还需加入10～20%人或动物血清以提供支原体所需的胆固醇。
最适pH7.8～8.0之间，低于7.0则死亡，但解脲脲原体最适pH6.0～6.5。
大多数兼性厌氧，有些菌株在初分离时加入5%CO2生长更好。
生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育2～3天出现典型的“荷包蛋样”菌落：圆形（直径10～16um），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区。
此外，支原体还能在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长。
产品推荐：支原体检测与清除
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支原体染色检测试剂盒
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支原体清除试剂(Mycoplasma Removal Agent)是一种用于抑制和清除在培养细胞中广泛存在的支原体污染的试剂。一方面可以用于消除细胞中已有的支原体污染，也可以用于防止支原体污染。
Absin支原体清除试剂是一种筛选获得的天然抗生素，抑制或清除支原体时的浓度比较低，对细胞没有毒性。和细胞培养时所常用的青霉素和链霉素一样，其对细胞的各种检测没有干扰。可以有效抑制并清除多种支原体，包括 Mycoplasma orale, M. arginini, M. hyorhinis和Acholeplasma laidlawii等。
支原体鼠单抗
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培养细胞中的细菌污染、酵母污染或霉菌污染都在光学显微镜下可见，而支原体污染在光学显微镜下不可见，必须通过特定的检测方法进行检测。
检测支原体污染的方法有很多种，包括支原体分离培养、支原体特异酶检测、RT-PCR检测以及DNA荧光染色检测等。
爱必信的支原体染色检测试剂盒是通过Hoechst染色来检测支原体，可快速、有效、高灵敏度地检测支原体污染。
一起肉仔鸡支原体和大肠杆菌混合感染的诊治
2017 年第 6 期（下半月）农民致富之友 Nong Min Zhi Fu Zhi You260科研◎畜牧兽医一起肉仔鸡支原体和大肠杆菌混合感染的诊治苑立光引言现如今的养殖业中大肠杆菌和支原体混合感染是最常见不过的疾病了，基本上养的每一批鸡都会出现，给养殖户造成很大的损失，本文就支原体和大肠杆菌混合感染的发病、临床症状、剖检变化、实验室诊断、药敏试验诊断治疗等情况进行了阐述，并就治疗过程发表了自己的看法，希望能为广大兽医工作者提供参考。
1 发病情况2016年5月 某养鸡户饲养7000只肉仔鸡发病。
据畜主讲，6日龄时个别鸡出现甩鼻、咳嗽、张嘴呼吸，拉白色、绿色或黄色稀粪，2天后，症状加重，眼睑肿胀、呼吸困难且有啰音出现零星死亡。
2 临床症状临床可见病鸡精神沉郁，羽毛松乱、肮脏，采食减少，饮水增加;离群呆立或相互挤在一堆，行走摇摆、翅下垂体温升高到43度以上。
眼睑肿胀、流眼泪、流鼻液、咳嗽、甩头、呼吸困难、有啰音，严重的眼睛和鼻孔里有黄色的干酪样物质、甚至失明。
病鸡拉绿色、白色或黄色稀粪，肛门周围羽毛被粪便污染。
3 剖检变化共剖检病鸡、死鸡83只，可见鼻腔内有分泌物，鼻窦肿胀有黏性和脓性渗出物，喉头和气管内有清亮的黏液，个别支气管分叉处发生栓塞，胸腹气囊浑浊、气囊壁增厚，气囊间有泡沫样黏稠液体和黄色干酪样物，肺淤血，严重的可见纤维素性或化脓性心包膜炎。
心外膜、心内膜有明显的小出血点。
肝不同程度肿胀质脆，肝包膜呈白色浑浊并增厚，附有纤维素性干酪物，腹水增多（多的达120ml ）有腹膜炎。
肠尤其是十二指肠水肿，黏膜出血或充血。
其他实质器官有充血、淤血、实质性变。
4 实验室诊断4.1 染色镜检采集有明显病变的气囊、肺及肺的干酪样物质进行革兰氏染色镜检，通过显微镜油镜观察，可发现阴性无芽胞的红色或粉红色的杆状细菌。
用姬姆萨染色可见端稍圆的细长杆菌，散在分布。
