肝脏蛋白的提取和浓度测定.2013
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以标准液的蛋白质浓度为横坐标，吸光度值
为纵坐标绘制标准曲线。
A（吸光度）OD
Ax百度文库
cx
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/mL
16 C（蛋白浓度）
实验内容
◆肾脏蛋白的提取 ◆蛋白的浓度测定
认真操作--仔细观察--用心分析--完成报告
18
1.肝脏组织的提取
组织取材 超声匀浆
操作 步骤
冰上放置 4度离心 吸取上清
1.肝脏组织的提取 （1）组织取材：
取约100mg大鼠 肝脏组织，用灭菌 的剪刀将组织块尽 量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中
1.肝脏组织的提取 （2）超声匀浆：
加0.5mlRIPA裂解 液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀 浆器进行匀浆,超声 每次10秒，重复3次
肝脏蛋白的提取 和浓度测定
医学基础实验室
了解并掌握 蛋白质的提 取方法
了解掌握考 马斯亮蓝法 （Braford法） 测定蛋白质 含量的原理 和方法
实验目的
实验内容
◆肝脏组织蛋白 的提取 ◆蛋白的浓度测 定
1.肝脏组织的提取
原理：
RIPA裂解液是一种传统的细胞组 织快速裂解液，主要裂解成分含1% Triton X-100, 0.5% 胆氧胆酸钠 （sodium deoxycholate）, 0.1% SDS， 得到的蛋白样品可以用于常规的 Western。
1mg/mL牛血清 白蛋白溶液
蒸馏水 待测样品 考马斯亮蓝 G250
0 1.0 – 5
0.2 0.8 – 5
0.4 0.6 – 5
0.6 0.4 – 5
0.8 0.2 – 5
1.0 0 – 5
0 0 1 5
2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管
调零，测定各管吸光度值。
15
绘制标准曲线：
1.肝脏组织的提取 （3）冰上放置：
裂解完全后，冰 上放置30分钟
1.肝脏组织的提取 （4）4度离心：
放入离心机中， 4℃ 12000rpm离心 5min
1.肝脏组织的提取 （5）吸取上清：
取上清分装于 0.2ml离心管中并置 于－20℃保存，待 用
超声匀浆 要保持低温
注意 事项
超声强度 以不产生泡沫 为准
结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰
在 465nm ，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大 吸收峰改变为 595nm。在 595nm下，光密度与蛋白质
含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
实验步骤
1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:
试剂(ml)
空白管 管号 0 1 标准管 2 3 4 5 测定管 6
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法
BCA法
紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年 由 Bradford 建 立 的 考 马 斯 亮 兰 法 （ Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。 考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种
为纵坐标绘制标准曲线。
A（吸光度）OD
Ax百度文库
cx
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/mL
16 C（蛋白浓度）
实验内容
◆肾脏蛋白的提取 ◆蛋白的浓度测定
认真操作--仔细观察--用心分析--完成报告
18
1.肝脏组织的提取
组织取材 超声匀浆
操作 步骤
冰上放置 4度离心 吸取上清
1.肝脏组织的提取 （1）组织取材：
取约100mg大鼠 肝脏组织，用灭菌 的剪刀将组织块尽 量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中
1.肝脏组织的提取 （2）超声匀浆：
加0.5mlRIPA裂解 液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀 浆器进行匀浆,超声 每次10秒，重复3次
肝脏蛋白的提取 和浓度测定
医学基础实验室
了解并掌握 蛋白质的提 取方法
了解掌握考 马斯亮蓝法 （Braford法） 测定蛋白质 含量的原理 和方法
实验目的
实验内容
◆肝脏组织蛋白 的提取 ◆蛋白的浓度测 定
1.肝脏组织的提取
原理：
RIPA裂解液是一种传统的细胞组 织快速裂解液，主要裂解成分含1% Triton X-100, 0.5% 胆氧胆酸钠 （sodium deoxycholate）, 0.1% SDS， 得到的蛋白样品可以用于常规的 Western。
1mg/mL牛血清 白蛋白溶液
蒸馏水 待测样品 考马斯亮蓝 G250
0 1.0 – 5
0.2 0.8 – 5
0.4 0.6 – 5
0.6 0.4 – 5
0.8 0.2 – 5
1.0 0 – 5
0 0 1 5
2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管
调零，测定各管吸光度值。
15
绘制标准曲线：
1.肝脏组织的提取 （3）冰上放置：
裂解完全后，冰 上放置30分钟
1.肝脏组织的提取 （4）4度离心：
放入离心机中， 4℃ 12000rpm离心 5min
1.肝脏组织的提取 （5）吸取上清：
取上清分装于 0.2ml离心管中并置 于－20℃保存，待 用
超声匀浆 要保持低温
注意 事项
超声强度 以不产生泡沫 为准
结合具有高敏感性，考马斯亮兰G-250的最大光吸收峰
在 465nm ，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大 吸收峰改变为 595nm。在 595nm下，光密度与蛋白质
含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
实验步骤
1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:
试剂(ml)
空白管 管号 0 1 标准管 2 3 4 5 测定管 6
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法
BCA法
紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年 由 Bradford 建 立 的 考 马 斯 亮 兰 法 （ Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。 考马斯亮兰能与蛋白质的疏水微区相结合，这种