脂肪酶活测定
脂肪酶活检测原理及方法
脂肪酶活检测原理及实际方法：一、原理以及标准曲线做法1. 对硝基苯酚酯( 4-Nitrophenyl ester )是脂肪酶水解活力测定中运用最为广泛的一种底物，脂肪酶水解其产生pNP(对硝基苯酚)在碱性条件下显黄色，在410nm 下有吸光值，且灵敏度很高。
2. 所需试剂有：CAS 碳链长度出货号价格名称830-03-5C2N8130-1G ￥462 对硝基苯乙酸酯2635-54-9 C4 N9876-1G￥570 对硝基苯丁酸酯1956-10-1 C821742-1G-F ￥487 对硝基苯辛酸酯1956-11-2 C12 61716-1G ￥435 对硝基苯月桂酸酯1492-30-4 C16 N2752-1G ￥379 对硝基苯棕榈酸酯14617-86-8C18 N3627-1G￥对硝基苯硬酸脂全部为色谱纯试剂，购于sigma 公司3. 标准曲线绘制：a. 标准对硝基苯酚母液(2mM ，2mmol / L): 称取的对硝基苯酚(p-NP)溶于100ml 的溶液B(即不同pH 的缓冲液) ，置于棕色试剂瓶内，4℃冰箱保存。
方法一：b. 标准曲线绘制：分别取，，，，，的对硝基苯酚母液(2mM) ，用溶液B(即不同pH 的缓冲液)稀释至4ml ，分别测定在410nm 处的吸收值。
以对硝基苯酚浓度x(对应浓度分别是，，，，，，单位：mM ) 为横坐标，吸光值y 为纵坐标，绘制标准曲线。
方法二：全部对硝基苯酚经过与测酶活相同的处理，获得吸光度。
b.标准曲线的绘制：分别取0、、、、15、、30、45μL的对硝基苯酚分别加入、、、55、、40、、μL的异丙醇和(全部都是)的溶液B，40℃15min，95%乙醇，10000r / min ，3min ，测出标准曲线。
上表是方法一测得标准曲线脂肪酶酶活定义：在410nm 下测定吸光值, 以 1 min 内催化水解底物对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)产生1μmol 对硝基苯酸(p-NP) 所需的酶量为 1 个酶活单位(U)。
脂肪酶活力测定方法及其比较
万方数据苯萃取后进行比色测定．酶的活力单位定义同平板法．酶活计算同铜皂法．１．３．３对硝基苯酚法对硝基苯酚法是以对硝基苯酚酯作为底物，脂肪酶水解底物产生具有颜色的对硝基苯酚，在４２０ｎｍ波长下测出其吸光光度值，再对照对硝基苯酚吸光度工作曲线得出脂肪酶活力．这样可以使操作更加简单同时可以避免金属离子的干扰［２．１８｜．酶的活力单位定义为检测条件下每分钟产生１ｂｔｍｏｌ对硝基苯酚所需的脂肪酶量，其计算公式为：脂肪酶活力一ＶＮ（Ｃ（样）一Ｃ（空白））／丁／Ｖ（稀释酶液）．式中。
Ｖ反应总体积，Ｎ稀释倍数，Ｃ根据吸光度Ａ求出的对硝基苯酚的浓度，ｔ反应时间，ｙ（稀释酶液）稀释酶液的体积．２３种方法的比较２．１实验仪器和操作难易程度的比较平板法所使用的主要仪器是超净工作台，微量注射器。
培养皿，恒温培养箱，价格便宜，操作简单Ｌ２·１３］；滴定法仅需要酸碱滴定管、试管、恒温水浴锅、酸度计、高速组织捣碎机等一些比较常见，操作简单［”］；比色法包括铜皂法、微乳液法和对硝基苯酚法．铜皂法使用的主要仪器是分光光度计。
超声波装置，仪器较常见，但操作繁琐［１５］；微乳液法使用的仪器主要是分光光度计，操作简单。
精确度高Ｌ１６—１７］；对硝基苯酚法所使用的仪器主要是分光光度计。
操作简单［２·１８］（表１）．２．２实验试剂及精确度的比较平板法使用的试剂主要有维多利亚蓝、三丁酸甘油脂、罗丹明Ｂ等，该实验反应时间长且精确度差［１１］．滴定法所使用的主要试剂有氢氧化钠、酸碱指示剂、聚乙烯醇、橄榄油等［１３｜．滴定中酸碱指示剂不能很好地指示反应终点，即使用酸度计代替酸碱指示剂控制反应终点，产物中丙酮酸的干扰使实验的结果偏大［１ｌ’１９］．铜皂法中的底物有３种：榄橄油，三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂［１５］．其中榄橄油作为底物，精确度不高，当用三油酸甘油脂和三丁酸甘油脂作为底物检测脂肪酶的活性。