4.2 分离培养采取肺组织接种培养基，分离到两种菌落，一种为隆起、圆形、光滑、半透明菌落，直径在1-3mm ，另一种菌落很小直径在0.1-0.2mm 之间，中间致密、隆起、细小、平滑。
实验室常用染色液配方
实验室常用染色液配方1. Giemsa染色液配方：- Giemsa染色液用于染色细胞核和染色体，常用于血液细胞计数、病原体观察等实验。
- 配方：Giemsa染色液的配方一般会根据不同的实验需求进行调整，但基本原料一般包括甲基蓝、伊苏琉斯蓝G、亚甲基蓝、酒精、非紫外吸收的甘油、磷酸盐缓冲液等。
2.范式染色液配方：-范式染色液常用于细胞和组织的常规染色，如荧光染色、光学显微镜下的染色观察等。
-配方：范式染色液的主要成分包括染料、溶剂、pH缓冲溶液、增稠剂等。
常用的染料有荧光素、伊红、伊博蓝等；常用的溶剂有酒精、乙醚、显微镜油等；常用的增稠剂有明胶粉、琼脂等。
3.原位杂交染色液配方：-原位杂交染色液主要用于检测细胞和组织中的特定核酸序列，常用于分子生物学研究、基因定位等实验。
- 配方：原位杂交染色液的配方会根据实验的具体目的进行调整，但一般包括核酸探针、碱性缓冲液、蛋白酶K、DNase I等。
4.细胞活力染色液配方：-细胞活力染色液用于评估细胞的活力和生理状态，常用于细胞培养实验、细胞毒性测试等。
- 配方：细胞活力染色液的配方一般包括活细胞染料、死细胞染料、背景抑制剂等。
常用的活细胞染料有乙酰红、卤化丙啶（Propidium Iodide，PI）等；常用的死细胞染料有丙酮溴化物（7-AAD）、EthD-1等；常用的背景抑制剂有苯甲缩醛（Sodium Azide，NaN3）等。
以上是实验室常用染色液的一些基本配方和介绍，实验者在进行实验前需要根据具体实验目的和需求进行配方选择和调整。
同时，注意染色液的稳定性、pH值的控制、操作的规范等因素也是成功进行染色实验的关键。
浅谈奶牛支原体感染引起乳房炎
浅谈奶牛支原体感染引起乳房炎黄运新【期刊名称】《山东畜牧兽医》【年(卷),期】2016(037)001【总页数】2页(P61-62)【作者】黄运新【作者单位】广东省博罗县泰美畜牧兽医站 516166【正文语种】中文【中图分类】S858.23牛支原体(Mycoplasma bovis)作为感染牛的一种重要的致病性支原体，可以引起包括肺炎、乳腺炎、关节炎、生殖道损伤以及结膜炎等在内的多种疾病，同时还可与其他病原协同，造成继发感染。
本文希望通过对牛支原体感染有一个充分的认识，为生产中疾病的预防打下基础，为进一步的科研工作提供一定的依据。
乳房炎是成年奶牛最普遍的疾病。
依其表现形式可分为临床型乳房炎和亚临床型乳房炎。
临床型乳房炎主要表现为乳腺肿胀、坚硬，乳汁出现凝块、变色等。
而亚临床则引起乳产量下降、乳成分发生变化并排泄病原体，亚临床阶段可持续存在或快速发展为临床型乳房炎。
奶牛乳房炎已成为制约奶牛养殖业发展的最重要的疾病之一，不仅影响产奶量，降低牛奶的品质，还易延长产后发情和妊娠时间，甚至使病牛失去生产性能，造成严重的经济损失，而且危害人类健康，因而其防治问题已日益为人们所关注。
据报道，全球约有2.2亿头奶牛，其中1/3的奶牛患有各类型乳房炎；国内关于乳房炎发病率的报道均在46%～70%之间；在丹麦，平均每头奶牛每年的损失估计超过200美元；仅美国每年因乳房炎造成的损失就达20亿美元，德国为4.5亿马克；其中70%的损失是来自隐性乳房炎引起的产奶量下降，中国每年此项损失为1.35亿元人民币[ 1-3]。
牛支原体(Mycoplasma bovis)于1961年首次在美国患有乳房炎的病牛中分离到[4]，并在1976年被确定为牛呼吸系统疾病的病因之一[5]，随后，M.bovis被认为是育肥牛和奶牛的一种重要病原。
支原体性乳房炎是奶牛最常见多发的乳房炎之一，给奶牛业造成了巨大的损失。
支原体广泛存在于自然界，易产生抗药性，常引起乳房、皮肤和软组织的化脓性炎症，甚至引起菌血症、败血症和各内脏器官的严重感染。
检验项目支原体检测方法汇总
检验项目支原体检测方法汇总如何选择正确的方法进行细胞的支原体检测？支原体的检测方法有哪些？目前实验室常用的支原体检测方法有培养法、荧光指示细胞法、PCR 法、扫描电子显微镜法，这些方法各有优缺点。
