6动物组织细胞基因组DNA的提取和定量
动物组织细胞基因组DNA提取
动物组织细胞基因组DNA提取一、实验原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。
真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris (pH8.0) 100 mmol/LEDTA (pH 8.0) 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶20ug/ml（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。
置于玻璃匀浆器中，加入1ml 的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入 1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μｌ，混匀。
在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。
于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
动物基因组DNA的提取流程总结
动物基因组DNA的提取1.切取组织5g 左右，用组织粉碎机或研钵将细胞分离。
注：1）少量结缔组织并不影响最后得到的DNA勺质量；2）若标本为血液，则只需肝素抗凝、离心后取白细胞层；3）若为培养的贴壁细胞，则用胰酶消化后收集，PBS洗涤即可。
2.加入5ml DNA提取缓冲液，（10mmol/L Tris-CI ,0.1 mol/L EDTA 0.5% SDS）, 混匀。
注：1）最好先加入Tris-Cl、EDTA再加入SDS 2）最好一边匀浆，一边加入液体，使之充分混匀。
3.加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml，混匀，37C温浴过夜。
注：1）致密组织（如小鼠尾巴）可以适当延长蛋白酶的作用时间；2）若组织量很大且组织比较疏松（如动物脾脏），或对所提取的DNA完整性要求不高时，可以不用蛋白酶K,而是剧烈振荡20分钟，将组蛋白与DNA分离。
此法可能会使部分DNA链断裂，但足以达到一般实验要求，并不影响后续处理；3）也可同时加入RNase。
4.加入等体积的酚－氯仿－异戊醇混合物（25:24:1），剧烈振荡10分钟，冰浴10 分钟，2500rpm 10 分钟离心收集水相。
注：不要混带中间蛋白层。
5.加1/10 体积3mol/L NaAc 及 2 倍体积冰预冷的无水乙醇，颠倒混匀。
冰浴1小时，沉淀DNA注：冰浴时间从10分钟到2小时均可，只是时间太短会影响到最后的产量，但不影响质量。
6.用玻棒轻搅钩出DNA沉淀，置于另一离心管中。
注：如果确信没有混入蛋白，也可用离心的方法去除液体，但应在加入蛋白酶K的同时加入RNaseA7.70%^醇洗涤，晾干，加适量TE或灭菌水溶解，-20 C保存。
注：若要长久保存DNA（数年以上），最好将其沉淀以无水乙醇封闭后，置于-80 °C。
动物基因组DNA的提取
动物基因组DNA的提取[实验原理]在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。
通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1.台式离心机2.玻璃匀浆器3．高压灭菌锅4．恒温水浴(二)材料1．1.5mL微量离心管2．微量取样器和吸头3．无菌过滤器(一次性)4．10 mL注射器5．鼠肝6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)7.十二烷基硫酸钠(SDS)8．乙二胺四乙酸(EDTA)9．蛋白酶K10．RNA酶11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物(三)试剂1、1.5 mol／L NaCl2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.03．0.5 mol／L EDTA pH8.04．3 mol／L NaAc pH5.2以上均高压灭菌。
5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制)6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比)11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比)12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ相对分于质量标准物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125[实验步骤]本实验在无液氮的条件下，铡备鼠肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定郝春霖（武汉大学药学院，2009302590232）摘要：采用盐溶法和有机溶剂抽提分离纯化猪肝基因组DNA，并利用紫外吸收和二苯胺显色法进行核酸定量和纯度测定。
制备的样品A260/ A280值在1.8附近，纯度较高。
但由紫外吸收法数据计算出样品DNA浓度远大于二苯胺显色法的计算结果，本文对数据差异做了相关讨论。
Abstract：The genomic DNA of poker liver were isolated and purified by salting-in and organic agent extraction method. In order to determine the quantitative and to test the fineness of our sample, it has been reacted with diphenylamine to produce the color product and exposed to the UV to find its O.D value. The A260/ A280 value of the sample is about 1.8, which indicates itself highly purified. However, the data of the two different methods are so different that it confuses us. This essay discusses the differences deeply and analyzes the reasons for the results.关键词：猪肝盐溶法抽提基因组DNA 紫外吸收法二苯胺Key words:poker liver salting-in method extract genomic DNA UVpcx diphenylamine引言：制备组织基因组DNA在基因结构和功能的研究中扮演着重要角色，是分子生物学研究中最重要的实验操作技术之一，样品分离纯化的程度对后续实验结构起到决定性作用；而不同种类生物的基因组DNA提取方法各异，同一生物的不同组织或器官也因其细胞结构及成分差异，而需采用不同的提取方法。
