17动物组织蛋白提取
蛋白的分离提纯工艺
课程设计说明书课程名称：生物分离工程设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺院系：环境与化学工程学院学生姓名：***学号：41004020111专业班级：10级生物工程01班指导教师：***2013年6月20日目录1.设计任务书 (1)2.设计背景 (1)2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1)2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1)3.设计原理 (2)4.设计工艺流程及设计方案说明 (2)4.1对原材料的粗分级分离 (3)4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3)4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3)4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3)4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3)5.操作过程 (4)5.1蛋白质分离的准备阶段 (4)5.2细分级分离设备的设计 (4)5.3蛋白质的纯度鉴定 (8)6.参考文献 (8)7.课程设计心得 (9)1.设计任务书现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。
2.设计背景2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。
因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。
机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。
蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。
人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。
蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。
蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。
软骨蛋白提取步骤
软骨蛋白提取步骤软骨蛋白提取是一种常用的实验方法，用于从软骨中提取蛋白质。
软骨是一种坚韧的结缔组织，主要由软骨细胞和软骨基质组成。
软骨蛋白是软骨基质中的主要成分，具有重要的生物学功能。
本文将详细介绍软骨蛋白提取的步骤及相关实验注意事项。
实验材料准备在进行软骨蛋白提取实验之前，需要准备以下实验材料：1.软骨样本：可以使用动物软骨（如小鼠、大鼠等）或人类软骨（如关节软骨、鼻软骨等）作为实验样本。
软骨样本应新鲜，保存在-80摄氏度的冰箱中。
2.细胞裂解缓冲液：根据实验需要选择合适的细胞裂解缓冲液，常用的缓冲液包括磷酸盐缓冲液（PBS）、甘氨酸盐缓冲液（Tris-HCl）等。
3.细胞裂解酶：根据实验需要选择适合的细胞裂解酶，常用的酶有蛋白酶、核酸酶等。
4.蛋白质抽提试剂盒：根据实验需要选择适合的蛋白质抽提试剂盒，常用的试剂盒有RIPA缓冲液、细胞裂解液等。
5.离心管、离心机：用于离心样本以分离蛋白质。
6.电泳试剂：进行蛋白质分析时需要准备电泳试剂，包括凝胶、缓冲液、染色剂等。
实验步骤软骨蛋白提取的步骤主要包括软骨样本的处理、细胞裂解、蛋白质抽提和蛋白质分析等。
下面将详细介绍每个步骤的操作方法。
1.软骨样本的处理–将冰冻的软骨样本取出，放置在冰盒中解冻。
–使用去离子水或PBS缓冲液清洗软骨样本，去除表面的杂质。
–将软骨样本切割成小块，使其容易裂解和抽提蛋白质。
2.细胞裂解–将切割好的软骨样本置于细胞裂解缓冲液中，加入适量的细胞裂解酶。
–使用超声波仪器或研钵和研针进行细胞裂解，直至软骨样本完全裂解。
–将裂解后的混合液放置在冰上，以保持低温。
3.蛋白质抽提–使用离心机将裂解后的混合液进行离心，以去除细胞碎片和细胞核等固体颗粒。
–取出上清液，加入蛋白质抽提试剂盒中提供的试剂，按照试剂盒说明书进行蛋白质抽提。
–使用离心机将抽提后的蛋白质样品进行离心，以去除残留的固体颗粒。
4.蛋白质分析–取出蛋白质样品，使用比色法或Western blot等方法进行蛋白质浓度的测定。
肝脏蛋白的提取和浓度测定.