各实验室可根据具体情况，选择不同的方法，或几种方法联合使用。
一、培养法培养法为最为经济可靠的方法，但其实验周期较长，所以常用来进行对怀疑细胞的最后甄别。
常用于细胞及临床治疗细胞的支原体检查。
（一）材料与设备1. 精氨酸肉汤培养基按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20％胎牛血清）。
2. 支原体琼脂培养基按说明称量粉剂，蒸馏水配制，高压除菌（加20％胎牛血清）。
3. 其他超净工作台、无菌吸管、试管架、培养试管／皿、37°C 培养箱。
（二）操作步骤1. 样品的储存。
样品取材后，最好尽快进行检测。
样品如在24h 以内进行支原体检测，可储存在2~8℃; 如果超过24h 样品应放置于－20℃ 以下保存。
-20℃保存的样品，进行检测时需重新加入到对照培养细胞中，培养72h 后，取上清直接进行接种检测。
2. 准备精氨酸肉汤培养基、支原体琼脂培养基（半流体）。
3. 将样品分别接种到10ml 精氨酸肉汤培养基、半流体培养基中（已冷却至36℃），每支培养基接种样品0.5~ 1.0ml. 每种样品接种6 支精氨酸肉汤培养基，3 支半流体培养基。
4. 接种6d 后，取3 支精氨酸肉汤培养基中样品0.5 ~ 1.0ml. 复种于精氨酸肉汤培养基中。
5. 36 ℃ 培养29d, 每隔3d 观察一次。
记录实验结果。
（三）结果判断培养结束时，精氨酸肉汤培养基如有支原体生长，则液体颜色改变（粉色或黄色) 。
半流体培养基中如有支原体生长，则出现絮状沉淀二、荧光指示细胞法荧光指示细胞法较为快捷，方法简单，但其灵敏度有一定的欠缺，易造成漏检。
常见的支原体检测方法中最简单、最经济的方法是荧光指示细胞法。
该方法使用的荧光染料是烟酸己可碱，其激发波长为350nm（紫外激发），发射波长为420nm。
支原体常用的染色方法
支原体常用的染色方法Chlamydia is a common bacterial infection that can be transmitted through sexual contact, causing a range of health issues if left untreated. In order to diagnose chlamydia, healthcare providers often utilize various staining methods to visualize the bacteria under a microscope. Commonly used staining methods for chlamydia include the Giemsa stain, immunofluorescence staining, and nucleic acid amplification tests.支原体是一种常见的细菌感染，可通过性接触传播，如果不及时治疗可能会引起一系列健康问题。
为了诊断支原体，卫生保健提供者通常使用各种染色方法，在显微镜下观察细菌。
支原体常用的染色方法包括姬姆萨染色、免疫荧光染色和核酸扩增测试。
The Giemsa stain is a commonly used staining method for diagnosing chlamydia due to its ability to stain both the chlamydia bacteria and host cells. This stain works by binding to the nucleic acids in the bacteria, making them visible under a microscope. The Giemsa stain can provide healthcare providers with a quick andaccurate diagnosis of chlamydia, allowing for prompt treatment and preventing further complications.由于姬姆萨染色能够染色支原体细菌和宿主细胞，因此它是诊断支原体常用的染色方法。
