从动物肝组织中分离、提取、纯化及鉴定一种酶
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过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
从动物肝组织中分离、提取、纯化和 鉴定一种酶
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
从动物肝组织中分离、提取、纯化和 鉴定一种酶
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶
2.浓缩： 2.浓缩： 浓缩
从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓 度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、 度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、过滤 与膜分离、沉淀分离、 与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作 用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、 用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶 等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下， 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下，使酶液在 60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来， 60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来， 以下汽化蒸发 在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、 在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压 增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。 力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。
10级七年二班 10级七年二班 第五组
材料的选择
因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂 核酸的物质，所以取饥饿24 24小时 质、核酸的物质，所以取饥饿24小时 的动物肝脏为实验材料。 的动物肝脏为实验材料。
1. 细胞破碎
材料的预处理
机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 捣碎法 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用 大块的组织或者细胞团 组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 研磨法常用于微生物 植物组织细胞的破碎故 微生物和 研磨法常用于微生物和植物组织细胞的破碎故 本实验不采用。 本实验不采用。 物理破碎法：冻融法、 物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均 可。 使用冻融法应注意不能 过高的温度下操作 不能在 的温度下操作， 使用冻融法应注意不能在过高的温度下操作， 以免引起酶的变性失活。 以免引起酶的变性失活。 在冷库中进行， 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行， 或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作， 或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作，如破碎 30～60 s，间歇1 min，如此反复进行。 30～ s，间歇1 min，如此反复进行。 化学破碎法：常用的化学试剂 化学试剂有 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机试剂 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）； ）；② （甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）；② 表面活性剂 Tween、特里顿（Triton） ）；③ （Tween、特里顿（Triton）等）；③ 螯合剂 EDTA：乙二胺四乙酸） 他们都可以增加细胞膜 （EDTA：乙二胺四乙酸）等。他们都可以增加细胞膜 的通透性，是酶容易释放。 的通透性，是酶容易释放。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。
从肝脏中分离纯化一种酶
四.酶的分离
1.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性 电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子 能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把 目的酶和杂蛋白分开。
实验步骤：装柱；平衡；上样；洗脱；收集
五.酶的纯化、精制
真空干燥 冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以 下，使之冻结成固态，然后在低温下抽真空， 使冰直接升华为气体，而得到干燥的酶制剂。 冷冻干燥得到的酶质量较高，结构保持完整， 活力损失少，但是成本较高。特别适用于对 热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。 实验步骤：先将酶在-80℃环境下预冻1到2 小时然后把样品置于冷冻干燥剂的干燥箱中， 开始冷冻干燥，时间一般为8到20小时。待冻 干物称酥块状或松散片状即可停止。
实验步骤
取家兔肝脏2g，在冰块中用剪刀剪碎，移 入插在冰块中的匀浆器中，加入生理盐水 10ml进行匀浆，再经32层纱布过滤，得到 匀浆液。
物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均可。使 用冻融法应注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的 变性失活。 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机试剂② 表面活 性剂③ 螯合剂等。他们都可以增加细胞膜的通透性，使 酶容易释放。
实验步骤：将盐析操作中的滤液置于烧杯中，一边搅拌，
一边利用ph计测量酸碱度，用盐酸调整ph至6.2.然后倒置离 心管中以6000r/min离心15min弃去上清液，得到目的酶蛋白。
2.离子交换柱层析法 酶提取液中含有目的酶以及其他杂质。可用柱层析法进 行进一步的分离。 将交换剂缓冲液的ph调节到目的酶的PL与杂质蛋白的PL 之间使其中一类蛋白吸附在交换剂或者虑过层析柱从而 达到分离的目的。
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从动物肝组织中分离、提取、纯化和 鉴定一种酶
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
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9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶
2.离子交换柱层析法 酶提取液中含有目的 酶以及其他杂质。可 用柱层析法进行进一 步的分离。 将交换剂缓冲液的ph 调节到目的酶的PL与 杂质蛋白的PL之间使 其中一类蛋白吸附在 交换剂或者虑过层析 柱从而达到分离的目 的。
五.酶的纯化、精制
1.结晶：
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，不仅 为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而 且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。通常 酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。常用方 法有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶 法、等电点结晶法 由于本实验目的产物为酶，故采用盐析结晶法。 原因：主要用于大分子如蛋白质、酶、多肽等的结 晶。特点：不耐热，对pH变化及有机溶剂十分敏感。 用中性盐作为沉淀剂，安全、操作简单。盐析结晶 法操作包括：加固体盐法；饱和盐溶液；透析扩散 法。 有机溶剂结晶法：针对小分子物质的结晶。 等电点结晶法：多用于一些两性物质。
冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下，
使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为 气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高， 结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。特别适用于 对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。
