副猪嗜血杆菌的分离鉴定

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副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制为了查明导致北疆地区部分规模化猪场疑似副猪嗜血杆菌病的病原及其生物学特性。

方法:采集来源于不同地区规模化猪场病死猪的病料,包括肺脏、淋巴结和关节积液等;选择TSA培养基培养,采用10%CO2兼性厌氧条件对细菌分离,根据该菌的16S rRNA来设计引物,采用PCR方法对分离株进行鉴定,然后观察其培养、生理生化、血清学和药敏特性,最后观察分离株对小鼠的致病性。

为提高候选株的培养效率,掌握候选株的生长特性,为疫苗菌株的制备提供理论依据。

本试验选择基于OD值连续测定的活菌计数法,将候选株接种于TSB培养基上,置于10%CO2培养,对该菌株的OD600值进行测定。

鉴于副猪嗜血杆菌血清型众多,商品化疫苗尚未全部覆盖。

本试验以不同血清型的菌株作为候选菌株,进行扩大培养,制备菌体灭活苗,同时对该疫苗的物理性状、安全性和免疫保护力进行评价。

结果:总共从174份病料中分离到31株分离株,其生理生化、培养及分子特征均符合副猪嗜血杆菌的特性;且分离株的血清型包括1、4、5、12四种;分离株副猪嗜血杆菌对庆大霉素、磺胺异噁唑、土霉素、头孢噻肟、林可霉素和氟苯尼考的耐药率分别为:35%、44%、26%、11%、48%和21%,为进一步控制该地区副猪嗜血杆菌病提供了理论基础;小鼠感染实验结果显示:67%的HPS分离株的致病力较强,可导致实验小鼠死亡;对分离株HZG-6的生长曲线测定结果表明:分离株HZG-6在1621小时内菌液的OD600值迅速升高,并在21 h时达到最大值,然后呈下降趋势。

结果揭示,此菌作为疫苗候选种子进行扩大培养的最佳收菌时间为培养后的第21 h。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验

副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验张立宪;游一【摘要】Five strains of gram negative bacilli were isolated from a pig farm of Jiaozuo, which were suspected to be Haemophilus parasuis.Inorder to control the epidemic,Haemophilus parasuis was finally diagnosed by cultural and infection characteristics,biochemical tests,PCR and pathogenicity examination. The results of drug sensitivity test indicatedthat the isolated strains were sensitive to ceftiofur,cefotaxime, amikacin,lomefloxacin, and not sensitive tochloramphenicol,amoxicillin,clindamycin,chlortetracycline, enrofloxacin,doxycyclile, and resistant to penicillinG,ampicillin,streptomycin,sulfamonomethoxine.%从焦作市疑似感染副猪嗜血杆菌病的某猪场送检病料中分离到5株致病杆菌后，为控制疫情，对细菌进行培养特性、生化特性及PCR鉴定，并进行致病性和药敏试验。

结果显示，分离菌株为副猪嗜血杆菌，该菌对丁胺卡那、洛美沙星、头孢噻肟、头孢噻呋较为敏感，对强力霉素、恩诺沙星、金霉素、克林霉素、阿莫西林、氯霉素不太敏感，对链霉素、氨苄西林、青霉素G、磺胺间甲氧嘧啶耐药。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及多重PCR检测Hps和APP方法的建立的开题报告

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及多重PCR检测Hps和APP方
法的建立的开题报告
——细菌学领域的新进展
一、研究背景
副猪嗜血杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）是一种重要的猪流感病原体，全球范围内都有报道。

引起猪流感的APP共有15个亚型，其中一些报告称引起流感的病原体，其病原性不同，在猪、牛、羊、马等动物中也有报道出现同种或不同
种APP。

其主要特征为引起猪流感，呼吸道疾病，危害程度相当严重，对于猪畜养殖
业有着重大危害。

目前，许多研究已经开展了副猪嗜血杆菌的分离鉴定和病理危害性等研究工作。

然而，基于多重PCR检测Hps和APP的方法还需要进一步解决。

二、研究内容
本研究旨在建立一种新的多重PCR检测Hps和APP方法，通过副猪嗜血杆菌的
分离鉴定，实现Hps和APP的快速检测和定量分析。

该方法将组合扩增、单独扩增技术结合，利用Hps和APP特异性基因的片段序列，扩增相应的特异性片段，从而达到对其进行检测和定量分析的目的。

在建立的检测方法中，将考虑不同温度、不同酶和
试剂浓度进行优化，以提高方法的灵敏度和特异性。

三、研究意义
该研究将为副猪嗜血杆菌的分离鉴定和病理危害性等研究工作提供有价值的参考。

建立新的多重PCR检测Hps和APP方法，将有助于实现对副猪嗜血杆菌疾病的快速、准确的检测和定量分析，推进相关领域技术的发展和进步。

副猪嗜血杆菌病病原菌的分离与鉴定.doc

副猪嗜血杆菌病病原菌的分离与鉴定概述：副嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)引起的多发性浆膜炎和关节炎，该病又称为革拉泽氏病(Glasser’SDisease)，影响从2周龄到4月龄的青年，主要在断奶前后和保育阶段发病。

通常见于5～8周龄的，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达到50％。

主要临床症状表现为咳嗽，呼吸困难，消瘦，跛行和被毛粗乱；主要剖检病变表现为胸膜炎，心包炎，腹膜炎，关节炎和脑膜炎等。

随着世界养业的发展，该病已成为全球范围内影响养业的典型细菌性疾病。

由于饲养技术的调整以及突发新的呼吸道综合征，使得该病日趋流行，危害日渐严重。

近年来，随着水平的提高，副嗜血杆菌在我国各场引起多发性浆膜炎和关节炎的报道屡见不鲜，其损失相当惨重。

为预防该病，国内外虽然研制了各种类型的基因工程菌苗与多价灭活菌苗，但由于副嗜血杆菌血清型众多，各个地方的流行菌株各不相同，各个血清型之间的交叉保护性不高，菌苗的免疫效果并不理想。

笔者对长治市某大型场的副嗜血杆菌进行了分离和鉴定，以便选择针对性较强的菌株作为菌苗株，以起到更好的预防效果，并为副嗜血杆菌病的进一步研究奠定基础。

1材料与方法1．1病料的采集对2个病死仔进行尸体解剖(应无菌操作)，打开胸腔和腹腔，首先吸取积液或以棉签拭取胸膜及腹膜粘附物，然后再取内脏，内脏器官须实验室无菌操作，以灼烧过的手术刀烫烙剖面，取深层组织涂板培养。

1．2主要培养基本试验选择以下配方：胰蛋白胨0．6g、酵母浸出粉1．0g、可溶性淀粉0．25g、枸椽酸钠0．15g、普通营养琼脂粉4．5g。

加蒸馏水至lOOmL，溶解后调pH至7．2～7．4，然后高压上述混合物，120％，15min。

在水浴中冷却至80％。

加10mL无菌脱纤绵羊血，在80％水浴中漩摇10～15min。

在冷却至50％时，加入无菌辅酶I(NAD)至15g／mL，加入万古霉素至50g／mL。

倾倒大约4mm厚平皿，冷却后4℃保存备用。

副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定和药敏试验

副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定和药敏试验在规模化集约化猪场内，副猪嗜血杆菌病时有发生，表现为多发性浆膜炎和关节炎，主要感染断奶前后和保育阶段猪，发病率一般在10%-15%，严重时死亡率可达50%。

我们实验室对湖南地区某猪场疑似病例进行了病原的分离鉴定和药敏试验，得到良好的治疗效果。

现将结果报告如下：一、材料1、病料：在无菌操作条件下取疑似病猪的肺脏、胸膜、胸腹腔积水、心包积液、心血、关节液等。

2、培养基：巧克力琼脂平板或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）。

3、生化试验试剂：氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、糖、脲酶和伯胶糖等，均购自长沙金标生物有限公司。

4、药敏试纸：氟苯尼考、泰妙菌素、头孢菌素、丁胺卡那霉素、氟甲砜霉素、头孢噻肟、红霉素、克林霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、链霉素、土霉素, 均购自长沙金标生物有限公司。

二、方法及结果1、病理变化观察剖检病死猪，发现胸腔内有大量淡红色液体、纤维性渗出物。

肺脏呈纤维素性胸膜肺炎，肺肿大暗紫红色，表面覆有纤维素性渗出物。

支气管内有淡红色泡沫样渗出物。

心包积液。

腹腔内有大量透明黄褐色渗出液，有的呈胶胨状凝块。

全身淋巴结肿大，暗红色。

2、触片镜检取发病猪的肺组织、心血、胸水和腹膜面涂片，革兰氏染色，镜检可见革兰氏阴性的细小杆菌，个别两极球杆状革兰氏阴性菌。

3、细菌分离培养无菌取发病猪的肺脏、腹膜、胸水和心血划线接种TSA平板，置37℃，5%CO2培养箱培养48h，出现无色、透明、湿润、光滑、边缘整齐的针头大小菌落，镜检可见大小不一、形态有细长、丝状的革兰氏阴性杆菌。

接种无NAD的TSA不生长。

而后挑取单个菌落，再进行纯培养。

4、生化试验挑取纯化菌落接种于氧化酶、甘露醇、吲哚、葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、核糖、脲酶和伯胶糖等生化鉴定管中，同时加入0.01%的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）5微升，置于37℃5%的CO2 培养箱培养48h，观察结果如下：。