动物组织基因组DNA的提取
实验一动物组织基因组DNA的提取一、实验目的掌握从动物组织中提取总DNA的方法。
二、实验原理DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等实验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中最重要、最基本的操作之一。
染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。
从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。
整个实验可分为细胞裂解、DNA分离与纯化和DNA 的洗脱收集。
1.细胞裂解：酶法（蛋白酶K）。
2. DNA 分离与纯化：细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化DNA，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。
本实验采用TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒中的硅基质材料的离心吸附柱。
硅基质材料吸附核酸的原理，主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征，高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。
三、材料、试剂和设备1.材料：动物组织2.试剂：TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒，无水乙醇等3.设备：离心机，微量移液器等四、实验步骤1.处理材料：取动物组织10mg，尽量切碎，加200μl 缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
2.加入20μl蛋白酶K溶液，混匀后56℃水浴，直至组织溶解（不同组织裂解时间不同，通常需1-3小时即可完成）。
简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
（细胞裂解）3.加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁水珠。
（溶解DNA）注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。
如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA 量少和提取出的DNA不纯。
动物组织基因组DNA提取
动物组织DNA提取1样品预处理取新鲜组织25-50mg（组织不宜过多，否则裂解不完全堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小块，放入预冷研钵，快速加入液氮用力研磨，或直接放入匀浆器中匀浆。
冻存组织同样使用研钵研磨或匀浆器快速用力研磨或匀浆（冻存组织避免反复冻融，使细胞破碎，内源酶外泄影响基因组DNA提取）2.加入100ulPBS到研磨好的样品中，样品均匀悬浮于PBS3.加600ul的Lysis Buffer，颠倒混匀，如需消化RNA，可加入20ulRNase A，颠倒混匀，室温放置5min4.加入10ul ProteinaseK，混匀，56度水浴45-60min，（颠倒混匀数次，裂解完全液体则清亮粘稠，此步骤可过夜）5 .12000rpm 离心10min，上清转入新的离心管，加800ul无水乙醇，混匀6.液体分次转入离心柱（一次加不完可分次加入），12000rpm 离心1min，弃废液。
7.加入700ulWash bufferA（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
8. 加入700ulWash bufferB（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
9.加入500ulWash bufferB，12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
10.再次12000rpm 离心2min，将离心柱置于心得离心管中，打开离心柱盖，于室温或37度恒温箱放置5-10min，直至无明显乙醇味。
11.在硅基质膜中央加入50-200ulTEbuffer（事先预热55-65度）置于室温2-5min，12000rpm 离心30s。
12. 离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2min，12000rpm 离心2min，所得溶液为纯化后的基因组DNA.纯化效果检测：取2-5ulDNA产物，0.7%agarose电泳检测DNA分子的完整性和紫外分光光度计检测浓度和纯度。
动物组织细胞基因组DNA提取
动物组织细胞基因组DNA提取一、实验原理真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都能用来制备基因组DNA。
真核生物的DNA 是以染色体的形式存在于细胞核内，因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
蛋白酶K的重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的活性；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA 分子完整地分离出来。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）2. 试剂：（1）细胞裂解缓冲液：Tris (pH8.0) 100 mmol/LEDTA (pH 8.0) 500 mmol/LNaCL 20 mmol/LSDS 10%胰RNA酶20ug/ml（2）蛋白酶K：称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。
（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。
（4）酚?氯仿?异戊醇（25:24:1）、（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。
三、操作步骤1. 取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。
置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。
在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。
于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。
