实验三动物组织DNA的提取
动物基因提取实验报告
一、实验目的1. 掌握动物组织基因组DNA提取的操作方法。
2. 理解并应用琼脂糖凝胶电泳技术检测DNA的方法。
3. 学习DNA纯度与含量的测定方法。
二、实验原理动物组织基因组DNA提取的原理主要是通过破碎细胞膜和核膜，释放出DNA分子，然后通过特定的方法去除杂质，最终获得高纯度的DNA。
实验中，常用的破碎细胞膜和核膜的方法有：- 使用十二烷基磺酸钠（SDS）和蛋白酶K等试剂，使蛋白质变性并溶解细胞膜中的脂质，导致细胞裂解。
- 利用溶菌酶、蜗牛酶等酶类，水解细胞壁和细胞膜，释放DNA。
获得细胞裂解物后，通过加入苯酚和氯仿等有机溶剂，使蛋白质变性并形成有机相和水相，从而分离核酸和蛋白质。
由于DNA不溶于有机溶剂，因此可以通过离心分离获得含有DNA的上清液。
上清液中加入无水乙醇，DNA会从溶液中沉淀出来。
将沉淀的DNA溶解于TE缓冲液中，即可获得高纯度的DNA。
琼脂糖凝胶电泳是检测DNA纯度和大小的重要手段。
DNA分子在琼脂糖凝胶中，在电场的作用下，根据分子大小和所带电荷的不同，在凝胶中移动的速度不同，从而实现分离。
DNA纯度可以通过紫外吸收法测定，根据DNA在260nm处的吸光度值计算DNA的纯度。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：动物肝脏组织样本2. 试剂：- DNA提取试剂盒- 十二烷基磺酸钠（SDS）- 蛋白酶K- 溶菌酶、蜗牛酶- 苯酚、氯仿、异丙醇- 无水乙醇- TE缓冲液- 琼脂糖- 电泳缓冲液- 标准DNA分子量标记物四、实验器材与仪器1. 器材：离心管、移液器、电泳槽、凝胶成像系统、PCR仪等2. 仪器：超净工作台、恒温培养箱、高速离心机、微波炉等五、实验步骤1. 取动物肝脏组织样本，称重后加入适量提取试剂，进行细胞破裂和蛋白质水解。
2. 加入苯酚和氯仿，混合均匀，离心分离，取上清液。
3. 上清液中加入无水乙醇，混合均匀，离心分离，收集沉淀。
4. 将沉淀溶解于TE缓冲液中，即为提取的DNA。
动物组织核酸的提取实验报告
动物组织核酸的提取实验报告
动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖孩酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。
核蛋白可被三氯醋酸沉淀，再用95%乙醇加热可以除去附着在沉淀上的脂类杂质，然后用10%NaCl溶液提取出核酸的钠盐，加入醇可使核酸钠沉淀析出。
先用水由动物肝中提出核蛋白，再籍酚将核酸与蛋白质之间的结合键断裂，并用乙醚抽提去蛋白质及其它杂质，最后用乙醇将核酸沉淀。
核酸(RNA、DNA)可被硫酸水解产生磷酸。
有机碱和戊糖。
此三类化合物可用下列方法鉴定之。
1、磷酸:能与钼酸试剂作用生成磷钼酸，后者在还原剂的作用下。
还原成兰色的钼兰。
常用的还原剂有氨基苯磺酸、氯化亚锡，维生素C等。
H3PO4＋12H2Mo04→H3PO4·12Mo03+12H20H3P04·12Mo03
H3P04·6Mo03·3Mo205
2、嘌呤碱:能与苦味酸作用形成针状结晶
3、戊糖:
(⑴)核糖:经与强酸(盐酸与硫酸)共热生成糠醛，后者可与3;5二羟甲基苯缩合成绿色化合物。
(2)脱氧核糖:在强酸中加热，可生成o一羟基y一酮基戊醛，后者再与二苯胺作用生成一蓝色化合物。
实验三、动物组织DNA的提取
三．实验器材与试剂 1. 0.15mol/LNaCl-0.015mol/L 柠檬酸钠溶液（ PH7.0 ） : 称取 8.77g 氯化 钠、4.41g柠檬酸钠，用蒸馏水溶解，调节pH值至7.0稀释至100ml。 2. 0.15mol/LNaCl-0.1mol/LEDTA-Na2 溶液（ PH8.0 ） : 称取 8.77g 氯化钠、 37.2g EDTA-Na2 溶于 800ml 蒸馏水中，以 0.1mol/L 氢氧化钠调至 PH8.0 ， 最后定容至1000ml。 3. 5mol/L 氯化钠：称取 292.2gNaCl 溶于 800ml 蒸馏水中，最后定容至 1000ml。 4. 5%SDS溶液：称取5gSDS，溶至100ml的45%乙醇中。 5. 氯仿-异戊醇溶液：按氯仿︓异戊醇=24︓1（V/V）配制。 6. 95%乙醇，75%乙醇。 7. 组织捣碎机（或玻璃匀浆器），移液管，离心机，锥形瓶，天平，容 量瓶，剪刀。