六.酶纯度的检验
对该酶进行SDSPAGE电泳，因本实 验目的酶含有三个 不同亚基，所以若 仅出现3条色带， 则说明酶的纯化成 功。
四.酶的分离
常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤 和膜分离法、萃取法等。 1.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性 电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子 能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把 目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的 pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多 的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不 理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
从动物肝脏组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶(由三个不同亚基组装成,为结合酶,等电点为6.2)的技术路线 p
• 防止蛋白酶的水解作用：预防的措施是加入 蛋白酶抑制剂。常用的丝氨酸蛋白酶抑制剂有 苯甲基磺酰氟（PMSF ）、二异丙基氟磷酸； 金属蛋白酶抑制剂有EDTA 和EGTA （乙二醇 四乙酸）
• 除核酸：除核酸的常用方法是沉淀法。
ppt课件
14
4.2.3酶的提取
• 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象： 大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶 的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现 象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而降低。
ppt课件
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4.2.4酶的分离
• 等电点沉淀法：已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用此种方法 进行分离。
• 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH 值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两 性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分 子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH ， 把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI 点附件一定范 围的pH 内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且 相当多的蛋白质的pI 点很靠近，所以该法的回收率和纯化 倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
ppt课件
17
4.3.6纯度的检验
• 酶纯度的检验：对该酶进行SDSPAGE 电泳，若仅出现3条色带， 则说明酶以纯化成功。
ppt课件
18
请老师和同学们批评指正！
ppt课件
19
7
4.1.2核酸的分离纯化——DNA
①先将饥饿数天的实验动物杀死以除去肝糖原； ②然后利用淀粉酶除去多糖； ③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取 液，以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成 DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之 与多糖分离； ④利用去污剂或氯仿-戊/辛醇或苯酚处理后除去蛋白 质； ⑤利用胰脏核糖核酸酶或钙盐或活性炭除去RNA。
• 除核酸：除核酸的常用方法是沉淀法。
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4.2.3酶的提取
• 盐溶液提取：适用于大多数酶。盐溶现象： 大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶 的溶解度随盐浓度的升高而增加。盐析现 象：在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解 度随盐浓度升高而降低。
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4.2.4酶的分离
• 等电点沉淀法：已知所需酶的pI=6.2，故适宜采用此种方法 进行分离。
• 等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH 值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两 性电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分 子能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH ， 把目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI 点附件一定范 围的pH 内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且 相当多的蛋白质的pI 点很靠近，所以该法的回收率和纯化 倍数都不理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
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4.3.6纯度的检验
• 酶纯度的检验：对该酶进行SDSPAGE 电泳，若仅出现3条色带， 则说明酶以纯化成功。
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请老师和同学们批评指正！
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4.1.2核酸的分离纯化——DNA
①先将饥饿数天的实验动物杀死以除去肝糖原； ②然后利用淀粉酶除去多糖； ③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取 液，以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成 DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之 与多糖分离； ④利用去污剂或氯仿-戊/辛醇或苯酚处理后除去蛋白 质； ⑤利用胰脏核糖核酸酶或钙盐或活性炭除去RNA。
实验一 动物肝脏组织中基因组DNA提取和鉴定-精
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核酸提取的主要步骤
• 破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声、冻融；异硫氰酸胍、 碱裂解；酶解（溶菌酶）
• 除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子： 酚/氯仿抽提、蛋白变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白 酶处理、高盐洗涤 • 除去其它不需要的核酸分子
• 沉淀核酸RNA。
2
核酸的理化性质
在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在。 溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来。
3
基因组DNA的提取方法
浓盐法：利用RNA和DNA在不同盐浓度溶液中的溶解度 不同将二者分离。
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四、实验步骤
1、DNA的提取 （7）将混合液转移至50mL刻度离心管中， 3500r/min离心 10min ，取上清至一个新的50mL刻度离心管。 （8）加入20mL95%乙醇溶液，上下颠倒混匀后，出现丝状 物，用枪头挑取丝状物，或者3500r/min离心5min 。 （9）弃去上清液（注意：缓慢倒去上清液），沉淀物质即 为DNA，空气干燥后即可加入适量的TE缓冲液。
9
四、实验步骤
1、DNA的提取 （1）称取5g鸡肝，置于预冷的研钵中，在冰浴中剪碎，加 入10mL预冷的0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，研磨 成匀浆液。 （2）将匀浆液加入到15mL刻度离心管中，2000r/min离心 10min，弃去上清液。 （3）将沉淀转移至50mL离心管中，加入10mL预冷的 0.14mol/L NaCl-0.14mol/L EDTA溶液，充分摇匀后，于 4℃ 2000r/min离心10min，弃去上清液。
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动物肝脏DNA提取和鉴定