动物组织中DNA的提取与鉴定
实验目的
1. 掌握动物组织中DNA提取的原理和操作过程 2. 了解DNA的组分，掌握DNA的定性检测的具 体方法 3. 掌握DNA纯度检测和浓度测定方法
实验原理—DNA提取
动物组织细胞中的核糖核酸(RNA)与脱氧核糖 核酸(DNA)大部分与蛋白质结合形成核蛋白。 RNA核蛋白和DNA核蛋白在不同浓度氯化钠溶液 中的溶解度有显著区别。DNA核蛋白在0.14 mol/L 氯化钠中溶解度低，但在1 – 2 mol/L氯化钠中溶 解度高；RNA核蛋白在0.14 mol/L氯化钠中溶解度 仍有相当大的溶解度。调节氯化钠浓度，可使 RNA核蛋白和DNA核蛋白分步提取开来。
实验原理—DNA提取
氯仿-异戊醇溶液可以使核蛋白变性沉淀，将核酸 物质萃取出来；再向萃取液中加入适量乙醇，可 使DNA析出。氯仿异戊醇抽提和乙醇沉淀方法在 DNA纯化研究中非常常用，氯仿-异戊醇抽提的原 理是，氯仿可使蛋白质变性并加速有机相与液相 分层；异戊醇有助于消除抽提过程中产生的气泡。 而DNA不溶于乙醇等有机溶剂，因此可以通过乙 醇沉淀来纯化和浓缩DNA。
实验原理—DNA鉴定
DNA是由脱氧核糖核苷酸单体构成，其组成部分包括磷酸、 有机碱（嘌呤与嘧啶）、戊糖（脱氧核糖）。
1）磷酸
钼酸铵
磷钼酸
Vc 或 氨基萘酚磺酸 钼蓝
（显蓝色） 2）嘌呤碱
硝酸银
嘌呤银化合物（灰褐色、絮状）
3）脱氧核糖 蓝色化合物
硫酸
ω-羟基-γ-酮基戊醛
二苯胺
实验试剂 1. 含有0.14 mol/L NaCl的0.015 mol/L柠檬酸 钠溶液 2. 1mol/L NaCl溶液 3. 氯仿-异戊醇（24 : 1, V/V） 4. 95%乙醇 5. 氨水溶液 6. 5% AgNO3溶液
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10.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃ 或–20℃保存备用。
11.吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。
【注意事项】
标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整。
所用EP管、吸嘴等器物及ddH2O、试剂 等应高压灭菌，操作尽量在4℃以下进行。 混匀试剂、吸取上清等操作时应避免动 作剧烈。 弃异丙醇时动作应轻，切忌甩干，以免 DNA丢失。
动物细胞基因组DNA的 提取及定量
真核细胞基因组DNA的分离纯化
核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中
都以与蛋白质结合的状态存在。
真核生物的染色体DNA为双链线性分子.
大多数生物体内RNA分子为单链线性分子
分离纯化核酸总的原则：
应保证核酸一级结构的完整性 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 无其他核酸分子的体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝 状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。
4.加等量的酚·氯仿·异戊醇振荡混匀，
离心12000 rpm，5min。
5.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿·异戊
醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。
6. 取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L
3. 对于很稀的核酸溶液，可用荧光光度法进行测 定。核酸经凝胶电泳后，在ＥＢ（溴化乙锭）中 浸染，核酸分子与溴化乙锭结合后， 能吸收300360nm波长的紫外光，同时诱发出波长为590nm 的红橙色荧光，从而可通过照像机摄影，凝胶成 像系统记录实验结果。此方法灵敏度高，10ng或 更少的DNA即可检出。
一、实验目的
掌握DNA定量的原理 掌握紫外分光光度仪的正确使用。
二、实验原理
1.
核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟环 和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有 特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的 浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶 液浓度提供了基础。
2. 紫外分光光度法还可通过测定260nm和 280nm的紫外线吸收值的比值（A260/A280） 估计核酸的纯度，纯的DNA制品的比值为1.8， RNA的比值为2.0, 若DNA高于1.8,则可能有 RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比 值较高说明有残余的盐存在。
应去除RNA分子）。
分离核酸 应注意以下几点：
减少化学因素对核酸的降解
减少物理因素对核酸的降解
防止核酸的生物降解：
核酸提取的主要步骤：
破碎细胞，去除与核酸结合的蛋白质以及
多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需 要的核酸分子，沉淀核酸以去除盐、有机 溶剂等杂质，最后得到纯化的核酸。
实验步骤
1.
2.
取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3）， 尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的 细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入 1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （50ug/ml） 20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴 30min。 匀浆后的液体700ul，离心12000rpm, 5min， 取上清液入另一离心管中
乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀 2min ，离心12000 rpm ,10min。
7.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上， 将附于管壁的残余液滴除掉。
8.用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。 9.小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上， 将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。