精确度较高．微乳液法使用的试剂有三油酸甘油脂，吐温一８０和正己烷，实验重复性好，精确度高Ｌ１６。
脂肪酶
显色剂，均匀搅拌3min，油酸分子与Cu2+
生成绿色的络合物，4000r/min离心10min
后取上层有机相在710nm处测定吸光度。
（三）、对硝基苯酚法
1、溶液配制准备
底物溶液配制:量取对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)0.0378g，加入Triton X-100 1mL，用50mmoL/L Tris-HCL缓冲液（pH值8.0）定容100mmL。
8
9
10
10
20
14
38
33
五、结果与讨论
测定速度： 滴定法 稳定性： 铜皂法 铜皂法 对硝基苯酚法 对硝基苯酚法 滴定法
灵敏度：
对硝基苯酚法
铜皂法
滴定法
实际应用中，可根据不同需要选择测定方法。
酶相互间无法进行正常的活力比较。本实验就酸
碱ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ定法、铜皂法、对硝基苯酚法三种常用方法 进行了比较。
二、实验材料
脂肪酶，生物工程研究室提供
榨汁机，分析天平，碱性滴定管， 分光光度计，pH计，离心机，恒温水浴锅
脂肪酶活力单位
脂肪酶活力单位定义：在一定条件下，
每分钟释放出1μmoL脂肪酸的酶的量定义为
一个脂肪酶活力单位（U）。
三、实验方法
（一）、滴定法
底物溶液（乳化液）配制:量取4%PVA溶液150mL, 加入橄榄油50mL，用榨汁机处理3min，现配现用。
脂肪酶溶液配制:配制pH值为7.38的0.5mg/mL脂
肪酶溶液。
(二)、铜皂法
1、脂肪酸吸光度标准曲线的绘制
配制一系列不同浓度的油酸溶液，分别 取4mL油酸溶液置于锥形瓶中，加入1mL
18.32
16.98
19.23
脂肪酶测定标准操作程序
脂肪酶测定标准操作程序1. 摘要脂肪酶检测用于定量测定人血清或血浆中脂肪酶的活力，用于临床相关疾病的辅助诊断。
2. 适用范围程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中LPS 的浓度。
3. 职责使用日立7600自动生化分析仪进行测定LPS 浓度的工作人员要严格按照本SOP 程序进行,室负责人监督管理；本SOP 的改动，可由任一使用本SOP 的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。
4. 检测方法上海科华生物工程股份有限公司生产的二脂肪酶监测试剂盒采用的是酶法。
5. 原理1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯−−→−脂肪酶1，2-领-二月桂基-消旋-甘油+戊二酸+6-甲基试卤素灵 1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯在样本中的脂肪酶的作用下水解生成1，2-领-二月桂基-消旋-甘油、戊二酸以及红色的6-甲基试卤素灵。
由于甲基试卤素灵在波长570nm 附近处有吸收峰所以在一定脂肪酶活力范围内，570nm 处吸光度的变化值与样本中脂肪酶活力成正比。
6. 仪器日立7600自动生化分析仪7. 试剂7.1 试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2 试剂瓶内主要成分：R1：Good ’s 缓冲液、共脂肪酶、脱氧胆酸钠、乙酸钙R2：酒石酸缓冲液、1，2-领-二月桂基-消旋-甘油-3戊二酸（6-甲基试卤素灵）酯、牛脱氧胆酸钠。