实验步骤
1. 取试管7支，编号，按下表加入试剂:
为准
2.蛋白的浓度测定
考马斯亮蓝法 BCA法 紫外吸收法 Lowry法(Folin-酚试剂法) 双缩脲法
2.蛋白的浓度测定-考马斯亮蓝法
1976 年 由 Bradford 建 立 的 考 马 斯 亮 兰 法 （Bradford法），具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。
1.肝脏组织的提取
组织取材
操作 步骤
超声匀浆 冰上放置 4度离心
吸取上清
1.肝脏组织的提取
（1）组织取材：
取约100mg大鼠 肝脏组织，用灭菌 的剪刀将组织块尽 量剪碎，放入1.5ml 灭菌的EP管中
1.肝脏组织的提取
（2）超声匀浆：
加0.5mlRIPA裂解 液（含50ulPMSF）, 置于冰上，用超声匀 浆器进行匀浆,超声 每次10秒，重复3次管号 空白管标准管
试剂(ml)
0
1 234 5
1mg/mL牛血清
白蛋白溶液
蒸馏水 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
待测样品 – –
–
–––
考马斯亮蓝 5
5 5 55
5
G250
测定管 6
0 0 1 5
2. 混匀, 室温放置2 min。在波长 595nm 处以0号管
调零，测定各管吸光度值。
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常用培养基配方范文
常用培养基配方范文培养基（Culture medium）是一种用于细菌、真菌、植物细胞、动物细胞和其他微生物的繁殖和生长的营养物质。
常用的培养基可分为发酵培养基、微生物培养基和细胞培养基。
下面列举了一些常用的培养基配方。
1. LB培养基（Luria-Bertani medium）成分：-牛肉提取物：10克-酵母提取物：5克-热可溶性淀粉：10克-氯化钠：10克-水：1升2. NB培养基（Nutrient broth）成分：-牛肉提取物或肉蔻精：8克-酵母提取物：4克-葡萄糖：4克-水：1升3. MacConkey培养基成分：-水解动物蛋白：17克-中和胆盐：1.5克-中性红：0.03克-水：1升4. TSB培养基（Tryptic soy broth）成分：-大豆胨：17克-酵母提取物：3克-水：1升5. BHIA培养基（Brain Heart Infusion Agar）成分：-脑心汤固体：37克-水：1升6.R2A培养基成分：-水解酵母提取物：0.5克-蛋白胨：0.5克-葡萄糖：0.5克-脱脂乳粉：0.5克-黄豆粉：0.5克-高氯酸钠：0.3克-多聚体1466：0.05克-水：1000毫升7.比尔斯氏培养基（BHI培养基）成分：-大豆胨：37克-脑心汤固体：2克-水：1升8. 培养基199（Medium 199）成分：-高锰酸钾：0.015克-硫酸：1.55克-磷酸一氢钠：0.184克-高氯酸钠：8.0克-溴酚蓝：0.4克-d-葡萄糖：5.55克-l-谷氨酸：40.525克-苏打粉：0.84克-水：1升9. DMEM培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）成分：-苔藓胶原酸：1克-乳糖：1克- 谷氨酸：584mg- 水：1000ml这只是一小部分常见的培养基配方，实际上有很多种不同的培养基，它们根据不同的生物特性和培养需求来设计。
不同的培养基可以提供细菌、真菌、细胞等微生物生长需要的各种营养物质。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离与纯化蛋白质分离纯化的基本流程选择材料和预处理细胞的破碎及细胞器的分离蛋白质的抽提蛋白质的纯化浓缩浓缩、、干燥和保存一、材料的选择和预处理微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先除去结缔组织和脂肪组织。
对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。
二、细胞的破碎（一）机械方法机械方法：：主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
高速组织捣碎机高速组织捣碎机（（转速可达10000rpm ，具高速转动的锋利的刀片的刀片），），），适用于动物内脏组织的破碎适用于动物内脏组织的破碎适用于动物内脏组织的破碎。
玻璃匀浆器玻璃匀浆器（（用两个磨砂面相互摩擦用两个磨砂面相互摩擦，，将细胞磨碎将细胞磨碎），），），适适用于少量材料用于少量材料；；也可用不锈钢或硬质塑料等也可用不锈钢或硬质塑料等，，两面间隔只有十分之几毫米有十分之几毫米，，对细胞破碎程度比高速捣碎机高对细胞破碎程度比高速捣碎机高，，机械切力对分子破坏较小切力对分子破坏较小。
小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取，，也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细石英砂及玻璃粉磨细。
（二）物理方法物理方法：：主要通过各种物理因素的作用主要通过各种物理因素的作用，，使组织细胞破碎。
反复冻融法反复冻融法：：将细胞在-20度以下冰冻度以下冰冻，，室温融解室温融解，，反复几次几次，，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀起溶胀，，使细胞结构破碎使细胞结构破碎。
超声波法超声波法：：用一定功率的超声波处理细胞悬液用一定功率的超声波处理细胞悬液，，使细胞急剧震荡破裂剧震荡破裂，，此法多适用于微生物材料此法多适用于微生物材料；；只要有设备只要有设备，，该法方便且效果也好法方便且效果也好，，但一次处理量较小但一次处理量较小。
蛋白质分离技术全
.