一株4_型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与耐药性分析

DOI：10.16174/j.issn.1673-4645.2023.04.022收稿日期：2022-12-06作者简介：栗卫东（1982-），男，本科，兽医师，主要从事动物疫病防治技术的研究推广工作一株4型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与耐药性分析栗卫东(济源市农业综合行政执法支队,河南济源459000)摘要:为研究河南省济源市某养猪场副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS )流行情况和耐药性,便于开展有效防控,采集了养猪场疑似HPS 病死猪肺脏、关节液等病料,进行细菌纯化培养、生化试验、PCR 鉴定、血清分型鉴定和药敏试验。

结果表明,从该猪场分离到一株4型副猪嗜血杆菌,该分离菌对头孢曲松、头孢噻肟、氨苄西林、阿莫西林敏感。

本研究可为HPS 病诊断和抗生素药物治疗提供参考。

关键词:副猪嗜血杆菌;分离鉴定;血清型;耐药性;猪中图分类号:S828;S858.28文献标识码:A文章编号:1673-4645(2023)04-0093-04开放科学(资源服务)标识码(OSID ),扫一扫,了解文章更多内容副猪嗜血杆菌病是一种由巴氏杆菌科的副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,HPS ）感染猪引起的以多发性纤维素性心包炎、脑膜炎、关节炎和浆膜炎为病理特征的细菌性传染病[1]。

病猪多表现为发烧，呼吸困难，关节肿胀，皮肤及黏膜发绀，部分猪可见共济失调、转圈等神经症状。

副猪嗜血杆菌病在世界各地的养猪场均有发生，我国猪群的病死率一般为30%～40%，严重时可达50%[2]，断奶仔猪和保育猪多发，给养猪业造成严重经济损失。

HPS 通常存在于猪的上呼吸道，为条件致病菌，健康猪并不发病，多在受到应激、感染免疫抑制性猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪瘟等多种疾病影响下，猪机体免疫力降低，继发HPS 病，加重猪的病情。

HPS 血清型较多，目前已发现15个血清型，其他20%以上的分离株血清型未能定型[3]。

副猪嗜血杆菌分离鉴定及其灭活苗的研制的开题报告

副猪嗜血杆菌分离鉴定及其灭活苗的研制的开题报告
题目：
副猪嗜血杆菌分离鉴定及其灭活苗的研制
问题描述：
副猪嗜血杆菌是一种引起猪弧菌病的病原菌，严重威胁了猪的健康和猪肉的质量安全。

本研究旨在通过分离鉴定副猪嗜血杆菌，研发一种环保、高效的灭活苗，为猪
病防治提供有力保障。

研究内容：
1.采样和副猪嗜血杆菌的分离鉴定。

收集不同地区和不同猪场的猪血样本，利用大肠杆菌染色和生化实验，筛选并鉴定出副猪嗜血杆菌。

2.副猪嗜血杆菌的灭活方法研究。

研究不同灭活方法对副猪嗜血杆菌的杀伤效果，包括热灭活、化学灭活和辐射灭活等。

3.副猪嗜血杆菌灭活苗的制备。

研究灭活苗的适宜配比、接种剂量和免疫程序，并进行动物实验，评价其保护效果和安全性。

4.副猪嗜血杆菌灭活苗的应用实践。

将研制出的灭活苗应用于猪场，观察其在猪群中的控制效果和经济效益。

研究意义：
本研究旨在解决副猪嗜血杆菌病防治问题，为猪肉质量安全和养猪业健康发展提供有力支持。

同时，本研究将探索一种新的灭活苗制备方法，为病原菌灭活苗的研究
提供参考。

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制

副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制副猪嗜血杆菌的分离鉴定及菌体灭活苗的研制引言：副猪嗜血杆菌（Actinobacillus suis），属于革兰阴性菌，是猪猩红热的病原菌，可引起猪的败血症、关节炎等严重疾病，对养殖业造成了严重威胁。

因此，对副猪嗜血杆菌进行准确分离鉴定，并研制出有效的疫苗，对于疾病的控制和预防起着重要作用。

一、副猪嗜血杆菌的分离鉴定方法1. 采集样品：从病猪关节、心脏等部位采集组织样品，并迅速送至实验室进行处理。

2. 消毒处理：将采集到的样品进行外部消毒处理，避免其他细菌的污染。

3. 细菌分离：将样品切成小块，接种于选择性培养基（专门用于分离培养副猪嗜血杆菌的培养基），并在适宜条件下培养。

4. 菌体特征观察：观察分离培养物的菌落形态、颜色等特征，以初步判断其为副猪嗜血杆菌。

5. 生化试验：通过一系列碳源利用试验、酶活性测试等进行进一步鉴定，以确认其为副猪嗜血杆菌。

6. 分子生物学鉴定：采用PCR技术，利用特异性引物扩增副猪嗜血杆菌的特异基因片段，通过比对序列与已知菌株的基因序列进行比对，确认其为副猪嗜血杆菌。

二、副猪嗜血杆菌菌体灭活苗的研制1. 菌体培养：在含有适宜营养成分的培养基中培养副猪嗜血杆菌，并控制培养条件，使细菌倍增到一定浓度。

2. 菌体灭活：通过加热、紫外线照射、化学消毒等方法对菌体进行灭活，同时保持菌体表面抗原的完整性。

3. 佐剂的选择：选择合适的佐剂，如低聚糖、脂质体等，以增强疫苗的免疫效果。

4. 疫苗制备：将菌体灭活液与佐剂充分混合，并进行过滤、冷冻保存等步骤，得到最终的菌体灭活苗。

5. 动物实验证实：选择一定数量的健康猪作为实验对象，将灭活苗进行注射，观察其免疫效果、安全性等指标，并与对照组进行对比分析。

6. 疫苗生产：在动物实验证实通过后，将菌体灭活苗进行大规模生产，以满足养殖业的需求。

三、疫苗的应用与前景展望副猪嗜血杆菌菌体灭活苗的研制成功，为猪猩红热的防控提供了重要工具。

多重感染猪场副猪嗜血杆菌的分享与鉴定

表现为消瘦、被毛粗乱，病死猪有的皮肤发红、有的皮肤苍 15 mL，置 100 ℃ 30 min 灭菌。于一管中加入 30 μg 辅酶 I
白；多数咳嗽或气喘，有的跛行、关节肿大。解剖 2 头病死（氧化型 NAD），另一管不加，在于每管中接种 0.5 mL 灭菌
猪（20 ～ 25 kg），其中一头有明显的皮肤与肾脏病变；另一生理盐水分离菌菌落悬浮液，置 37 ℃摇振培养，0 h 及每间
2008 年 9 月，笔者从江苏太仓市某商品猪场分离到一株然后用接种针挑取金黄色葡萄球菌以“ 井 ” 字样划线，
毒力较强的副猪嗜血杆菌，并从培养特性、生化特性、分子 37 ℃ 24 ～ 48 h，5% CO 条件下培养。结果（如图 1 所示）， 2
生物学特征及致病性等方面进行了鉴定，现报道如下。
氏阴性短小杆菌或呈球杆状，未见到丝状菌体，未观察到荚膜。 2.3 “卫星现象 ”试验
将分离菌纯培养物密集划线于绵羊血琼脂平板上，
图 1 分离菌的“卫星现象”，白色“#”字（金黄色葡萄球菌）划线周边布满露珠状生长的副猪嗜血杆菌，较远的区域呈现
无菌落生长的空白区。
为断奶后多系统消耗综合征（PMWS）。
0 h 细菌分离与鉴定 2.1 细菌分离
NAD 的培养管在近 20 h 的培养时间中，OD 值呈上升趋势，前 12 h 细菌生长繁殖较快。此现象与结果表明分离菌具有副
将在无菌条件下采集的多发性浆膜炎病死猪病料进行细
猪群保健
HEALTH
多重感染猪场副猪嗜血杆菌的分离与鉴定
周宗清，邹勇，王英，张春玲，蒋凤英（1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海邮编；2.上海佳牧生物制品有限公司，上海邮编）

