QIAGEN试剂盒——动物组织样品DNA提取方法
动物基因组DNA的提取流程总结
动物基因组DNA的提取1.切取组织5g 左右，用组织粉碎机或研钵将细胞分离。
注：1）少量结缔组织并不影响最后得到的DNA勺质量；2）若标本为血液，则只需肝素抗凝、离心后取白细胞层；3）若为培养的贴壁细胞，则用胰酶消化后收集，PBS洗涤即可。
2.加入5ml DNA提取缓冲液，（10mmol/L Tris-CI ,0.1 mol/L EDTA 0.5% SDS）, 混匀。
注：1）最好先加入Tris-Cl、EDTA再加入SDS 2）最好一边匀浆，一边加入液体，使之充分混匀。
3.加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml，混匀，37C温浴过夜。
注：1）致密组织（如小鼠尾巴）可以适当延长蛋白酶的作用时间；2）若组织量很大且组织比较疏松（如动物脾脏），或对所提取的DNA完整性要求不高时，可以不用蛋白酶K,而是剧烈振荡20分钟，将组蛋白与DNA分离。
此法可能会使部分DNA链断裂，但足以达到一般实验要求，并不影响后续处理；3）也可同时加入RNase。
4.加入等体积的酚－氯仿－异戊醇混合物（25:24:1），剧烈振荡10分钟，冰浴10 分钟，2500rpm 10 分钟离心收集水相。
注：不要混带中间蛋白层。
5.加1/10 体积3mol/L NaAc 及 2 倍体积冰预冷的无水乙醇，颠倒混匀。
冰浴1小时，沉淀DNA注：冰浴时间从10分钟到2小时均可，只是时间太短会影响到最后的产量，但不影响质量。
6.用玻棒轻搅钩出DNA沉淀，置于另一离心管中。
注：如果确信没有混入蛋白，也可用离心的方法去除液体，但应在加入蛋白酶K的同时加入RNaseA7.70%^醇洗涤，晾干，加适量TE或灭菌水溶解，-20 C保存。
注：若要长久保存DNA（数年以上），最好将其沉淀以无水乙醇封闭后，置于-80 °C。
动物dna提取方法
动物dna提取方法
动物DNA提取方法包括以下步骤：
1. 收集样本：根据研究需要，采集动物的血液、组织、羽毛、皮肤、毛发等组织或部位。
2. 细胞破碎：将收集到的样本用研钵和手持式研磨器、或涡流破碎机等方法进行细胞破碎。
3. 细胞裂解：加入细胞裂解液，如十二烷基硫酸钠等将细胞膜溶解，释放DNA。
4. DNA沉淀：加入高浓度的盐和酒精，使DNA从裂解液中沉淀出来。
5. 加入洗涤剂：加入洗涤剂，如乙二胺四乙酸二钠，用水洗去沉淀物中的盐和酒精，以净化DNA。
6. 细胞裂解后的沉淀：用离心管沉淀下来，用无菌净水溶解，即可得到高质量的DNA。
7. 等电聚焦电泳：最后，可以进行等电聚焦电泳，用电泳系统跑出DNA条带，以检测DNA的质量。
测序QIAGEN提取DNA步骤
一、试剂盒法精提DNA1、先用1ml生理盐水（NS）洗菌，使管内抗原在NS中充分混匀，8000rpm，3min 离心，弃上清，只留沉淀。
2、向管中加180ul的ATL和20ul的蛋白酶K，混匀，放入56℃金属浴（带摇匀功能的金属浴箱）3h。
3、如要去除RNA，向体系中加4ul的RNA酶，震荡，室温离心2min，使液体全部进入管内，向样品中200ul的AL，混匀，震荡，在金属浴中放置10min（70℃）之后离心。
或4、如不去除RNA，则直接向样品中加200ul的AL，震荡混匀，在金属浴中放置10min（70℃）之后离心。
5、加200μl的乙醇（96%～100%），混匀后短暂离心，将盖上液体离下（全部体系包括沉淀全加柱子上）。
6、全部管内的液体及白色沉淀都加入所试剂盒提供的带柱子的管中。
注意不要碰到管的边缘，盖好管盖，8000rpm离心1min，之后将柱子转移到新的管中（试剂盒提供）。
7、向柱子中加500ul的AW1，盖好管盖离心（8000rpm，1min）之后将柱子转移到新的管中（试剂盒提供）。
8、向柱子中加500ul的AW2，盖好管盖最大转速离心（13800rpm，3min）。
9、换普通的EP管，最大转速下空离3min，确保杂质都不留在柱子上。
10、换普通EP管，开盖晾5~10min，向柱子加200μl的AE，室温放置1min，离心（8000rpm，1min）。
11、在分光光度计上测所提取核酸的浓度。
使用ND-1000V3.2.5软件测DNA浓度（Nucleic Acid）。
在使用分光光度计前用O启该软件的使用，以后每次加样时用纸沾干净之前所加样品。
用溶解核酸ddH2的溶剂调 Blank，使之显示读数为0。