研磨匀浆
匀浆转入离心管
离心后的匀浆
分离得到dna核蛋白后应进一步十二烷基硫酸钠使蛋白质变性用含有异戊醇的氯仿除去变性的蛋白质以得到游离的dna4dna分子大而长其水溶液呈粘稠状可用玻璃棒搅缠起来
动物生物化学实验报告
——动物组
织DNA的提取
班级：动科1143 姓名：李胜浩 学号：201411331312
பைடு நூலகம்
一．实验目的 掌握从动物组织中分离DNA的基本原理和方法。 二．基本原理 DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白，能溶解在纯水或1mol/L 的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。2.在0.1mol/LNaCl溶液 中，DNA核蛋白的溶解度最小，仅为在纯水中的1%左右，而 RNA核蛋白的溶解度最大；但在1mol/LNaCl溶液中，DNA核蛋 白的溶解度却增大，至少是在纯水中的两倍，而RNA核蛋白 的溶解度却明显下降。3.分离得到DNA核蛋白后，应进一步 十二烷基硫酸钠使蛋白质变性，用含有异戊醇的氯仿除去变 性的蛋白质，以得到游离的DNA。4.DNA分子大而长，其水溶 液呈粘稠状，可用玻璃棒搅缠起来。为了获得大的DNA分子， 在试验中应尽量避免剧烈震荡、用力过猛。
动物基因组DNA的提取
动物基因组DNA的提取[实验原理]在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。
通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1.台式离心机2.玻璃匀浆器3．高压灭菌锅4．恒温水浴(二)材料1．1.5mL微量离心管2．微量取样器和吸头3．无菌过滤器(一次性)4．10 mL注射器5．鼠肝6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)7.十二烷基硫酸钠(SDS)8．乙二胺四乙酸(EDTA)9．蛋白酶K10．RNA酶11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物(三)试剂1、1.5 mol／L NaCl2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.03．0.5 mol／L EDTA pH8.04．3 mol／L NaAc pH5.2以上均高压灭菌。
5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制)6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比)11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比)12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ相对分于质量标准物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125[实验步骤]本实验在无液氮的条件下，铡备鼠肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。
实验三 动物组织基因组DNA提取
龙志敏 200930220121 09制药一班实验三动物组织基因组DNA提取一、实验目的掌握动物组织基因组DNA提取的原理和方法二、实验原理真核生物DNA以染色体形式存在于细胞核内，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸）存在下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；EDTA则抑制细胞中DNase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。