1株血清10型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性分析

中国畜牧兽医 2024,51(4):1671-1685C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 1株血清10型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性分析戴璐1,张千1,万佳佳1,谢婷婷1,贾一珍1,张锐1,张付贤1,刘峰1,雷连成1,2(1.长江大学动物科学技术学院,荆州434023;2.吉林大学动物医学学院,长春130062)摘要:ʌ目的ɔ阐明引起荆州某猪厂仔猪疑似副猪嗜血杆菌病的病原生理生化特性㊁毒力与药物敏感性,为今后对该病的防治提供科学依据㊂ʌ方法ɔ从患病仔猪中分离培养病原菌,通过形态学观察㊁生理生化鉴定㊁P C R 鉴定㊁16S r R N A 基因测序㊁血清型鉴定㊁多序列位点分型(M L S T )对分离菌株进行鉴定㊂通过毒力基因检测㊁小鼠致病性㊁药敏试验㊁中药治疗试验等对分离株进行致病性㊁耐药性分析㊂ʌ结果ɔ通过形态学观察㊁生理生化试验㊁16S r R N A 序列比对㊁系统进化树分析确定分离菌株为副猪嗜血杆菌㊂通过血清型与M L S T 分析确定分离菌株为血清10型㊁S T 型为299㊂毒力基因检测发现,分离菌株具有C a p D ㊁v t a 1㊁v t a 2等15种毒力基因㊂将分离菌株腹腔注射感染小鼠,可导致小鼠多个脏器发生明显病变,具有较强致病性㊂耐药基因检测试验发现,分离菌株具有β-内酰胺类耐药基因b l a O X A 和氟喹诺酮类耐药基因g y r A ㊂药敏试验结果显示,分离菌株对头孢他啶㊁新霉素㊁米诺环素等10种抗菌药物敏感,同时对明雄黄㊁款冬花㊁全蝎3种中药敏感㊂中药治疗试验结果表明,明雄黄和全蝎对分离菌株感染小鼠有较明显的治疗作用㊂ʌ结论ɔ试验成功分离1株血清10型副猪嗜血杆菌,侵染小鼠可致多个器官出血坏死,该菌株对10种抗菌药物及3种中药敏感,且明雄黄和全蝎对分离菌株感染小鼠治疗效果明显㊂研究结果可为今后副猪嗜血杆菌的防治和临床诊疗提供参考依据㊂关键词:副猪嗜血杆菌;血清10型;S T -299型;毒力基因;药物敏感性中图分类号:S 852.61+2文献标识码:AD o i :10.16431/j.c n k i .1671-7236.2024.04.035 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-09-11基金项目:国家自然科学基金青年科学基金项目(32002252)联系方式:戴璐,E -m a i l :2357758542@q q .c o m ㊂通信作者刘峰,E -m a i l :l i u f e n g 68431@163.c o m ;雷连成,E -m a i l :l e i l i a n c h e n g@163.c o m I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o na n dB i o l o g i c a l C h a r a c t e r i s t i c sA n a l ys i s o f a S t r a i no f H a e m o p h i l u s p a r a s u i s S e r o t y pe 10D A IL u 1,Z H A N G Q i a n 1,WA NJ i a j i a 1,X I ET i n g t i n g 1,J I A Y i z h e n 1,Z H A N G R u i 1,Z H A N GF u x i a n 1,L I U F e n g 1,L E IL i a n c h e n g1,2(1.C o l l e g e o f A n i m a lS c i e n c e a n dT e c h n o l o g y ,Y a n g t z eU n i v e r s i t y ,J i n gz h o u 434023,C h i n a ;2.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,J i l i nU n i v e r s i t y ,C h a n g c h u n 130062,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h i ss t u d y w a sa i m e dt o e l u c i d a t et h e p h y s i o l o gi c a la n d b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ,v i 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y t e s to f m o u s e ,d r u g s e n s i t i v i t y te s ta n d中国畜牧兽医51卷t r a d i t i o n a l C h i n e s e m e d i c i n e t r e a t m e n t.ʌR e s u l tɔT h r o u g h m o r p h o l o g i c a l o b s e r v a t i o n, p h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s,16Sr R N As e q u e n c ea l i g n m e n t a n d p h y l o g e n e t i c t r e e a n a l y s i s,t h ei s o l a t e w a si d e n t i f i e d a s H a e m o p h i l u s p a r a s u i s.S e r o t y p e a n d M L S T a n a l y s i s c o n f i r m e d t h a t t h e i s o l a t ew a s s e r o t y p e10a n d S T-299.V i r u l e n c e g e n e t e s t s h o w e d t h a t t h e i s o l a t e h a d15v i r u l e n c e g e n e ss u c ha s C a p D,v t a1a n d v t a2.T h e i s o l a t ec o u l dc a u s eo b v i o u s l e s i o n s i n m a n y o r g a n s o f t h e i n f e c t e d m i c eb y i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o na n dh a ds t r o n gp a t h o g e n i c i t y.T h e d e t e c t i o no f d r u g r e s i s t a n c e g e n e s s h o w e d t h a t t h e i s o l a t e h a dβ-l a c t a mr e s i s t a n c e g e n e b l a O X A a n d f l u o r o q u i n o l o n er e s i s t a n c e g e n e g y r A.T h ed r u g s e n s i t i v i t y t e s ts h o w e dt h a tt h ei s o l a t e w a s s e n s i t i v e t o10k i n d s o f a n t i b i o t i c s,s u c ha s c e f t r i a x o n e,n e o m y c i na n dm i n o c y c l i n e,a n d t o3k i n d s o f t r a d i t i o n a l C h i n e s em e d i c i n e s i n c l u d i n g r e a l g a r,T u s s i l a g o f a r f a r a a n d B u t h u sm a r t e n s i i.T h e t r a d i t i o n a lC h i n e s e m e d i c i n et r e a t m e n ts h o w e dt h a tr e a l g a ra n d B u t h u sm a r t e n s i i h a do b v i o u s t h e r a p e u t i ce f f e c t o n m i c ei n f e c t e d b y t h ei s o l a t e.