之后加样测浓度（注：每次加样时都要在混匀器上将样品充分混匀。
）测好浓度后在管盖及管壁标明编号、日期和所测核酸的浓度。
必要时电泳看是否真正的提出了核酸。
12、将所提核酸保存在-20℃的冰箱中备用.可以再用水溶一次，水溶模板用于多重PCR鉴定；AE溶模板一般用于测序。
动物组织基因组DNA提取
动物组织DNA提取1样品预处理取新鲜组织25-50mg（组织不宜过多，否则裂解不完全堵塞离心柱），组织剪碎或者切成小块，放入预冷研钵，快速加入液氮用力研磨，或直接放入匀浆器中匀浆。
冻存组织同样使用研钵研磨或匀浆器快速用力研磨或匀浆（冻存组织避免反复冻融，使细胞破碎，内源酶外泄影响基因组DNA提取）2.加入100ulPBS到研磨好的样品中，样品均匀悬浮于PBS3.加600ul的Lysis Buffer，颠倒混匀，如需消化RNA，可加入20ulRNase A，颠倒混匀，室温放置5min4.加入10ul ProteinaseK，混匀，56度水浴45-60min，（颠倒混匀数次，裂解完全液体则清亮粘稠，此步骤可过夜）5 .12000rpm 离心10min，上清转入新的离心管，加800ul无水乙醇，混匀6.液体分次转入离心柱（一次加不完可分次加入），12000rpm 离心1min，弃废液。
7.加入700ulWash bufferA（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
8. 加入700ulWash bufferB（用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
9.加入500ulWash bufferB，12000rpm 离心30s-1min，弃废液。
10.再次12000rpm 离心2min，将离心柱置于心得离心管中，打开离心柱盖，于室温或37度恒温箱放置5-10min，直至无明显乙醇味。
11.在硅基质膜中央加入50-200ulTEbuffer（事先预热55-65度）置于室温2-5min，12000rpm 离心30s。
12. 离心得到的溶液再次加入离心柱中，室温放置2min，12000rpm 离心2min，所得溶液为纯化后的基因组DNA.纯化效果检测：取2-5ulDNA产物，0.7%agarose电泳检测DNA分子的完整性和紫外分光光度计检测浓度和纯度。
DNA提取步骤中文版
一DNA的抽提QIAGEN试剂盒。
1 标记1.5mlEP管吸取20ul蛋白酶K加入1.5mlEP管底部。
2 加入200ul血清至1.5mlEP管。
若血清不足200ul可加适量PBS补充。
余血清-20℃保存3 加200ul缓冲液AL至样品管震荡混匀15s。
4 56℃孵育10min。
5 稍微离心将EP管壁上的液体离心下去。
6 加200ul无水乙醇至样品管中震荡混匀15s稍微离心。
7 混合液转移至QIAamp螺旋住置于2ml收集管上小心勿沾湿边缘。
加样器垂直于螺旋住将混合液慢慢加至滤膜中间。
关盖标记8000rpm离心1min。
再将QIAamp螺旋住转移至一个清洁的2ml收集管内弃含滤液的收集管。
8 打开QIAamp 螺旋柱加入500ul缓冲液AW1勿沾湿边缘。
关盖8000rmp离心1min。
再将QIAamp柱转移至一个清洁的2ml收集管内弃含滤液的收集管。
9 打开QIAamp柱加入500ul缓冲液AW2勿沾湿边缘。
关盖全速12000rpm离心3min。
10 标记1.5ml离心管将QIAamp柱置于一个清洁的1.5mlEP管弃含滤液的收集管。
打开QIAamp柱加入50ul缓冲液AE。
室温孵育3min。
12000rpm离心1min。
继续下一步实验操作或-20℃保存。
二目的片段的扩增第一轮PCR 反应体系30ul要有一个阳性对照和一个阴性对照n个标本10×Buffer 3n ul dNTP200ul/ml 3n ul primer 上游引物0.3n ul 下游引物0.3n ul Taq酶0.5n ul H2O 20n ul 模板DNA 3 ul 反应条件94℃1min 94℃20sec 55℃20sec 72℃1min20sec 反应35个循环注意配体系时先配总反应体系混匀分装后再加标本一管一枪头。
防止污染。
配置体系要在超净台内操作。
4.第二轮PCR 反应体系50ul取第一轮PCR产物另加一空白管做阴性对照即有二个阴性对照若出现污染可以据此判断是那一轮PCR污染。
DNA提取方法
DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒中文操作说明书作者: Allanflying (站内联系TA) 发布: 2012-09-11一．利用DNeasy® Blood & Tissue试剂盒提取样本总DNA1．前处理：注意：1）石蜡包埋组织的DNA一般小于650bp，还要视样本类型与保存年限而定。
2）固定剂一般为福尔马林或酒精。
不推荐用蛾酸固定的样本。
3）溶解时间随样本类型和溶解状态而定。
4）产量视样本类型和保存年限而定。
推荐用50-100ul的AE缓冲液洗脱纯化的DNA。
5）开始前要预热孵化器或水浴锅至37℃，用于操作步骤9）。
1.石蜡包埋组织的前处理操作步骤：1）将小片石蜡包埋的组织（小于25mg）放入2ml离心管中（自备）。
2）加入1200ul的二甲苯，用力涡旋震荡。
3）最大转速室温（15-25°）离心5分钟。
4）移液枪吸去上清。
小心不要吸去沉淀。
5）往沉淀中加1200ul的（96-100%）酒精（目的是洗去剩余二甲苯），轻柔地震荡。
6）最大转速室温（15-25°）离心5分钟。
7）移液枪吸去上清。
小心不要吸去沉淀。
8）重复一次步骤5-7。
9）37°孵育10-15分钟，孵育过程打开离心管盖，直到酒精蒸发干净。
10）加入180ul的ATL缓冲液，继续提取组织总DNA中的步骤2。
2．福尔马林组织的前处理操作步骤：1）用PBS润洗组织样本（小于25mg）两次（目的是去除固定剂）。
2）去PBS，继续提取组织总DNA中的步骤1.2．动物组织总DNA的提取注意：1）ATL缓冲液和AL缓冲液可能存储后沉淀，如果沉淀，在56°孵育直至沉淀溶解。
2）在AW1缓冲液和AW2缓冲液中加入一定量（见瓶身）的（96%-100%）酒精，然后才使用。
3）打开水浴锅至56℃，用于步骤2。
4）如果是冻存的样本，拿出来室温预热，避免反复冻融。
试剂盒DNA提取详细操作步骤
试剂盒DNA提取详细操作步骤一、试剂盒打开后需要准备的工作1、Proteinase K（蛋白酶K）的溶解①取4.5ml双蒸水加入蛋白酶K粉中使其充分溶解②将溶解好的蛋白酶K溶液分装进小离心管，每管100u l～200ul③将分装好的Proteinase K放入-20℃冰箱中保存，使用期限为12个月2、组织抑制剂（Inhibitor Removal buffer）的调配加入20ml无水乙醇（absolute ethanol）颠倒混匀并在空白方框处打钩3、洗液（wash buffer）的调配加入80ml无水乙醇（absolute ethanol）颠倒混匀并在空白方框处打钩二、组织DNA提取（试剂盒）1、组织样品处理与消化①将采集来的样品剪碎（≤0.1cm）洗净保存液。
②加入组织破解液Tissue-lysis 200ul 蛋白酶K 40ul然后放入55℃水浴锅内3个小时使其充分消化。
2、DNA提取①在消化好的组织样品中加入结合液binding buffer 200ul 然后放入70°水浴锅中10分钟。
②再加异丙醇100ul 混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000g一分钟。
③倒掉底液，加500ul组织抑制剂Inhibitor Removal 然后离心倒掉底液④加洗液washing buffer500ul离心（洗液加两次）⑤在70℃预热Elution Buffer，然后将洗好的柱体下部分丢掉，换新的离心管加入Elution Buffer200ul溶解10分钟离心保留底液放-20℃保存。
三、细胞DNA的提取（试剂盒）1、组织样品处理与消化①将带有培养基的样品用PBS清洗干净8000rpm/1min离心，倒掉上清②加PBS200ul振荡摇匀使之样品成为单个细胞的悬浊液③加200ul Binding Buffer，40ul蛋白酶K 混合均匀放入70℃水浴锅内消化10分钟。
2、DNA提取①加异丙醇100ul 混合均匀吸取上清液放入柱体中，然后离心8000g一分钟。
动物源性基因组DNA提取试剂盒说明书
动物源性基因组DNA提取试剂盒说明书试剂盒简介本试剂盒可用于多种动物源性基因组DNA的提取，将处理好的样品通过裂解后加入到纯化柱内高速离心，核酸可以特异性结合在吸附柱内，通过洗涤液处理可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物，获取高纯度、质量稳定的DNA。
试剂盒用途本试剂盒适用于饲料、多种动物细胞和动物组织等样品的动物源性基因组DNA提取与纯化。