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几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
•
0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4
95.3
103
Na2SO4 4.9 18.9
43.3
42.2
NaH2PO4 1.6
加入大量中性盐后夺走了水分子破坏了水加入大量中性盐后夺走了水分子破坏了水化膜暴露出疏水区域同时又中和了电荷化膜暴露出疏水区域同时又中和了电荷破坏了亲水溶胶蛋白质分子即聚集而形成沉破坏了亲水溶胶蛋白质分子即聚集而形成沉盐浓度saltingoutsaltingin等点电时的蛋白质等点电时的蛋白质亲水胶体亲水胶体带负电荷蛋白质带负电荷蛋白质亲水胶体亲水胶体脱水脱水脱水带负电荷蛋白质疏水胶体不稳定蛋白颗粒不稳定蛋白颗粒阴离子阳离子蛋白质聚集沉淀带正电荷蛋白质带正电荷蛋白质亲水胶体亲水胶体水化膜带正电荷蛋白质疏水胶体水化膜中性盐的选择中性盐的选择常用的中性盐中最重要的是常用的中性盐中最重要的是nhnh4422soso44为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或
SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞
膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
.
例如，胰岛素。
.
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4. 膜蛋白的提取
• 膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜 非常重要的生物学功能。
• 根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为 两大类型：外周膜蛋白和内在膜蛋白。 (1) 外周膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表 面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚 至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。 (2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂 (detergent)使膜溶解后才可分离出来。
蛋白表达纯化实验步骤
蛋白表达纯化实验步骤(待改进)1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。
2、设计蛋白表达引物。
引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。
3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因c DNA.4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。
5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。
6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。
表达菌株如Bl21(DE3)、Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。
7、蛋白的诱导表达。
1)将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM到1m M。
37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。
2)SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。
注:目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。
3)将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。
甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。
4)用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速(140-180rpm),诱导过夜作为包涵体检测样品。
注意:1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。
葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。
2.保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。
8、包涵体检测。
方案见附件29、如有上清表达,则扩大摇菌。
1)取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种的活性而异,也可过夜摇菌。
2)将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD= 1.0左右(约2.5h~3h),然后加IPTG(浓度同包涵体检测中使用的浓度。