ʌC o n c l u s i o nɔI n t h i s s t u d y,a s t r a i n o f H a e m o p h i l u s p a r a s u i s s e r o t y p e10w a ss u c c e s s f u l l y i s o l a t e d w h i c hc o u l dc a u s eb l e e d i n g a n d n e c r o s i s o fm u l t i p l eo r g a n s i ni n f e c t e d m i c e,a n d w a ss e n s i t i v et o10k i n d so fa n t i b i o t i c sa n d3 k i n d so ft r a d i t i o n a lC h i n e s e m e d i c i n e s.I t w a sf o u n dt h a tr e a l g a ra n d B u t h u sm a r t e n s i i w e r e e f f e c t i v e i nt r e a t i n g m i c ei n f e c t e d b y t h ei s o l a t e.T h er e s u l t s p r o v i d e dar e f e r e n c ef o rf u t u r e p r e v e n t i o na n d t r e a t m e n t o f H a e m o p h i l u s p a r a s u i s.K e y w o r d s:H a e m o p h i l u s p a r a s u i s;s e r o t y p e10;S T-299t y p e;v i r u l e n c e g e n e;d r u g s e n s i t i v i t y副猪嗜血杆菌(H a e m o p h i l u s p a r a s u i s)是一种无鞭毛㊁无芽孢㊁具有荚膜的非溶血性兼性厌氧革兰阴性菌,分类学上属于巴斯德菌科嗜血杆菌属的一种g-变形杆菌[1]㊂随着生长周期变化,副猪嗜血杆菌菌体显微结构可呈现形态多样性,包括球状㊁短杆状㊁丝状㊂副猪嗜血杆菌生长需要营养物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e, N A D),在添加N A D及马血清的M96支原体培养基,添加N A D㊁马血清和酵母浸出物的胰蛋白胨大豆肉汤(T S B)培养基,以及添加N A D㊁马血清的脑心浸液肉汤培养基(B H I)上生长良好[2]㊂副猪嗜血杆菌有多种血清型,按K i e l e t e i n_R a p p-G a b-r i e l s o n (K R G)血清分型法[3],目前至少可分为15种血清型,另有20%以上的分离株无法分型㊂通过S P F猪接种证实,血清1㊁5㊁10㊁12㊁13和14型的菌株被认为是高毒力的菌株,可在感染后4d内导致猪死亡[4]㊂当猪感染副猪嗜血杆菌时会引发猪上呼吸道感染㊁多发性浆膜炎㊁脑膜炎和关节炎等症状,这些由副猪嗜血杆菌感染引发的症状被统称为副猪嗜血杆菌病,又称格拉泽氏病(G läs s e r s d i s e a s e)㊂副猪嗜血杆菌是一种典型的条件致病菌,在猪机体感染病毒(如猪圆环病毒㊁猪繁殖与呼吸综合征病毒)或应激导致猪机体免疫力下降时侵入猪机体而发病㊂副猪嗜血杆菌病在养殖业还不够发达时呈现散点暴发㊂随着规模化养殖业发展,抗生素滥用问题的出现,以及大规模病毒性传染病暴发流行,使得副猪嗜血杆菌造成的传染性疾病日趋严重,给养猪业造成重大经济损失[1]㊂2023年5月,湖北荆州某猪场仔猪暴发疑似副猪嗜血杆菌病㊂为了对该病原展开研究,本试验剖检患病仔猪进行病变器官观察,并对病原菌进行分离培养,进一步对分离所得的病原菌进行生物学特性㊁致病性及耐药性分析,并通过感染小鼠灌胃中药治疗,阐明中药对分离菌株的体内抑制效果,以期为日后副猪嗜血杆菌病的防治与诊疗提供参考依据㊂1材料与方法1.1材料1.1.1病料来源与试验动物仔猪来自湖北荆州某猪场,送检时猪高热,呼气沉吟,鼻扇㊁四肢及面部紫绀,关节肿胀,跛行㊂无菌采集病猪喉部㊁气管㊁鼻拭子㊁胸腔积液置于无菌磷酸缓冲盐溶液(p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e,P B S)中,将喉部㊁气管组织研磨破碎,并将以上溶液梯度稀释保存备用㊂40只4~6周龄㊁体重20~25g的S P F级昆明小鼠购自三峡大学,实验许可证号S Y X K(鄂)2022―0012,饲养环境为屏障环境㊂动物试验操作严格按照动物伦理与实验动物福利的要求进行,动物被安置在负压微型隔离围栏中,可以随意获取正常的食物㊂1.1.2 菌株及主要试剂金黄色葡萄球菌C V C C25923由河南科技学院预防兽医实验室馈27614期戴璐等:1株血清10型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性分析赠㊂B H I培养基㊁特级马血清㊁革兰染色剂和琼脂均购自北京索莱宝科技有限公司;N A D购自B i o f o x x公司;血平板购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司;D L2000D N A M a r k e r㊁琼脂糖均购自北京兰杰柯科技有限公司;T a q酶购自宝日医生物技术有限公司;细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成㊂副猪嗜血杆菌相关培养基参照M u l l i n s等[5]配制:B H I+5%特级马血清+20μg/m LN A D㊂1.1.3中药及配制枳壳㊁明雄黄㊁超僵蚕㊁款冬花㊁荆芥㊁石榴皮㊁全蝎㊁薄荷㊁五倍子㊁生地榆㊁蒲公英㊁秦皮㊁大叶青㊁黄芩㊁丁香㊁白术㊁五味子㊁鱼腥草㊁金银花㊁茯苓㊁羌活㊁乌梅㊁连翘㊁天竺黄㊁桑皮㊁板蓝根㊁熟大黄㊁白附子㊁独活㊁罗汉果㊁何首乌㊁川贝母㊁苏子㊁胖大海㊁桔梗㊁黄连㊁肉桂㊁草麻黄㊁半夏㊁槟榔㊁三七粉㊁朱砂等中药均购自同仁堂大药房㊂以上中药分别称取60g,将其充分研磨后置于60m L d d H2O中浸泡12h,大火煮沸后小火熬制2h,3层纱布滤过药液;将滤液浓缩至75m L,使药液终浓度为1g/m L,制备的中药液灭菌4ħ保存备用㊂1.2方法1.2.1病原菌的分离培养与P C R鉴定将梯度稀释的鼻拭子㊁胸腔积液㊁喉部与气管研磨液分别涂布于B H I固体培养基上,37ħ培养24~48h后观察,挑取疑似菌落接种于B H I液体培养基中,37ħ培养24h㊂按照细菌基因组提取试剂盒说明书提取细菌基因组D N A,―20ħ保存备用㊂利用副猪嗜血杆菌特异性引物[6]:v a n Y-F:5'-A T G T T A A A-T T T T G A A A A T T T A C C T T C T C T T C-3';v a n Y-R: 5'-G C T T G A C A T T T G T C C C A A T C A-3',对提取的细菌基因组进行P C R鉴定㊂P C R反应体系20μL: D N A1μL,2ˑP C R M i x10μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各1μL,d d H2O7μL㊂P C R反应条件:94ħ预变性5m i n;94ħ变性30s,58ħ退火30s,72ħ延伸1m i n,共40个循环;72ħ延伸10m i n㊂取5μLP C R扩增产物使用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测㊂1.2.2生化鉴定将临床分离菌株接种于B H I 液体培养基中,37ħ培养24h㊂将培养后的菌液接种于麦芽糖㊁蔗糖㊁葡萄糖㊁半乳糖㊁果糖㊁甘露糖㊁脲酶㊁接触酶㊁血清菊糖㊁氧化酶㊁靛基质试验(吲哚)等微量生化鉴定管,培养24h后根据说明书对试验结果进行判定,并依据‘伯杰氏细菌鉴定手册“进行最终结果判定[7]㊂1.2.3 N A D依赖试验用接种环蘸取分离菌株培养菌液,在绵羊血平板上平行划线;用接种环蘸取对数生长期的金黄色葡萄球菌C V C C25923,垂直于平行线划线;将平板置于37ħ培养48h,观察平板是否有卫星现象[8]㊂将临床分离菌株培养菌液按照1ʒ100的比例接种于B H I㊁含有马血清的B H I㊁含有马血清和N A D的B H I培养基中,37ħ培养24h,观察菌液浑浊情况㊂1.2.4形态观察将临床分离菌株接种于B H I 液体培养基中,对临床分离菌株进行革兰染色与镜检㊂将临床分离菌株培养菌液用2.5%戊二醛固定过夜,离心去上清,d d H2O重悬,重复洗涤2次,将洗涤后的菌液悬滴于载物台上,对临床分离菌株进行扫描电镜观察㊂1.2.5分离菌株16Sr R N A基因序列分析采用细菌16Sr R N A通用引物[9]:27F:5'-A G A G T T-T G A T C C T G G C T C A G-3';1492R:5'-T A C G C T A C-C T T G T T A C G A C T T-3',对提取的细菌基因组进行P C R扩增㊂P C R反应体系及程序同1.2.1,退火温度为55ħ㊂P C R产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,测序结果通过B L A S T在线分析工具与G e n B a n k中副猪嗜血杆菌参考菌株进行相似性比对,参考菌株信息见表1,并用M e g a-X工具进行遗传距离比对及系统进化树构建㊂表1参考菌株信息T a b l e1R e f e r e n c e s t r a i n i n f o r m a t i o n毒株S t r a i n sG e n B a n k登录号G e n B a n ka c c e s s i o nN o.分离年份Y e a r分离地L o c a t i o mC N6-1E F396298.12007西班牙H S83F J667949.12009中国V C8-3G U226385.12009西班牙G P S2E F396257.12007美国3761中国畜牧兽医51卷续表毒株S t r a i n sG e n B a n k登录号G e n B a n ka c c e s s i o nN o.