防止机械力的切割作用，避免剧烈振荡；
整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。
核酸提取过程中的注意事项：
01
加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。
02
保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。
03
纯的DNA样品的获得
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。
01
02
03
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 （2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA. （3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1 注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行电泳分离。
整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。
核酸提取过程中的注意事项：
01
加入RNA酶降解剩余的RNA，获得纯的DNA。
02
保存：将DNA于滤纸上干燥，溶于1mlTE中低温保存。
03
纯的DNA样品的获得
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理：
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 琼脂糖英文名agarose，是从琼脂中提取出来的，由半乳糖和3.6-脱水-L- 半乳糖相互结合的链状多糖。琼脂糖和琼脂都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶，电泳中具有分子筛效应。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗作用降低，因而分离效果明显提高。
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更少的DNA。
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03
琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小(碱基对的对数)成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。 （2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA. （3）不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖浓度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1 注：DNA片段在5-500bp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行电泳分离。
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组员：孙鹤、林哲闽、姜 运秋、吴丽媛
目的酶：由三种不同的亚基组成， 为结合酶，pl=6.2
一.材料的选择
因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂 质、核酸的物质，所以取饥饿24小时 的动物肝脏为实验材料。
1.细胞破碎
二.材料的处理
机械破碎法 粗处理时可将肝脏用剪刀剪成小块 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细 胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波 破碎法均可。 使用冻融法应注意不能在过高的温度 下操作，以免引起酶的变性失活。 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机 试剂② 表面活性剂③ 螯合剂等。他们 都可以增加细胞膜的通透性，使酶容易 释放。
2.离子交换柱层析法 酶提取液中含有目的 酶以及其他杂质。可 用柱层析法进行进一 步的分离。 将交换剂缓冲液的ph 调节到目的酶的PL与 杂质蛋白的PL之间使 其中一类蛋白吸附在 交换剂或者虑过层析 柱从而达到分离的目 的。
五.酶的纯化、精制
1.结晶：
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，不仅 为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而 且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。通常 酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。常用方 法有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶 法、等电点结晶法 由于本实验目的产物为酶，故采用盐析结晶法。 原因：主要用于大分子如蛋白质、酶、多肽等的结 晶。特点：不耐热，对pH变化及有机溶剂十分敏感。 用中性盐作为沉淀剂，安全、操作简单。盐析结晶 法操作包括：加固体盐法；饱和盐溶液；透析扩散 法。 有机溶剂结晶法：针对小分子物质的结晶。 等电点结晶法：多用于一些两性物质。
2.防止蛋白酶的水解作用：
预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝 氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、 二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA 和EGTA（乙二醇四乙酸） 3.除核酸：
一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸 污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂 的选择需要大量的试验来选定，已知的有 1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。
三.酶的提取
1.常用方法：盐析法
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大 于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时， 中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面 的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分 子之间聚集而沉淀。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫 酸镁、硫酸铵等。
冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下，
使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为 气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高， 结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。特别适用于 对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。
六.酶纯度的检验
对该酶进行SDSPAGE电泳，因本实 验目的酶含有三个 不同亚基，所以若 仅出现3条色带， 则说明酶的纯化成 功。
影响酶提取的主要因素： 1. 酶在所使用溶剂中的溶解度； 2. 酶向溶剂扩散的速度：酶向溶剂扩散的速度与温度 （↗）、黏度（↘）、扩散面积（↗）、扩散距离 （↘）及两相间的浓度差（↗）有密切关系； 3. 温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度，有 利于酶的提取。适当提高温度，可以提高酶的溶解度， 也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，易引 起酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。
3.干燥：
将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分， 以获得含水分较少的固体物质的过程。 常用方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸 附干燥等。
真空干燥：真空干燥是在与真空系统相连接的密闭
干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶液在较低的温度条 件下蒸发干燥的过程。在真空泵之前需要设置水蒸气凝结 收集器，以免汽化产生的水蒸气进入真空泵。酶液真空干 燥的温度一般控制在60℃以下。