7.3 试剂稳定性：试剂避光保存于2-8℃，若无污染，可稳定至失效期，本试剂有效期为12个月。
试剂不可冰冻。
试剂开瓶后冷藏于分析仪中可以保存14天。
7.4 试剂准备：试剂为即用式。
8.标准品和质量控制8.1校准程序：使用某某公司提供的标准品对自动分析仪进行校准。
按照公司标准品使用要求，并以9g/L氯化钠溶液或去离子水为空白，经校准测定，仪器自动对标准品响应量通过合适的数学模型绘制校准曲线。
8.2质控品某某公司提供的生化复合定值质控血清做为室内质控品。
酶测定方法
脂肪酶活性测定方法1、粗酶液的制备用电子天平分别称取粗脂肪酶0.010 g、0.020 g 和0.030 g，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，配成浓度分别为0.01%、0.02% 和0.03%的粗酶液。
2、实验设计本实验以10 mL色拉油为底物，以酶用量、水解温度、反应时间为因素，通过酸价的测定选定其水解的最佳条件。
3、酸价的测定酸价是指中和1 mol游离脂肪酸所需NaOH的毫克数，它用于衡量油脂的水解程度。
实验中用酸碱滴定法测定水解液的酸价，参照文献[ 3，4 ]中所使用的方法，向所得的水解液滴加1 mL 95%的乙醇溶液，摇匀，终止反应，并加入2滴酚酞指示剂，迅速用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至溶液呈微红色，在30 s内不消失为终点，记录消耗的NaOH溶液毫升数(V ) 。
用同样的方法测定空白值，每个试验重复两次，以平均值作为测定结果。
酸价按下式计算：X = C (V - V0 ) ×40 /M式中: X —油脂酸价(mgNaOH /g油)C—NaOH标准溶液的浓度(mol/L)M —试样的质量( g)40—NaOH的mmol质量(mg/mmol)4 粗脂肪酶活力的测定在最佳水解条件下，分别测得粗脂肪酶和标准脂肪酶水解液的酸价X1、X2 ，根据公式U1 /U= X1 / X2求得粗脂肪酶的活力，其中U1为粗脂肪酶活力，U为标准脂肪酶活力。
5标准脂肪酶液的配制根据实验最佳条件，配制标准脂肪酶液。
一篇相关文献粗脂肪酶活力的测定方法的研究.pdf答：实验设计，本实验以10 mL色拉油为底物，以酶用量、水解温度、反应时间为因素，通过酸价的测定选定其水解的最佳条件。
用色拉油作底物不太妥，一般是用橄榄油，化学纯的。
脂肪酶的测定
脂肪酶的测定脂肪酶是一种能够加速脂肪分解的酶类物质，它在人类的体内起着非常重要的作用。
脂肪酶的测定是衡量人体脂肪代谢能力的一种方法，可以用于研究肥胖、代谢疾病等疾病的发病机制。
脂肪酶的测定方法有很多种，其中最常用的是化学法和免疫法。
化学法是利用化学反应测定脂肪酶的活性，它的原理是将样品与一种特定底物反应，通过测定产生的底物或反应产物的浓度，来计算脂肪酶的活性。
常用的底物有三酰甘油、辅酶A等。
免疫法则是利用特异性抗体与脂肪酶结合反应，进行测定。
这种方法具有灵敏度高、特异性好、操作简单等优点。
在进行脂肪酶测定前，需要收集样品。
常用的样品有血浆、血清、尿液等。
对于血浆和血清样品，需要在采集后立即离心分离血清或血浆，避免冷藏时间过长而影响测定结果。
对于尿液样品，需要在采集后立即保存在冰箱中，避免样品在室温下发生酶解反应。
此外，还需要注意样品的质量和数量，以保证测定结果的准确性。
脂肪酶的测定结果可以反映人体脂肪代谢能力的强弱。
正常情况下，脂肪酶的活性处于一定的范围内。
如果脂肪酶活性过高，说明人体脂肪代谢能力较强，有利于减肥和预防肥胖等疾病；反之，如果脂肪酶活性过低，说明人体脂肪代谢能力较弱，容易出现肥胖和代谢性疾病等问题。