分离年份Y e a r分离地L o c a t i o mD Y J20160901MN148698.12019中国V B5-5D Q228988.12005西班牙N D14-1G U226349.12009西班牙H S1079F J667960.12009中国B C T-30MK404309.12019中国V C3-1G U226366.12009西班牙1.2.6管家基因多序列位点(M L S T)分析根据M u l l i n s等[5]报道的7个副猪嗜血杆菌管家基因a t p D㊁i n f B㊁m d h㊁r p o B㊁6p g d㊁g3p d和f r d B的引物,对临床分离菌株基因组D N A进行P C R扩增, P C R反应体系及程序同1.2.1,退火温度为56ħ㊂P C R产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序,将测序结果上传至P u b M L S T获取管家基因编号,从而确定分离菌株的S T分型;采用G r a p eT r e e分组聚类分析分离菌株S T分型与参考菌株的进化关系㊂1.2.7生长曲线测定将临床分离菌株接种于B H I液体培养基中,37ħ培养12h;将培养后的菌液按照1ʒ100接种于B H I液体培养基中,37ħ培养13h,每隔1h测定菌液的D600n m值,取200μL 菌液梯度稀释后涂布于B H I固体培养基进行菌落计数,根据菌落数和D600n m值绘制生长曲线[10]㊂1.2.8血清型鉴定参照H o w e l l等[11]血清型鉴定引物对临床分离菌株进行血清型P C R鉴定,不同血清型及对应基因见表2㊂P C R反应体系及程序同1.2.1,其中退火温度为58ħ,循环数为35个㊂P C R产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测㊂表2不同血清型及对应基因T a b l e2D i f f e r e n t s e r o t y p e s a n d c o r r e s p o n d i n g g e n e s血清型S e r o t y p e s基因G e n e s血清型S e r o t y p e s基因G e n e s 1f u n B8s c d A 2w z x9f u n V 3g l y C10f u n X 4w c i P11a m t A 5㊁12w c w K13g l t P 6g l t I14f u n A B 7f u n Q15f u n I1.2.9耐药基因检测共筛选七大类共20种耐药基因,包括β-内酰胺类耐药基因b l a I M P㊁b l a T E M㊁b l a S H V㊁b l a C T X㊁b l a O X A㊁b l a D H A㊁β-K P C和β-HDM;红霉素类耐药基因e r m(F)和e r e(D);四环素类耐药基因t e t A㊁t e t C和t e t M;氟喹诺酮类耐药基因g y r A 和g y r B;磺胺类耐药基因s u l1和s u l2;氨基糖苷类耐药基因a a d A1和a a d B;林可霉素类耐药基因l n u H㊂参考文献[12-13]引物通过P C R鉴定分离株是否含有耐药基因㊂P C R反应体系及程序同1.2.1,其中退火温度为58ħ,循环数为35个㊂P C R产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测㊂1.2.10抗生素药敏试验吸取200μL临床分离菌株培养菌液均匀涂布于B H I固体培养基上,采用K i r b-B a u e r(K B)圆盘扩散法,选取32种抗生素药物纸片贴在培养基上,37ħ培养24h㊂1.2.11中药体外抑菌试验吸取200μL临床分离菌株培养菌液均匀涂布于B H I固体培养基上,把牛津杯均匀置于涂布后的平板上,在杯中加入1g/m L中药提取液,并在另一个杯中加入P B S作为空白对照,37ħ培养24h,观察中药对临床分离菌株的抑菌情况㊂1.2.12毒力基因检测参照文献[14-16]引物对临床分离菌株进行毒力基因P C R鉴定,P C R反应体系及程序同1.2.1,其中退火温度为58ħ,循环数为3547614期戴璐等:1株血清10型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性分析个㊂P C R 产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测㊂1.2.13 生物被膜形成能力参考静态培养生物被膜方法[17-18],将临床分离菌株按照1ʒ100接种于含4m LB H I 液体培养基的12孔板中,共计6板,37ħ分别静置培养12㊁24㊁36㊁48㊁60㊁72h ,以B H I液体培养基为空白对照;去除12孔板中培养基,用甲醇溶液固定30m i n ,P B S 洗涤3次;加入1m L 结晶紫,孵育30m i n ,P B S 洗涤2次;自然风干后加入1m L 乙醇脱色,酶标仪测定D 570n m 值㊂以空白对照组测得的D 570n m 值作为生物被膜形成能力的临界点D C [19]㊂当细菌D 570n m 值ɤD C 时,无生物被膜形成能力;当D C <细菌D 570n m 值ɤ2D C 时,生物被膜形成能力较弱;当细菌D 570n m 值ȡ2D C 时,生物被膜形成能力强㊂1.2.14 分离菌株致病性将20只昆明雌鼠均分为4组,分别为3.0ˑ1010㊁3.0ˑ109㊁3.0ˑ108C F U 感染组和空白对照组(P B S ),腹腔注射相对应浓度的分离株,每隔1h 观察并记录每组小鼠的临床症状,统计小鼠死亡情况,并根据寇氏法计算半数致死浓度(L D 50)㊂无菌采集3.0ˑ1010C F U 感染组与空白对照组小鼠的脑㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏和肝脏,记录各个器官病变情况并称重㊂各组织经P B S 研磨稀释后涂布于B H I 固体培养基平板上,统计活菌数,计算每个脏器的载菌量㊂使用4%多聚甲醛固定脏器,制成石蜡切片,并分析组织病变情况㊂1.2.15 中药治疗将20只昆明雌鼠均分为4组,每只小鼠注射5.06ˑ108C F U 的临床分离菌株培养菌液,建立感染模型,记录小鼠临床症状;感染5h 后,分别使用200μL 无菌P B S ㊁明雄黄㊁款冬花㊁全蝎对小鼠进行灌胃治疗,每隔1h 记录小鼠死亡情况与临床症状,4d 后无菌采集各组小鼠肺脏,统计各组肺脏的载菌量㊂2 结果2.1 病原分离培养剖检患病猪可见肺脏㊁肝脏有肿大且出血,脾脏有部分梗死,初步判断疑似副猪嗜血杆菌病㊂在光源下观察培养基上菌落形态,分离获得1株疑似副猪嗜血杆菌,于B H I 培养基划线培养后可见半透明㊁白色㊁圆形㊁边缘光滑的菌落(图1A )㊂分离菌株经v a n Y -F /R 引物P C R 扩增结果显示,条带大小约为302b p(图1B ),与副猪嗜血杆菌阳性对照扩增条带大小一致㊂M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1,阴性对照;2㊁3,v a n Y 基因P C R 扩增产物;4,阳性对照M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1,N e g a t i v e c o n t r o l ;2a n d3,P C Ra m p l i f i c a t i o n p r o d u c t s o f v a n Y g e n e ;4,P o s i t i v e c o n t r o l 图1 分离菌株形态观察(A )和v a n Y 基因P C R 鉴定结果(B )F i g .1 M o r p h o l o gi c a l o b s e r v a t i o n (A )a n dP C Ri d e n t i f i c a t i o n r e s u l t s o f v a n Y g e n e (B )o f t h e i s o l a t e 2.2 分离菌株的生化鉴定生化鉴定结果显示,分离菌株接触酶试验呈阳性,靛基质㊁脲酶㊁氧化酶试验呈阴性,不发酵甘露糖和麦芽糖,发酵蔗糖㊁半乳糖㊁葡萄糖㊁果糖和血清菊糖(表3)㊂5761中国畜牧兽医51卷表3分离菌株生化鉴定结果T a b l e3B i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n r e s u l t s o f t h e i s o l a t e 项目I t e m s结果R e s u l t s 接触酶C a t a l a s e+靛基质I n d o l e-脲酶U r e a s e-氧化酶O x i d a s e-甘露糖C a r u b i n o s e―麦芽糖M a l t o s e―蔗糖S u c r o s e+半乳糖G a l a c t o s e+葡萄糖G l u c o s e+果糖F r u c t o s e+血清菊糖S e r u mi n u l i n++,阳性;―,阴性+,P o s i t i v e;―,N e g a t i v e2.3N A D依赖试验卫星现象试验显示,分离菌株只生长于金黄色葡萄球菌菌苔附近,呈现典型的卫星菌落现象 ,且可观察到金黄色葡萄球菌菌苔周围有明显的β溶血环,分离菌株则无明显的溶血现象(图2)㊂在培养基中加入N A D时,分离菌株菌液在8h内浑浊;而培养基中未加入N A D时,分离菌株培养48h也未见浑浊㊂表明分离菌株对N A D有极高的依赖性㊂图2N A D依赖性试验F i g.2N A Dd e p e n d e n c y t e s t2.4分离菌株的形态观察在光学显微镜下观察发现,分离菌株革兰染色呈阴性杆菌,菌体形态呈短杆和长杆状(图3A),基本符合副猪嗜血杆菌的微观形态特征;在5000倍扫描电镜下观察可见,分离菌株菌体呈现细长的杆状,但未观察到光学显微镜下的短杆状形态(图3B)㊂图3分离菌株革兰染色(A,1000ˑ)及扫描电镜观察(B,5000ˑ)F i g.3G r a ms t a i n i n g(A,1000ˑ)a n d s c a n n i n g e l e c t r o nm i c r o s c o p y o b s e r v a t i o n(B,5000ˑ)o f t h e i s o l a t e2.516S r R N A基因鉴定使用M e g a-X工具计算分离菌株16Sr R N A基因序列与其他菌株的遗传距离,结果显示,本试验分离菌株与G e n B a n k中副猪嗜血杆菌参考菌株的相似性均较高,为96.0%以上(图4)㊂进一步构建16S r R N A基因系统进化树,结果显示,分离菌株与B C T-30株处于同一分支(图5)㊂证明分离菌株确为副猪嗜血杆菌,命名为H P-Q L0105㊂67614期戴璐等:1株血清10型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性分析图4 不同菌株16S r R N A 基因序列相似性分析F i g .4 S i m i l a r t i y a n a l y s i s o f 16S r R N A g e n e s e q u e n c e a m o n g di f f e r e n t s t r a i ns 图5 基于16S r R N A 基因序列构建系统进化树F i g .5 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e do n16S r R N A g e n e s e qu e n c e 2.6 管家基因M L S T 分析M L S T 比对结果显示,7个等位基因a t pD ㊁i n f B ㊁m d h ㊁r p o B ㊁6p g d ㊁g 3pd 和f r d B 的编号分别为4㊁15㊁17㊁17㊁15㊁3㊁5,显示H P -Q L 0105株S T 型为299,而P u b M L S T 数据库显示,S T 型为299的副猪嗜血杆菌于2018年从健康猪鼻腔中首次分离㊂G r a