临床对解脲支原体(uu)的检测方法
临床对解脲支原体（uu）的检测方法(一)分离培养方法Uu在含95% 氮气和5%CO2 环境中生长良好。
其生长最适pH为5.5-6.5,最适温度为36℃-37℃。
Uu具有尿素酶，能分解尿素产氨，使含酚红指示剂的Uu液体培养基pH值上升，颜色由黄色变为红色。
再将液体培养物转种到Uu固体培养基上，能生长成具特征性油煎蛋样集落。
(1 )液体培养基：支原体肉汤培养基80mL，马血清或小牛血清10mL，酵母浸液10mL,10 %尿素溶液0.5mL-1.5mL, 0.4%酚红溶液0.5mL,青霉素(使其在培养基中的浓度为500U/mL-2000U/mL,)用1N HCl 调pH值至5.5-6.5, 用小试管分装后置冰箱中备用，每管1.5-2.0mL。
(2 ) 固体培养基：在100mL 支原体肉汤培养基中，加入琼脂1.2-1.4g, ,高压灭菌后冷却到50 ℃左右，逐一加入上述添加剂。
摇匀，倒入无菌平皿中，待凝固后，置冰箱中备用。
接种标本后，经孵育，若培养基发生由黄变红的颜色变化，透明无混浊(有别于某些细菌及真菌生长)则可初步判断为有支原体生长。
大多数Uu在24h内可获得阳性结果。
如果培养基发生颜色变化，但液体又有混浊，则应排除杂菌污染, 可用0.45μm滤膜过滤后，作再接种观察。
进一步诊断需将液体培养物接种到固体培养基上培养, 经Dienes法染色后在低倍显微镜下观察集落形态。
阴性结果最好观察５天。
Uu 在固体培养基上集落核心呈粗颗粒状,具极窄的边，有时呈油煎蛋样。
如用Dienes 法染色，集落为特异的蓝色。
一般细菌的菌落不着色，容易鉴别。
(二)代谢抑制试验根据特异性抗体能阻止支原体的生长和代谢这一特性，可用病人血清进行代谢抑制试验。
在加有抗血清的培养基中，支原体的代谢受到抑制，从而阻止了培养基的颜色改变。
代谢抑制试验也可用于检测感染支原体患者血清抗体的滴度。
即将血清作10倍连续稀释后，滴入支原体培养液，并以不加血清的支原体试验管和不加支原体液的培养基管作对照。
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支原体染色液(Dienes 染色液)
简介：
支原体染色液(Dienes 染色液)是一种经典的利用天青美蓝染色检测支原体污染的试剂，经常用于培养的贴壁或悬浮细胞以及组织切片的细胞凋亡检测。
该试剂检测细胞含量范围一般为0.1～1×106之间。
组成：
操作步骤(仅供参考)：
(一)贴壁细胞
1、取洁净盖玻片在70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用无菌的PBS 或生理盐水洗涤3次，再用细胞培养液洗涤1次。
将盖玻片置于6孔板或其他培养皿内，接种细胞培养过夜，使融合率约为50%～80%。
2、加入Dienes 染色液覆盖表面，孵育。
3、弃染色液，PBS 或生理盐水洗2次，每次3min ，吸尽液体。
4、显微镜下观察。
(二)悬浮细胞
1、低速离心离心后吸去大部分液体保留约液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。
2、稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。
3、加入Dienes 染色液覆盖表面，孵育。
4、弃染色液，PBS 或生理盐水洗2次，每次3min ，吸尽液体。
5、显微镜下观察。
注意事项：
1、 在为了获得细胞沉淀的离心的过程中，对于特殊细胞，如果细胞沉淀不充分，可以适当提高离心力或延长离心时间。
2、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期： 12个月有效。
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