三、仪器、试剂和材料1、仪器设备恒温水浴锅、台式离心机、移液器、玻璃匀浆器、离心管、吸嘴2、试剂（1）组织匀浆液：100mM NaCl，10 mM Tris-HCl (pH8.0)，25mM EDTA (pH 8.0)（2）2×细胞裂解缓冲液：200mM NaCl，20 mM Tris-HCl (pH8.0)，50 mM EDTA (pH 8.0)，蛋白酶K (200 μg/mL)，1%SDS（3）蛋白酶K：双蒸水配制10mg/mL，-20℃保存（4）TE缓冲液：10 mM Tris-HCl (pH8.0)，1 mM EDTA (pH 8.0)，室温贮存（5）平衡酚(pH8.0)/氯仿/异戊醇（25:24:1）（6）3 M NaAc、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水、生理盐水3、材料新鲜动物（鸡）肝脏组织四、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物肝脏组织块0.1g，用冷生理盐水洗3次，置于培养皿中剪碎（动作要快）。
将碎肝脏组织转入玻璃匀浆器中，加入1mL的匀浆液，匀浆至不见组织块（低温操作）；2、将匀浆液倒入1.5mL 离心管中（转前先静置一会，防止未碎的组织进入离心管），5000rpm离心2min；3、弃上清，沉淀加0.25 mL无菌水，用微量移液器吸嘴吹散悬浮沉淀，再加0.25 mL 2×细胞裂解缓冲液，盖上离心管盖子，颠倒混匀；4、将离心管插入泡沫浮板中，置于55℃恒温水浴锅中水浴2-3h，可间歇性颠倒混匀离心管数次；5、加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，缓慢颠倒混匀，冰上静置10min，12000 rpm离心10min；6、用钝化的黄吸嘴吸取上清水相（含DNA，粘稠）入另一新1.5mL 离心管中（注意不可吸取两相间的蛋白质）；7、估算上清体积，加入等体积氯仿/异戊醇(24:1)，缓慢颠倒混匀，12000 rpm离心10min；8、用钝化的黄吸嘴吸取上清水相入另一新1.5 mL离心管中，并加1/10体积的3 M NaAc 和两倍体积的无水乙醇，盖上离心管盖子，缓慢颠倒混匀，冰浴30 min后10000 rpm离心5min；9、小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将管口的残余液滴除掉；10、用1mL 预冷的70%乙醇洗涤沉淀物，10000 rpm离心1min；11、小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上吸去管口的液滴，短暂离心，用吸嘴将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥；12、加100μLTE缓冲液重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。
动物组织中总DNA的提取
试剂
提取缓冲液：200 mmol/L Tris·Cl (pH8.0), 25mmol/L EDTA, 500 mmol/L NaCl, 0.5% SDS
24：1的氯仿：异戊醇 预冷无水乙醇
SDS抽提液配方(1000ml):
操作步骤
1. 肝脏1g左右, (剪碎) 置研钵中，加入2-3mL提取缓
目前从样品中分离DNA的方法主要有两种，分为 CTAB法和使DNA得以 游离出来）。
SDS法提取动物组织DNA
SDS（十二烷基硫酸钠 ）是阴离子表面活性 剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉 淀下来。EDTA 抑制DNA酶的活性。再加入氯仿等 有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因 核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提 液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入 乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中， 即DNA溶液。
絮状DNA沉淀。
结果分析与讨论
DNA提取原则
保证DNA结构的完整性
纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质