)注:菌液浓度要适当的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。
必刷17 动物生理实验的补充与完善-2023年高考生物总复习高频考点+常考题型必刷题(解析版)
必刷17 动物生理实验的补充与完善1．（2022·全国乙卷·高考真题）甲状腺激素在促进机体新陈代谢和生长发育过程中发挥重要作用。
为了研究动物体内甲状腺激素的合成和调节机制，某研究小组进行了下列相关实验。
实验一：将一定量的放射性碘溶液经腹腔注射到家兔体内，一定时间后测定家兔甲状腺的放射性强度。
实验二：给甲、乙、丙三组家兔分别经静脉注射一定量的生理盐水、甲状腺激素溶液、促甲状腺激素溶液。
一定时间后分别测定三组家兔血中甲状腺激素的含量，发现注射的甲状腺激素和促甲状腺激素都起到了相应的调节作用。
回答下列问题。
(1)实验一中，家兔甲状腺中检测到碘的放射性，出现这一现象的原因是______。
(2)根据实验二推测，丙组甲状腺激素的合成量______（填“大于”或“小于”）甲组。
乙组和丙组甲状腺激素的合成量______（填“相同”或“不相同”），原因是______。
【答案】(1)甲状腺吸收碘合成甲状腺激素(2)大于不相同乙组注射外源甲状腺激素，使甲状腺激素合成减少，丙组注射促甲状腺激素会促进甲状腺激素的合成【解析】下丘脑通过释放促甲状腺激素释放激素（TRH），来促进垂体合成和分泌促甲状腺激素（TSH），TSH可以促进甲状腺合成和释放甲状腺激素；当甲状腺激素达到一定浓度后，又会反馈给下丘脑和垂体，从而抑制两者的活动。
(1)碘是合成甲状腺激素的原料，将放射性碘溶液注射到兔体内，碘首先进入组织液，后进入血浆或淋巴运输到甲状腺滤泡上皮细胞被吸收，参与甲状腺激素的合成。
(2)甲组注射生理盐水，对甲状腺的活动没有明显的影响，甲状腺激素的合成与释放维持原来的水平；乙组注射外源甲状腺激素，使机体甲状腺激素含量超过正常水平，会反馈给下丘脑和垂体，从而抑制两者的活动，使机体甲状腺激素合成减少；丙组注射促甲状腺激素，可以促进甲状腺合成和分泌甲状腺激素，导致甲状腺激素合成增加，故三种情况下，丙组甲状腺激素的合成量大于甲组，乙组和丙组甲状腺激素的合成量不相同。
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1.组织块迅速置于预冷的生理盐水中，洗去表面的血迹，将组织称量后切成较小的组织块（0.2-1.0g），放入组织匀浆器中，按组织100mg：提取试剂体积1ml的比例加入相应体积的蛋白提取试剂（需提前加入酶抑制剂）进行匀浆，至组织研磨完全。
2.超声处理（同细胞蛋白样品的制备），处理完后置冰上裂解4-5小时。
3.10000 g/min离心10min，取中层溶液，加入等体积的蛋白上样缓冲液（2X），或1/4体积蛋白上样缓冲液（5x）（AR1112）,置100℃水浴箱沸水浴中变性5分钟。
1、动物肝脏直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次。
2、称量约40mg研磨组织，加入200 ul预冷的组织蛋白抽提试剂，冰上孵育20分钟。
3、10,000×g 离心15分钟。
4、收集上清，进行下一步的实验。
手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8分钟），充分研碎，使组织匀浆化。
机器匀浆：用组织捣碎机10000～15000r/min上下研磨制成10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间10秒/次，间隙30秒，连续3～5次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。
超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用40安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。
反复冻融：培养或者分离的细胞可以用以上的方法匀浆，也可以反复冻溶3次左右（即让细胞加适量的低渗液或者双蒸水放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右），但有部分酶活力会受影响。
①吸取培养基，预冷PBS清洗细胞三次，细胞刮刮脱细胞，收集至离心管，1000rpm离心5分钟。
洗涤后的细胞转移至洁净EP管，②冰上操作，配制细胞裂解液，1ml Lysis,Buffer
中加入10 μl磷酸酶抑制剂、1 μl蛋白酶抑制剂、5μl 100mM的PMSF。
混匀后冰上保存数分钟待用。
③在洗涤好的细胞中按照每107个细胞加入1ml细胞裂解液的比例，加入细胞裂解液。
200μl移液器反复吹打，至蛋白析出。
④4℃摇床，温和振摇15分钟。
⑤14000rpm，4℃离心15分钟，上清即为细胞全蛋白提取物。
⑥BCA法测蛋白浓度。
蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。
提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。
细胞提取步骤
1. 冰上操作，向细胞沉淀中加入200ul细胞裂解液，2μl 100mM的PMSF。
2. 200μl移液器反复吹打，至溶液变得粘稠。
3. 4℃摇床，温和振摇30min。
4. 15000rpm，4℃离心15min，上清即为细胞全蛋白提取物
5. 蛋白分装后保存于-70℃冰箱，避免反复冻融。
注意：提取细胞全蛋白整个过程中所有使用的物品及试剂均需预冷，防止蛋白降解。