peT r e e 分组聚类分析显示,S T 型为299的副猪嗜血杆菌与S T 型为246的副猪嗜血杆菌聚为一支,二者之间有较近的亲缘关系(图6)㊂2.7 分离菌株生长曲线测定根据D 600n m 值和活菌数绘制生长曲线,结果显示,H P -Q L 0105株在7h 后进入平台期(图7A ),活菌数可达1.51ˑ109C F U /m L (图7B )㊂图6 分离菌株M L S T 分析F i g .6 M L S Ta n a l ys i s o f t h e i s o l a t e 2.8 分离菌株血清型鉴定H P -Q L 0105株血清型R C R 鉴定结果显示,fu n X 基因在约790b p 处有一条明亮的扩增条带(图8),与血清10型副猪嗜血杆菌相符,确定H P -Q L 0105株为血清10型副猪嗜血杆菌㊂7761中国畜牧兽医51卷图7 分离菌株生长曲线F i g.7 G r o w t h c u r v e o f t h e i s o l a te M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1~14,分别为f u n B ㊁w z x ㊁g l y C ㊁w c i P ㊁w c w K ㊁g l t I ㊁f u n Q ㊁s c d A ㊁f u n V ㊁f u n X ㊁a m t A ㊁g l t P ㊁fu n A B 和fu n I 基因M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1-14,f u n B ,w z x ,g l y C ,w c i P ,w c w K ,g l t I ,f u n Q ,s c d A ,f u n V ,f u n X ,a m t A ,g l t P ,f u n A B a n d f u n I g e n e s ,r e s p e c t i v e l y图8 分离菌株血清型基因鉴定结果F i g .8 S e r o t y pe g e n e i d e n t if i c a t i o n r e s u l t s o f t h e i s o l a t e 2.9 分离菌株耐药基因检测通过对七大类共20种耐药基因进行分析,结果显示,H P -Q L 0105株仅含有b l a O X A 和g y r A 2种耐药基因(图9)㊂2.10 抗菌药物药敏试验以金黄色葡萄球菌(C V C C25923)为质控菌株,药敏试验结果显示,H P -Q L 0105株对氨苄西林㊁头孢曲松㊁头孢氨苄㊁头孢他啶㊁新霉素㊁麦迪霉素㊁米诺环素㊁氧氟沙星㊁克林霉素㊁呋喃唑酮等药物敏感,且对多种抗生素具有耐药性(表4)㊂87614期戴璐等:1株血清10型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性分析M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1~17,分别为b l a S H V 1㊁b l a T E M ㊁b l a O X A ㊁b l a I M P ㊁b l a D H A ㊁s u l 1㊁s u l 2㊁e r e (D )㊁e r m (F )㊁a a d A ㊁a a d B ㊁t e t A ㊁t e t B ㊁t e t C ㊁g y r A ㊁g yr B 及i n u (H )基因M ,D L 2000D N A M a r k e r ;1-17,b l a S H V 1,b l a T E M ,b l a O X A ,b l a I M P ,b l a D H A ,s u l 1,s u l 2,e r e (D ),e r m (F ),a a d A ,a a d B ,t e t A ,t e t B ,t e t C ,g y r A ,g yr B a n d i n u (H )g e n e s ,r e s p e c t i v e l y 图9 分离菌株部分耐药基因鉴定结果F i g .9 I d e n t i f i c a t i o no f p a r t i a l d r u g r e s i s t a n c e g e n e s o f t h e i s o l a t e 表4 分离菌株药敏试验结果T a b l e 4 D r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t r e s u l t s o f t h e i s o l a t e 抗菌药物A n t i b a c t e r i a l s 判定标准C r i t e r i o n 耐药R中介I敏感S抑菌圈直径I Z D /m m结果R e s u l t s β-内酰胺类β-l a c t a m s 青霉素P e n i c i l l i nɤ1314~16ȡ170R 苯唑西林O x a c i l l i nɤ1415~16ȡ170R 羧苄西林C a r b e n i c i l l i n ɤ1314~17ȡ180R 哌拉西林P i r a c i l l i n ɤ1718~20ȡ210R 阿莫西林A m o x i c i l l i n ɤ1314~16ȡ170R 氨苄西林A m p i c i l l i n ɤ1314~17ȡ1820S 头孢曲松C e f t r i a x o n e ɤ1415~17ȡ1828S 头孢氨苄C e p h a l e x i n ɤ1415~17ȡ1820S 头孢他啶C e f t a l i d i m e ɤ1415~17ȡ1825S 头孢拉定C e f a l a d i n e ɤ1516~17ȡ1817I 头孢哌C e f o p e r a z o n e ɤ1516~20ȡ210R 头孢呋辛C e f u r o x i m e ɤ1516~17ȡ180R 头孢唑林C e f a z o l i nɤ1415~17ȡ180R 头孢美唑C e f m e t a z o l e ɤ1516~20ȡ210R 大环内酯M a c r o l i d e s 红霉素E r y t h r o m y c i n ɤ1314~22ȡ230R 麦迪霉素M e d i m y c i n ɤ1314~17ȡ1820S 氨基糖苷类新霉素N e o m yc i n ɤ1617~23ȡ2418S A m i n o g l yc o s ide s 卡那霉素K a n a m y c i n ɤ1314~17ȡ180R 丁胺卡那B u m i k a n a ɤ1415~16ȡ170R 庆大霉素G e n t a m i c i nɤ1213~14ȡ150R 四环素类T e t r a c y c l i n e s 多西环素D o x y c y c l i n e ɤ1213~17ȡ180R 米诺环素M i n o c y c l i n e ɤ1213~17ȡ1825S 四环素T e t r a c yc l i n e ɤ1415~18ȡ1927R9761中国畜牧兽医51卷续表抗菌药物A n t i b a c t e r i a l s 判定标准C r i t e r i o n 耐药R中介I敏感S抑菌圈直径I Z D /m m结果R e s u l t s 喹诺酮类Q u i n o l o n e s环丙沙星C i p r o f l o x a c i n ɤ1516~20ȡ2114I 诺氟沙星N o r f l o x a c i n ɤ1213~16ȡ170R 氧氟沙星O f l o x a c i nɤ1213~16ȡ1719S 磺胺类S u l f o n a m i d e s 复方新诺明C o m p o u n d t r i m o x a z o l e ɤ1314~17ȡ180R 黏菌素类C o l i s t i n e s 多黏菌素BP o l y m y x i nB ɤ1314ȡ1512I 林可酰胺类I n c o s a m i d e s 克林霉素C l i n d a m y c i n ɤ1314~16ȡ1717S 利福霉素类R i f a m y c i n e s 利福平R i f a m pi c i n ɤ1213~17ȡ180R 硝基呋喃类N i t r o f u r a n e s呋喃唑酮(痢特灵)F u r a n a z o l i d o n e (d y s e n t e r i n e )ɤ1213~20ȡ2122S 糖肽类G l y c o p e pt i d e s 万古霉素V a n c o m yc i n ɤ1415~17ȡ1815IR ,耐药;I ,中介;S ,敏感R ,R e s i s t a n t ;I ,I n t e r m e d i a r y;S ,S e n s i t i v e 2.11 中药体外抑菌试验在42种中药中,H P -Q L 0105株对明雄黄㊁款冬花高度敏感,对全蝎中度敏感,对其余39种中药均不敏感(表5)㊂表5 中药的体外抑菌结果T a b l e 5 A n t i b a c t e r i a l r e s u l t s i n v i t r o o f t r a d i t i o n a l C h i n e s em e d i c i n e 名称N a m e 抑菌圈直径I Z D /m m 敏感性S e n s i t i v i t y名称N a m e 抑菌圈直径I Z D /m m敏感性S e n s i t i v i t y明雄黄R e a l ga r 21+++连翘F o r s y t h i a s u s p e n s a 0―款冬花T u s s i l a g o f a r f a r a 18+++天竺黄B a mb u s a t e x t i l i s 0―全蝎B u t h u sm a r t e n s i i 13++桑皮M u l b e r r y B a r k 0―枳壳C i t r u s a u r a n t i u m0―板蓝根I s a t i s t i n c t o r i a 0―超僵蚕B o m b y xm o r i L i n n a e u s 0―熟大黄R h e u m p a l m a t u m 0―荆芥N e p e t a c a t a r i a 0―白附子S a u r o m a t u m g i g a n t e u m 0―石榴皮P o m e g r a n a