排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染
实验原理
细胞内各种DNA（包括基因组DNA和核外DNA） 称为总DNA。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋 白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液 中，而不溶于有机溶剂。
冲液， 研磨成浆；吸入10mL EP管中，摇动混匀；
2. 60℃水浴保温20min，不时颠倒混匀； 3. 室温下3000rpm离心10min； 4. 小心吸上清于另一只离心管中，加入等体积的24:1
的氯仿：异戊醇，上下颠倒混匀；
5. 室温下3000rpm离心10min； 6. 小心将上层水相吸入另一只离心管中； 7. 重复4-5步2-3次; (此步不做） 8. 加入等体积预冷无水乙醇，室温下放置片刻即出现
实验三、小鼠肝DNA提取及鉴定
操作步骤
（三）DNA的含量测定 的含量测定
取0.5ml DNA样品加 TE缓冲液至 样品加 缓冲液 4ml，用4ml 0mlTE缓冲液调零，用紫外 ， 缓冲液调零， 分光光度计测A260值和 值和A280值。 分光光度计测 值和 值
（四）计算DNA浓度并判断样品组成 计算 浓度并判断样品组成
操作步骤
3．小心取上清液约0.4-0.5ml ，加入 ml ．小心取上清液约 加入0.5 氯仿:异戊醇 异戊醇(24:1)，混匀，室温放 氯仿 异戊醇 ，混匀，室温放5min， ， 12000rpm离心 离心5min。 离心 。 4．取上清液0.2 ml ，加入 体积（即60µl) ．取上清液 加入0.3体积 体积（ 体积（ 的NH4Ac，2.5体积（即0.5ml)的无水乙醇 ， 体积 的无水乙醇 充分混匀， 离心5min，小心倒去 充分混匀，12000rpm离心 离心 ， 溶液，吸干。 沉淀加入1.0mlTE缓冲 溶液，吸干。DNA沉淀加入 沉淀加入 缓冲 液溶解。 液溶解。
操作步骤
(一）肝匀浆的制备 （二）提取DNA 提取 1．取0.5ml匀浆液加入 ． 匀浆液加入1.5ml离心管中，加 离心管中， 匀浆液加入 离心管中 溶液0.1ml，颠倒混匀后，室温 入 10％SDS溶液 ％ 溶液 ，颠倒混匀后， 5min； ； 2．在上述溶液中加入饱和酚0.25ml，氯仿 ．在上述溶液中加入饱和酚 ，氯仿: 异戊醇(24:1) 0.25ml，充分混匀，室温放 异戊醇 ，充分混匀， 5min，12000rpm离心 离心5min; ， 离心
A260的应用
1. DNA或RNA的定量 或 的定量 A260=1.0相当于 相当于 50μg/ml双链 μ 双链DNA 双链 40µg/ml单链 单链DNA（或RNA） 单链 （ ） 20µg/ml寡核苷酸 寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 判断核酸样品的纯度 DNA纯品 A260/A280 = 1.8 纯品: 纯品 RNA纯品 A260/A280 = 2.0 纯品: 纯品
基因组DNA提取
基因组DNA的提取一、从哺乳动物组织提取基因组DNA实验材料：液氮、消化缓冲液、PBS（冰冷）、25:24:1酚/氯仿/异戊醇、7.5M乙酸铵、无水乙醇及70%乙醇、0.1%SDS、RNA酶、TE缓冲液（pH8.0）、离心管、研钵、冷冻离心机。
实验步骤：1.取新鲜或冰冻动物组织块，剪成小块。
置于液氮中冻结。
2.将500mg的组织用预冷的研钵和研杵研碎，或用小锤子将其捣为细粉末，每100mg组织用1.2 mL消化缓冲液悬浮。
3.将6ml样品在盖紧的离心管中于50℃摇荡下温育12～18 h。
4.用6ml酚/氯仿/异戊醇抽提样品，1700g离心10 min。
如果样品溶解得不好，再加6ml不含蛋白酶K的消化缓冲液，并重复离心。
如果在界面上有一层厚的白色物质，重复有机抽提，将上层(水溶液)转移至一个新管中。
5.加入6ml 7.5M乙酸铵和24ml 100%乙醇，1700g离心2 min。
6.用70%乙醇洗涤，晾干，沉淀用TE缓冲液重新溶解，使终浓度在约1mg/mL左右。
7.加入0.1%的SDS和1pg/mL无DNA酶的RNA酶，37℃温育1h,以除去残留的RNA.重复步骤 4～5。