Hale Waihona Puke .浓缩：从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度 酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、过滤与 膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。 用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸 去水分，也可以达到浓缩效果。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下，使酶液在60℃ 以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来，在 不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压力、 增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。
四.酶的分离
常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤 和膜分离法、萃取法等。 1.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性 电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子 能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把 目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的 pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多 的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不 理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
4.pH值：提取时，溶液的pH值不宜过高或过低，以
免引起酶的变性失活，并避开酶的等电点。当pH 值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。
5.提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高
酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度
降低，对进一步的分离纯化不利。因此，控制提
取液的总量一般为原料体积的3～5倍。 盐析法之后要进行透析
目的酶：由三种不同的亚基组成， 为结合酶，pl=6.2
一.材料的选择
因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂 质、核酸的物质，所以取饥饿24小时 的动物肝脏为实验材料。
1.细胞破碎
二.材料的处理
机械破碎法 粗处理时可将肝脏用剪刀剪成小块 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细 胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波 破碎法均可。 使用冻融法应注意不能在过高的温度 下操作，以免引起酶的变性失活。 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机 试剂② 表面活性剂③ 螯合剂等。他们 都可以增加细胞膜的通透性，使酶容易 释放。
2.离子交换柱层析法 酶提取液中含有目的 酶以及其他杂质。可 用柱层析法进行进一 步的分离。 将交换剂缓冲液的ph 调节到目的酶的PL与 杂质蛋白的PL之间使 其中一类蛋白吸附在 交换剂或者虑过层析 柱从而达到分离的目 的。
五.酶的纯化、精制
1.结晶：
结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程，不仅 为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而 且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。通常 酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。常用方 法有盐析结晶法、有机溶剂结晶法、透析平衡结晶 法、等电点结晶法 由于本实验目的产物为酶，故采用盐析结晶法。 原因：主要用于大分子如蛋白质、酶、多肽等的结 晶。特点：不耐热，对pH变化及有机溶剂十分敏感。 用中性盐作为沉淀剂，安全、操作简单。盐析结晶 法操作包括：加固体盐法；饱和盐溶液；透析扩散 法。 有机溶剂结晶法：针对小分子物质的结晶。 等电点结晶法：多用于一些两性物质。
2.防止蛋白酶的水解作用：
预防的措施是加入蛋白酶抑制剂。常用的丝 氨酸蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、 二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA 和EGTA（乙二醇四乙酸） 3.除核酸：
一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸 污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂 的选择需要大量的试验来选定，已知的有 1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。
三.酶的提取
1.常用方法：盐析法
蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大 于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时， 中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面 的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分 子之间聚集而沉淀。常作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫 酸镁、硫酸铵等。
冷冻干燥：冷冻干燥是先将酶液降温到冰点以下，
使之冻结成固态，然后在低温下抽真空，使冰直接升华为 气体，而得到干燥的酶制剂。冷冻干燥得到的酶质量较高， 结构保持完整，活力损失少，但是成本较高。特别适用于 对热非常敏感而价值较高的酶类的干燥。
六.酶纯度的检验
对该酶进行SDSPAGE电泳，因本实 验目的酶含有三个 不同亚基，所以若 仅出现3条色带， 则说明酶的纯化成 功。
影响酶提取的主要因素： 1. 酶在所使用溶剂中的溶解度； 2. 酶向溶剂扩散的速度：酶向溶剂扩散的速度与温度 （↗）、黏度（↘）、扩散面积（↗）、扩散距离 （↘）及两相间的浓度差（↗）有密切关系； 3. 温度：在不影响酶活性的条件下，适当提高温度，有 利于酶的提取。适当提高温度，可以提高酶的溶解度， 也可以增大酶分子的扩散速度，但是温度过高，易引 起酶的变性失活，所以提取时温度不宜过高。
3.干燥：
将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分， 以获得含水分较少的固体物质的过程。 常用方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸 附干燥等。
真空干燥：真空干燥是在与真空系统相连接的密闭
干燥器中，一边抽真空一边加热，使酶液在较低的温度条 件下蒸发干燥的过程。在真空泵之前需要设置水蒸气凝结 收集器，以免汽化产生的水蒸气进入真空泵。酶液真空干 燥的温度一般控制在60℃以下。
Hale Waihona Puke .浓缩：从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓度 酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、过滤与 膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。 用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸 去水分，也可以达到浓缩效果。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下，使酶液在60℃ 以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来，在 不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压力、 增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。
四.酶的分离
常用的酶分离方法有沉淀法、层析法、电泳法、离心法、过滤 和膜分离法、萃取法等。 1.等电点沉淀法：利用两性电解质在等电点时溶解度最低， 及不同两性电解质的等电点不同这一特性，通过调节溶液的 pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 在溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性 电解质分子的净电荷为零，分子间的静电斥力消除，使分子 能聚集在一起而沉淀下来。因此可以通过调节介质的pH，把 目的酶和杂蛋白分开。但由于蛋白质在pI点附件一定范围的 pH内都可发生沉淀，只是沉淀的程度很不一样，而且相当多 的蛋白质的pI点很靠近，所以该法的回收率和纯化倍数都不 理想，一般只用于酶的粗分离阶段。
4.pH值：提取时，溶液的pH值不宜过高或过低，以
免引起酶的变性失活，并避开酶的等电点。当pH 值等于某酶的等电点时，酶分子的溶解度最小。
5.提取液的体积：增加提取液的用量，可以提高
酶的提取率。但是过量的提取液，会使酶的浓度
降低，对进一步的分离纯化不利。因此，控制提
取液的总量一般为原料体积的3～5倍。 盐析法之后要进行透析