t eR i n d 0―独活H e r a c l e u mh e m s l e y a n u m 0―薄荷M e n t h a c a n a d e n s i s 0―罗汉S i r a i t i a g r o s v e n o r i i 0―五倍子R h u s c h i n e n s i s0―何首乌P l e u r o p t e r u s m u l t i f l o r u s 0―生地榆S a n g u i s o r b a o f f i c i n a l i s 0―川贝母F r i t i l l a r i a c i r r h o s a 0―蒲公英T a r a x a c u mm o n g o l i c u m 0―苏子P e r i l l a f r u t e s c e n s 0―秦皮F r a x i n u s c h i n e n s i s 0―胖大海S c a p h i u mw a l l i c h i i 0―大叶青G e u ma l e p p i c u m 0―桔梗P l a t y c o d o n g r a n d i f l o r u s 0―黄芩S c u t e l l a r i a b a i c a l e n s i s 0―黄连C o p t i s c h i n e n s i s 0―丁香E u g e n i a c a r y o p h y l l a t a 0―肉桂C i n n a m o m u mc a s s i a 0―白术A t r a c t y l o d e sm a c r o c e p h a l a 0―草麻黄E p h e d r a s i n i c a 0―五味子C h i s a n d r a c h i n e n s i s 0―半夏P i n e l l i a t e r n a t a 0―鱼腥草H o u t t u y n i a c o r d a t a 0―槟榔A r e c a c a t e c h u 0―茯苓P o r i a c o c o s0―三七粉P a n a x n o t o g i n s e n g 0―羌活H a n s e n i aw e b e r b a u e r i a n a 0―朱砂C i n n a b a r0―乌梅P r u n u sm u m e―金银花L o n i c e r a j a po n i c a 0―+++,高度敏感(抑菌圈直径>15m m );++,中度敏感(抑菌圈直径为10~15m m );―,耐药(无抑菌圈)+++,H i g h l y se n s i t i v e (I Z D>15m m );++,M e d i u ms e n s i t i v e (I Z Di s 10-15m m );―,R e s i s t a n c e (n o i n h i b i t i o n z o n e )08614期戴璐等:1株血清10型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性分析2.12分离菌株毒力基因H P-Q L0105株拥有C a p D㊁v t a1㊁v t a2㊁v t a3㊁D15㊁n a n H㊁o m p P2㊁o m p P5㊁O P P A㊁w z a㊁a f u A㊁c d t A㊁c d t B㊁c d t C㊁e s p P2共15种毒力基因(图10),表明H P-Q L0105株为毒力较强的副猪嗜血杆菌㊂M,D L2000D N A M a r k e r;1~20,分别为l s g B㊁C a p D㊁v t a1㊁v t a2㊁v t a3㊁D15㊁n a n H㊁h h d A㊁h h d B㊁O P P A㊁o m p P2㊁w z a㊁a f u A㊁t b p B㊁c d t A㊁c d t B㊁c d t C㊁o m p P5㊁H x u B和e s p P2基因M,D L2000D N A M a r k e r;1-20,l s g B,C a p D,v t a1,v t a2,v t a3,D15,n a n H,h h d A,h h d B,O P P A,o m p P2,w z a,a f u A,t b p B,c d t A, c d t B,c d t C,o m p P5,H x u B a n d e s p P2g e n e s,r e s p e c t i v e l y图10副猪嗜血杆菌毒力基因P C R扩增结果F i g.10P C Ra m p l i f i c a t i o n r e s u l t s o fH P S v i r u l e n c e g e n e s2.13生物被膜形成能力H P-Q L0105株生物被膜在培养48h时D570n m值为0.41,而空白对照组D570n m值为0.24,H P-Q L0105株被判定为生物被膜形成能力较弱㊂在48h时,H P-Q L0105株生物被膜生成达到顶峰(图11A)㊂A,分离菌株生物被膜生成能力;B,小鼠生存曲线;C,感染小鼠脏器载菌量;D,分离菌株感染小鼠的病理组织学观察,箭头表示各组织病理变化(H E,200ˑ)A,B i o f i l mf o r m a t i o na b i l i t y o f i s o l a t e;B,S u r v i v a l c u r v e o fm i c e;C,B a c t e r i a l l o a d i n t h eo r g a n so f i n f e c t e dm i c e;D,O b s e r v a t i o n o f p a t h o l o g i c a l h i s t o l o g y o fm i c e i n f e c t e db y t h e i s o l a t e d s t r a i n,t h e a r r o w s i n d i c a t e p a t h o l o g i c a l c h a n g e s i n e a c h t i s s u e(H E,200ˑ)图11分离菌株致病性F i g.11P a t h o g e n i c i t y o f t h e i s o l a t e1861中国畜牧兽医51卷2.14 分离株致病性2.14.1 L D 50 由图11B 可知,攻毒8h 后,接种最高剂量3.0ˑ1010C F U 菌液组小鼠全部死亡;攻毒11h 后,3.0ˑ109和3.0ˑ108C F U 感染组小鼠活动性降低㊁厌食㊁呼吸急促㊁被毛凌乱无光泽,眼周分泌物增多,但未发生死亡;攻毒17h 后,3.0ˑ109C F U 感染组小鼠死亡率达到80%;攻毒24h后,3.0ˑ108C F U 感染组小鼠死亡率达到20%,攻毒54h 后,小鼠死亡率达40%;而每组幸存的小鼠在48h 后精神恢复,4d 后恢复进食㊂统计小鼠死亡情况,L D 50为5.06ˑ108C F U ㊂2.14.2 分离菌株组织嗜性与载菌量将3.0ˑ1010C F U 感染组和对照组小鼠解剖对比后可见,小鼠肺脏㊁肾脏均出血严重,肝脏出血肿大且有结节,脾脏发黑,脑部充血㊂由图11C 可知,感染组小鼠肝脏㊁肺脏㊁脑㊁肾脏㊁脾脏都有一定的载菌量,其中脾脏载菌量最大,在脑部发现H P -Q L 0105株,证明其可以突破小鼠血脑屏障感染大脑㊂2.14.3 病理组织学观察由图11D 可知,感染组小鼠肺泡细胞肿大,肺组织血管可见淤血;肝脏细胞排列紊乱,核质比异常,细胞坏死,核碎裂;脾组织出现空泡,核碎裂,红髓白髓界限模糊;肾单位结构模糊,组织可见大量异型,肾小球细胞核质比异常,且细胞肿大;脑部血管可见淤血㊂2.15 中药治疗由图12A 可知,各分组小鼠在感染分离菌株5h 后出现活动性降低㊁厌食㊁呼吸急促㊁被毛凌乱无光泽,眼周分泌物增多等临床症状;P B S 对照组小鼠在感染分离株12㊁24h 分别死亡1只,共计死亡2只;款冬花治疗组小鼠在感染分离株36㊁48h分别死亡1只,共计死亡2只;而明雄黄㊁全蝎治疗组未出现小鼠死亡,小鼠感染分离株24h 后呼吸急促症状有所缓解,60h 后所有症状有所缓解,并开始进食;72h 后各组幸存小鼠所有症状缓解,并开始进食㊂统计各个组小鼠载菌量发现,由图12B 可知,与P B S 对照组相比,明雄黄和全蝎治疗组小鼠肺脏载菌量均显著降低(P <0.05),款冬花治疗组小鼠肺脏载菌量无显著变化(P >0.05),证明中药明雄黄与全蝎对H P -Q L 0105株有一定的体内抑制效果㊂①A ,药物治疗效果生存曲线;B ,药物治疗后小鼠肺脏载菌量㊂②肩标不同字母表示差异显著(P <0.05);肩标相同字母表示差异不显著(P >0.05)①A ,S u r v i v a l c u r v e o f d r u g t r e a t m e n t e f f e c t ;B ,B a c t e r i a l l o a d o f l u n g i nm i c e a f t e r d r u gt r e a t m e n t .