需要注意的是，脂肪酶的测定结果并不是唯一的评估指标，还需要结合其他指标如体重、体脂率、血糖、血脂等指标进行综合分析。
此外，脂肪酶的测定结果也受到许多因素的影响，如年龄、性别、饮食、运动等因素都会对脂肪酶活性产生影响，因此需要综合考虑。
脂肪酶的测定是衡量人体脂肪代谢能力的一种方法，它对于研究肥胖和代谢疾病等疾病的发病机制具有重要的意义。
在进行脂肪酶测定时，需要注意样品的采集、处理和测定方法的选择，以保证测定结果的准确性。
胰脂肪酶活性测定注意事项
胰脂肪酶活性测定注意事项胰脂肪酶（pancreatic lipase）是一种通过水解三酰甘油和脂肪酸酯链结合来帮助消化脂肪的酶。
测定胰脂肪酶的活性是了解消化功能的一种方法，下面是关于胰脂肪酶活性测定的注意事项：1. 试剂准备：准备好所需的试剂，包括缓冲液、底物、洗涤液等。
确保试剂的质量良好，避免使用过期的试剂。
2. 样本处理：样本前处理是测定胰脂肪酶活性的重要一步。
富含胰脂肪酶的动物来源样本如肠道内容物、胰腺细胞提取物等需要进行样本预处理，去除其他干扰成分，如胆汁酸、其他脂肪酶等。
3. 反应温度：胰脂肪酶最适宜的反应温度为37。
因此，在进行测定时应将反应温度控制在37，需要使用恒温器等设备来保持恒温状态。
4. 底物的选择：选择适宜的底物是测定胰脂肪酶活性的关键。
常用的底物有油脂类物质，如三酰甘油或单酰甘油。
根据实验目的和样本特点选择合适的底物。
5. 时间控制：对于胰脂肪酶活性的测定，时间是一个重要的因素。
反应的时间过长容易造成底物的过度水解，时间过短则不足以反映胰脂肪酶的活性。
因此，需要根据实验需要来控制反应时间。
6. 防止底物水解：在测定胰脂肪酶活性时，需要注意防止底物的自身水解。
在反应过程中添加适量的胆盐或其他帮助胰脂肪酶活性的辅助因子，可以有效减少底物的水解。
7. 固定反应终点：胰脂肪酶的活性测定可以通过测量产生的游离脂肪酸的数量来判断。
一般可以通过取样物质中游离脂肪酸的浓度来测定胰脂肪酶的活性。
8. 质量控制：在进行胰脂肪酶活性测定时，需要进行质量控制。
可以通过使用标准品来进行标定和校准，确保测定结果的准确性和可靠性。
总结起来，胰脂肪酶活性测定是一项复杂的实验操作，需要注意样本的处理、试剂的选择、反应温度的控制、底物的选择、时间控制等方面。
合理设计实验方案，严格按照操作步骤进行实验，可以得到准确可靠的胰脂肪酶活性测定结果。
脂肪酶的检测方法
脂肪酶的检测方法1. 引言脂肪酶是一类能催化脂肪酯的水解反应的酶。
脂肪酶在食品工业、医学领域等具有重要的应用价值。
为了准确、快速地检测脂肪酶的活性和浓度，科学家们开发了多种检测方法。
本文将详细介绍脂肪酶的相关概念以及常用的检测方法，并对其优缺点进行比较分析。
2. 脂肪酶的概述脂肪酶是一种水解酶，主要催化脂肪酯的水解反应，将脂肪酯分解为甘油和脂肪酸。
脂肪酶广泛存在于动植物的组织中，如胃液、胆汁、胰液等。
脂肪酶的作用对于人体的脂肪消化和吸收至关重要，但过高或过低的脂肪酶活性都可能对人体健康产生不良影响。
3. 脂肪酶的检测方法概述常见的脂肪酶检测方法包括传统的酶活性测定法、光谱法、电化学法、电镜法等。
下面将分别介绍这些方法的原理、步骤以及优缺点。
3.1 传统的酶活性测定法•原理：该方法通过测定脂肪酶对底物的水解反应，间接反映脂肪酶的活性。
•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。
2.混合样品和底物溶液，并控制反应条件（温度、pH等）。
3.反应一段时间后停止反应。
4.使用比色法、比浊法等方法来测定反应产物（如甘油）的含量。
•优点：方法简单、成本低廉。
•缺点：测定结果受其他干扰物影响较大，灵敏度相对较低。