二、从植物组织提取基因组DNA实验材料：液氮/干冰、2-巯基乙醇(2-ME)、 CTAB抽提液、CTAB/NaCl溶液、24:1(v/v)氯仿/异戊醇、CTAB沉淀液、高盐TE缓冲液、80%乙醇、TE缓冲液、抗有机溶剂的试管和烧杯、研钵和研杵、粉碎器/匀浆器、捣碎机、恒温金属浴、冷冻离心机。
实验步骤：1.取1g的鲜叶组织，在3.2ml CTAB抽提液中加入0.8ml 2-巯基乙醇，使终浓度达2%(v/v)。
将此溶液及1ml CTAB/NaCl溶液加热至65℃。
2.用液氮(-196℃)或干冰(一78℃)冷却粉碎器/匀浆器，将植物组织粉碎成为细粉，然后将冷冻的组织转移到一个抗有机溶剂的试管或烧杯中。
3.往粉碎的组织中加入预热的2-ME/CTAB,混合使之充分湿润，65℃温育10～60min,不时混匀：4.用4ml的24:1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，颠倒使充分混合，于4℃, 7500g离心5 min(对于小样品，在离心机上以10000 r/min离心),回收上(水)相。
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四、实验步骤
1.本实验以鸡或兔的肝脏为材料。实验前动物应饥饿12h以上。 2.称取肝脏4g，放在培养皿中，用剪刀剪碎，放入匀浆器研磨，
加入6ml，氯化钠-柠檬酸钠缓冲液，装在10ml离心管中。将匀 浆物在4000r/min下离心10min。 3.将上述沉淀转入50ml大试管中，加入6ml氯化钠-柠檬酸钠缓 冲溶液、3ml氯仿-异戊醇混合液，0.5mlSDS使其终浓度为0.41%， 手摇15min，然后缓慢加入氯化钠固体（有0.55g），使其终浓 度为1mol/L。慢摇5min是氯化钠充分溶解。 4.将上述混合液在4000r/min离心15min，取上清液于50ml烧杯 中加入等体积冷95%乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在 玻璃棒的凝胶状物用滤纸吸取多余的乙醇，即得DNA粗品。 5.显色反应：取上述反应物2ml加入二苯胺试剂2ml沸水浴加热， 观察颜色。
三．实验器材与试剂
1. 0.15mol/LNaCl-0.015mol/L柠檬酸钠溶液（PH7.0）:称取8.77g氯化 钠、4.41g柠檬酸钠，用蒸馏水溶解，调节pH值至7.0稀释至100ml。
2. 0.15mol/LNaCl-0.1mol/LEDTA-Na2溶液（PH8.0）:称取8.77g氯化钠、 37.2g EDTA-Na2溶于800ml蒸馏水中，以0.1mol/L氢氧化钠调至PH8.0， 最后定容至1000ml。
研磨匀浆
匀浆转入离心管
离心后的匀浆
3. 5mol/L氯化钠：称取292.2gNaCl溶于800ml蒸馏水中，最后定容至 1000ml。
4. 5%SDS溶液：称取5gSDS，溶至100ml的45%乙醇中。
5. 氯仿-异戊醇溶液：按氯仿︓异戊醇=24︓1（V/V）配制。
6. 95%乙醇，75%乙醇。
7. 组织捣碎机（或玻璃匀浆器），移液管，离心机，锥形瓶，天平，容 量瓶，剪刀。
动物生物化学实验报告
——动物组 织DNA的提取源自班级：动科1143 姓名：李胜浩 学号：201411331312
一．实验目的 掌握从动物组织中分离DNA的基本原理和方法。 二．基本原理 DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白，能溶解在纯水或1mol/L 的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。2.在0.1mol/LNaCl溶液 中，DNA核蛋白的溶解度最小，仅为在纯水中的1%左右，而 RNA核蛋白的溶解度最大；但在1mol/LNaCl溶液中，DNA核蛋 白的溶解度却增大，至少是在纯水中的两倍，而RNA核蛋白 的溶解度却明显下降。3.分离得到DNA核蛋白后，应进一步 十二烷基硫酸钠使蛋白质变性，用含有异戊醇的氯仿除去变 性的蛋白质，以得到游离的DNA。4.DNA分子大而长，其水溶 液呈粘稠状，可用玻璃棒搅缠起来。为了获得大的DNA分子， 在试验中应尽量避免剧烈震荡、用力过猛。