②V a l u e sw i t h d i f f e r e n t l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P <0.05);W h i l ew i t h t h e s a m e l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a nn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e (P >0.05)图12 小鼠感染H P -Q L 0105株后药物治疗效果F i g .12 E f f e c t o f d r u g t r e a t m e n t o nm i c e i n f e c t e dw i t hH P -QL 01053 讨论副猪嗜血杆菌是广泛存在于宿主上呼吸道的条件致病菌,感染可诱发宿主呼吸道相关疾病㊁多发性浆膜炎㊁多关节炎,并能突破血脑屏障导致纤维蛋白28614期戴璐等:1株血清10型副猪嗜血杆菌的分离鉴定与生物学特性分析性脑膜炎[11]㊂随着规模化养殖业的发展,副猪嗜血杆菌引起的传染性疾病日渐流行㊂随着抗生素的滥用,使得副猪嗜血杆菌耐药性增强,防治更加困难,给养猪业造成重大经济损失[1]㊂副猪嗜血杆菌血清型众多,传统琼脂扩散血清分型法可将副猪嗜血杆菌分为15种血清型㊂为了更加简便㊁准确地鉴定副猪嗜血杆菌的血清型, H o w e l l等[11]根据不同血清型菌株荚膜基因的差异设计出P C R血清分型法,与传统血清分型方法相比大大提高了效率与准确性㊂有致病性的副猪嗜血杆菌血清型一般为1㊁3㊁4㊁5㊁8㊁10㊁12㊁13㊁14与15型,其中中国流行的血清型为4㊁5和13型㊂本试验从病料中分离到1株副猪嗜血杆菌,通过P C R血清鉴定法鉴定发现,此分离株为1株血清10型的副猪嗜血杆菌,国内相关报道较少㊂病原菌为了增强对宿主的侵袭力,往往会表达一些毒力因子帮助其定植与侵入宿主㊁逃避宿主免疫反应,所以病原菌毒力基因越多往往致病性越强㊂据文献报道,C a p D㊁v t a1和v t a2等毒力基因主要存在于强毒株中[20-21]㊂本试验筛选的18种毒力基因均为副猪嗜血杆菌的关键致病因子㊂w s a与C a p D 能帮助副猪嗜血杆菌荚膜多糖合成与转运,从而提高其定植能力与逃逸宿主免疫防御能力[22]㊂v t a1㊁v t a2㊁v t a3具有结合真核细胞外基质蛋白的能力,与黏附宿主细胞和逃避宿主先天免疫系统有关[23-24]㊂细胞致死膨胀毒素(C D T)蛋白诱导宿主细胞凋亡,一般包括3个亚单位:C d t A㊁C d t B和C d t C[25],其中C d t B是活性毒性单位,C d t A是C D T蛋白靶细胞结合位点,C d t C是将C d t B转运至宿主细胞的转运蛋白[26]㊂O m p P2是副猪嗜血杆菌外膜中含量最多的蛋白,在细胞黏附中发挥重要作用[27]㊂本研究发现,分离菌株H P-Q L0105拥有较多的毒力基因,对小鼠有较强的致病性,表明此分离株为副猪嗜血杆菌强毒株㊂随着养猪业规模化发展,抗生素滥用等问题使得副猪嗜血杆菌耐药性愈发严重㊂Z h a o等[28]研究显示75%以上的H P S存在耐药性;杜娟等[29]对河南某地34株副猪嗜血杆菌耐药性研究发现, 88.24%~94.12%副猪嗜血杆菌分离株对阿莫西林㊁青霉素G㊁链霉素㊁土霉素4种抗生素耐药性, 8%~17%副猪嗜血杆菌分离株对头孢噻呋㊁林可霉素,血清13型副猪嗜血杆菌对头孢噻呋㊁环丙沙星耐药;董婉玉等[30]对2020―2021年分离自7个省的52株副猪嗜血杆菌进行耐药分析发现,88.31%分离株对β-内酰胺类㊁大环内酯类和磺胺类药物耐药㊂本试验发现,H P-Q L0105株对多种β-内酰胺类㊁大环内酯类和磺胺类药物耐药㊂副猪嗜血杆菌对抗生素的耐药性增强,使得对其防治愈加困难㊂近几年中药治疗逐渐被应用于动物疾病防治中㊂研究表明,中药治疗能很大程度地避免细菌产生耐药性,其治疗细菌性疾病的潜力有待进一步发掘[31]㊂全蝎是由钳蝎科动物钳蝎冷冻干燥所得的全虫,是一种传统中药,有较高的药用价值,其提取物已广泛运用于临床,如刘华清[32]从全蝎中分离到一种具有较强广谱抑菌能力的化合物,能够抑制枯草芽孢杆菌㊁金黄色葡萄球菌㊁绿脓杆菌的生长㊂明雄黄为硫化物类矿物,主含A s2S2,具有广泛的抗菌谱,对金黄色葡萄球菌㊁链球菌㊁白色链珠菌㊁痢疾杆菌㊁结核杆菌等有较强的抗菌作用[33]㊂本研究使用中药对感染小鼠进行治疗,发现明雄黄和全蝎对感染分离株H P-Q L0105的小鼠有明显治疗效果㊂但中药治疗副猪嗜血杆菌感染的研究较为匮乏,本试验结果可为后续采用中药治疗副猪嗜血杆菌病提供参考㊂4结论本试验分离到1株血清10型副猪嗜血杆菌,具有多重耐药性,携带耐药基因b l a O X A和g y r A,含有15种毒力基因,且具有较强的组织嗜性和较强致病性;中药明雄黄和全蝎对分离菌株感染小鼠有明显治疗效果㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] B R O C KM E I E RSL,R E G I S T E R K B,K U E HNJS,e t a l.V i r u l e n c ea n dd r af tg e n o m es e q u e n c eo v e r v i e wo f m u l t i p l e s t r a i n s o f t h e s w i n e p a t h o g e nH a e m o p h i l u s p a r a s u i s[J].P L o S O n e,2014,9(8):e103787.[2] G U W,C H E N S W,C H E N G P,e t a l.E n h a n c e m e n to f H a e m o p h i l u s p a r a s u i s s e r o v a r5y i e l d sb y m e d i u mo p t i m i z a t i o n[J].L e t t e r si n A p p l i e d M i c r o b i o l o g y,2015,61(1):44-49.[3] R A F I E E M,B L A C K A L LPJ.E s t a b l i s h m e n t,v a l i d a t i o na n d u s e o f t h e K i e l s t e i n-R a p p-G ab r i e l s o n s e r o t y p i n gs c h e m e f o r H a e m o p h i l u s p a r a s u i s[J].A u s t r a l i a nV e t e r i n a r y J o u r n a l,2000,78(3):172-174. 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６
动物医学进展
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第３卷ｌ
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苏、南和广西等地许多猪场不断有Ｈｐ感染的报湖ｓ道［］３。Ｈｐ。ｓ已成为猪呼吸道疾病综合征（ＲＣ）ＰＤ的重要病原之一，引起了人们的广泛关注。Ｈｐ并ｓ血清型复杂多样，据其荚膜抗原结构的不同至少根
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收稿日期：０００ — ２２１－４１基金项目：西回国基金项目（科回０３０４广桂７１１）
作者简介：刘翠权（９８）男，南汉寿人，广研究员，士，要从事动物疫病预防控制工作。１６一，湖推硕主
份和不同地区所分离菌株表现出多样性的优势血清型。本研究在对广西规模猪场ＰＤＲＣ病原学调查
氧化酶试验和接触酶试验，说明书方法操作并观按察结果。１２３药敏试验．．挑取纯培养菌落制成悬液，均匀地涂布于ＴＡ培养基上一Ｓ，将各种药敏纸片分别平贴于培养基表面，布均匀，３分置７℃ 培养箱中培养２后，４ｈ观察测定抑菌环的大小。判定标准：菌圈抑
ＡＬＪｆｏｌｙｒｕｐｃｅｔＶ— ｒｍａｅｓｓｓｅｔｄｗｉｈＡＬＶｓｉｆｃｉｎｉａｍｆＨｏｇｎｒｖｎｅｉｉａＭｏｅｖｒｎｅｔｏｎａｆｒｏｅｎｊｇｐｏｉｃｎＣｈｎ．ｒｏｅ，ｌｉａ
动物医学进展，００３（１：－２１，１１）５９
ＰｒｇｒｓｎＶｅｅｉａｙＭｅｃｎｏｅｓｉｔｒｎｒｄｉｉｅ
副猪嗜血杆菌的分离鉴定
刘翠权，梁媛。陈义祥。刘棋。陆承平，，，
可以分成１５个血清型，外，有１～４的另还５１
后，挑取单个菌落，接种于ＴＡ培养基上进行纯再Ｓ培养。
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（．京农业大学动物医学院，１南江苏南京２０９；．西水产畜牧兽医局，西南宁５０２；１０５２广广３０２３广西动物疫病预防控制中心，．广西南宁５００）３０１
摘要：副猪嗜血杆菌（ｓ为猪呼吸道疾病综合征（Ｒ）重要病原之一。在对广西６Ｈｐ）ＰＤＣ的５个猪场
ＡｂｔａｔＴｏｆｎｄＯＵｈｕｒｎｔｐｒｖｌｎｔＡＬＶｔａｎｉａｒｎｔｏｅｕｌｒｃａａｔｒｓｉｓ，ｔａｎｏｓｒｃ：ｉｔｔｅｃｒｅｅａｅｓｒｉｎｌｙｅｓａｄｉｓｍｌｃａｈｒｃｅｉｔ．１文献标识码：Ａ
文章编号：０７５３（００１－０５０１０ — ０８２１）１００－５
副猪嗜血杆菌（ｅｐｉｕａａｕｓＨａｍｏｈｌｓｐｒｓｉ，Ｈｐ）ｓ
酶、芽糖、麦果糖、蔗糖、萄糖、乳糖、）露醇、葡半Ｉ－甘Ｉ＿糖山梨醇、）核海藻糖等微型生化鉴定管，同时进行
Ｈｐ分离株不能用该法进行分型［。在１ｓ８］５个血清型中，１５１、２１以、、Ｏ１、３型和１４型毒力最强。根据李鹏等［对我国东南部地区１ｌ株Ｈｐ９１ｓ的ＥＣＲＩ－ＰＲ指纹图谱分析显示，有２种图谱，不同年Ｃ共３且
１份（．１）测样品为Ｈｐ１３９检ｓ阳性，均为混合感染；南宁市四塘、林市永福、林市容县和钦州市浦且从桂玉北分离出５Ｈｐ，离茵株的生化鉴定结果均符合Ｈｐ生化特性，对头孢噻呋和头孢菌素高度敏感；株ｓ分ｓ且其
ｓｍｐｏｎｈｓｏｔｏｌｉａｏｅｖｔｏｙｔｍｓａｄｉｔｐａｈｏｇｃｌｂｓｒａｉｎ，ＰＣＲｍｐｌｃｔｏｎｉａｉａｉｎａｄｍｍｕｎｆｕｏｅｅｎｃｓａｐｅｉｌｔｏｌｒｓｅｅａｓｙｓｃａＯ
的基础上，Ｈｐ进行了分离培养、化特性、敏对ｓ生药
ｉｅｗｅｎｔｅｇ８ｅｅｆＨＬ０ＭＤＪ１ａｄＨＰ－０．Ｉｏｃｕｉｎ。ｔｅＨＬ０ＭＤＪ１ｓｒｉｓｌ— ｔｂｔｅｈｐ５ｇｎｓｏＪ９ｙ～ｎＲＳ１３ｎｃｎｌｓｏｈＪ９一ｔａｎｉｏａ
２１８份病猪组织样品进行ＰＤＲＣ病原学调查的基础上，ＰＲ检测的Ｈｐ对Ｃｓ阳性样品进行了细菌分离，进并
行了生化特性、药敏试验、６ＳＲＮＡ基因片段序列分析和基因组Ｄ１ＮＡ的ＰＲ指纹图谱分析。结果显示，Ｃ
（ｖｓｎｏｉｎＩｆｃｉｕｓａｅ，ＳａｅｙＬｂｒｔｒｆＶｔｒｎｒｏｅｈｏｏｙ，ＨａｂｎＶｔｒａｙＤｉｉｉｆＡｖａｎｅｔｓＤｉｓｓｔｔＫｅａｏａｏｙｏｅｅｉａｙＢｉｔｎｌｇｏｏｅｃｒｉｅｉｒｅｎＲｅｅｒｈＩｓｉｔｆＣｔｅｅＡｃｄｍｙｏｓａｃｎｔｕｅｏｈｎｓｔａｅｆＡｇｉｕｔｒｌｃｎｅ，ＨａｂｎＨｅｌｎｊａｇ，５０１ＣｉａｒｃｌｕａｉｃｓＳｅｒｉ，ｉｇｎ１００，ｈｎ）ｏｉ
ｔｄｆｏｅｇｔｐｈｃｅｓｍａｏｔｉｕｅｔｈｅｅｒｈｓｏｈｈｎｅｆＡＬＪｈｓａｇｎａｈｅｒｍｇ —ｙｅｃｉｋｎｙｃｎｒｂｔｏｔｅｒｓａｃｅｎｔｅｃａｇｓｏＶ— ｏｔｒｎｅａｄｐｔ —
体混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失。在我国，由于规模化养殖和饲养的高度密集化，饲养而管理水平和疫病防控能力没有得到相应的提高等原因，使得该病日趋流行，浙江、海、如上江西、新疆、江
引起猪的副猪嗜血杆菌病，以多发性浆膜炎、节关炎、呼吸困难、热及高死亡率为特征。近年来，高Ｈｐ感染发病率呈上升趋势，常与其他猪的病原ｓ并
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