3.2 光谱法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中底物或产物的光学性质变化来检测脂肪酶活性。
•步骤：1.准备含有脂肪酶的样品和底物溶液。
2.在一定时间内记录底物或产物的光谱变化。
3.分析光谱数据，计算脂肪酶活性。
•优点：结果准确、灵敏度较高。
•缺点：需要专用的光谱仪器，成本相对较高。
3.3 电化学法•原理：该方法利用脂肪酶催化反应过程中产生的电流或电势变化来检测脂肪酶活性。
•步骤：1.在电极表面修饰脂肪酶或底物，并固定在电极上。
2.浸入电解质溶液中，建立电化学检测系统。
3.测量电流或电位的变化，并计算脂肪酶活性。
•优点：结果准确、实时监测。
•缺点：需要专用的电化学仪器，操作复杂。
3.4 电镜法•原理：该方法通过电镜观察样品中脂肪酶的形态和数量来评估脂肪酶活性。
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一．脂肪酶活测定
原理：脂肪酶在一定条件下，将甘油三酯水解。
在不同水解阶段可分别产生脂肪酸、甘油二酯、甘油一酯及甘油。
水解所产生的脂肪酸可以用标准的氢氧化钠滴定，用滴定值表示酶活力。
酸碱滴定法 :
酶活力以国际单位表示，即在一定条件下，脂肪酶水解脂肪每分钟产生1微克分子脂肪酸的酶量定为一个国际单位。
脂肪酶活力单位＝(A-B)*nf/t*v
式中：A为样品耗碱液ml数，B为对照组耗碱液ml数，n为每毫升碱液微克分子数
(n=cM=0.05x23x1000)，f为稀释倍数，t为作用时间(分),v:反应的酶液的体积
二．挥发性脂肪酸（VFA）的测定
滴定法分析
1原理：将废水以磷酸酸化后，从中蒸发出挥发性脂肪酸，再以酚酞为指示剂用NaOH 溶液滴定馏出液。
废水中的氨态氮可能对测定形成干扰，因此应当首先在碱性条件下蒸发出氨态氮。
4．计算
挥发性脂肪酸含量计算如下：
VFA=V (NaOH)*C*1000/Vs (mmol/L)
式中：V(NaOH)-----滴定消耗的NaOH标准溶液的体积，ml;
c ------ 滴定消耗的NaOH标准溶液的准确浓度，mol/L;
Vs--------被测废水水样的体积，ml.
酶活力定义：40℃,ph为5.6的条件下，每分钟酶解淀粉释放出lmg的还原糖(葡萄糖)所需酶量为一个酶活力单位。
1U=1mg还原糖\min.ml酶
三．淀粉水解酶活性
原理：淀粉的水解产物麦芽糖及其他还原性糖能与3，5-二硝基水杨酸试剂反应，使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。
在一定范围内，其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比，可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位体积样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
四.纤维素酶酶活力测定：
原理：纤维素酶水解纤维素，产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，在550nm波长处有最大光吸收，在一定的范围内，还原糖的量与反应液的颜色强度成比例关系，利用比色法测定其还原糖的量
就可测定纤维素酶的活力。
酶活单位定义为;在上述反应条件下，每分钟酶解CMC释放出lug的还原糖(葡萄糖)所需酶量为一个酶活力单位。
纤维素水解酶单位(U\ml)=b.n.1000\vt
b:从标准曲线查得的葡萄糖含量(mg)
n：稀释倍数
1000：毫克换算成微克的换算系数
V：测定时吸取的稀释酶液体积
t：反应时间。