试剂盒组成（50T/Kit）注：请自备无水乙醇（分析纯）储存条件及有效期蛋白酶K于-20 ℃保存，其余组分均室温保存。
有效期一年。
注意事项1.当缓冲液DA、DB及洗液1于低温保存时，可能会有沉淀析出，将试剂瓶于室温下放置一段时间，使析出物充分溶解并混匀即可。
2.缓冲液DA、DB及洗液1中含有胍盐，与次氯酸钠、漂白液（粉）以及酸性液体混合会产生毒性气体，切记不能将两类液体倒在一起。
3.如样本脂类含量过高，影响操作，可在操作步骤1结束后用等体积氯仿抽提一次，避免脂类对后面操作的影响。
4.所有离心步骤室温下进行即可。
5.为了避免外源DNA酶或细菌降解DNA提取物，操作时请戴口罩和手套。
准备工作13 ml洗液1浓缩液加入17 ml无水乙醇；7ml洗液2浓缩液加入23 ml无水乙醇。
操作步骤1. 样品处理1.1 饲料：将饲料充分研磨粉碎后，称取50 mg样本加入到1.5 ml洁净的离心管中，加入300μl缓冲液DA、20 μl蛋白酶K溶液。
振荡混匀后56 ℃水浴1 h，每隔10~15 min取出颠倒混匀一次。
1.2 动物细胞或组织：剪取不超过50 mg样本加入到1.5 ml洁净的离心管中，用研磨棒充分研磨，加入300 μl缓冲液DA、20 μl蛋白酶K溶液。
振荡混匀后56 ℃水浴1 h，每隔10~15 min取出颠倒混匀。
2. 向处理好的样品加入400 μl的缓冲液DB，振荡混匀后70 ℃水浴10 min后，12 000 rpm离心3 min。
取400 μl上清液到新的1.5 ml洁净的离心管中。
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QIAGEN试剂盒提取组织DNA
试验前的注意事项
1、仔细阅读试剂盒使用说明。
2、所有的离心操作应在15-25℃下完成。
3、涡旋一般进行5-10s。
4、对于福尔马林或石蜡浸泡过样品，另见说明。
5、总RNA提取另见说明。
试验准备
1、Buffer ATL 和 Buffer AL保存时可能会出现沉淀，如果必要的话，可置于56°C 水浴至完全溶解。
2、提供的Buffer AW1 和 Buffer AW2是高浓度液，使用前需用96-100%的乙醇稀释至瓶子上注明的使用浓度。
3、预备一个热的振荡器或摇床或摇动的平板至56°C备步骤2使用。
4、如果为冻存的组织，需要将其溶至室温。
但是要避免此类的反复溶解。
应额外准备的物品：
200μL枪及枪头；20μL枪及枪头；2mL的微量离心管；96-100%乙醇；56℃水浴锅；离心机（20,000×g(14,000rpm)）；小镊子；振荡器
操作步骤：
1、取25mg的动物组织（脾脏最多10mg）粉碎成碎片放入1.5ml的微量离心管中。
对于啮齿类的尾巴，择取两只小鼠或一只大鼠尾巴0.4-0.6cm。
加入180μL buffer ATL，并将对应的动物作以标记。
（保证足够量的组织样本，对于脾脏由于其细胞含量丰富，我们建议不超过10mg。
我们强烈建议将组织粉碎以便于溶解提取DNA。
最好的方法是在添加bufferATL和蛋白酶K之前置于液氮中冻融。
同时，也可以采用QIAGEN公司产的几种组织匀浆机进行组织粉碎）
2、加入20μL蛋白酶K，涡旋混合均匀，56℃孵育直至溶解。
在组织溶解的过程中不断（偶尔）涡旋使组织充分散开，或将该微量离心管置于摇晃的平台上，如摇床等。
（不同组织溶解时间不同，通常组织为1-3h，小鼠尾巴为6-8h。
如果试验条件许可，可以溶解过夜，其不会影响DNA提取）
3、涡旋15s。
加入200μL buffer AL 并涡旋使充分混匀，70℃孵育10min，然后加入200μL乙醇（96%-100%），再次涡旋混合。
（如果在做多个样品时，可以将buffer AL和乙醇先混合均匀，一起加入到组织中涡旋均匀。
在添加bufferAL与乙醇后可能会出现白色沉淀，该沉淀不会影响试剂盒的操作。
一些组织（如脾脏）添加了bufferAL与乙醇后出现凝胶状产物，这种情况下，我们建议剧烈摇晃或涡旋样本使之消失。
70℃孵育10min该步骤在我在河南农大用的盒子操作中没有）
4、移出步骤3中的混合物（包括沉淀物）至DNeasy Mini spin column，该柱子放在一2mL收集管中（本试剂盒提供的）。
6000 × g(8000 rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液。
13000 rpm
5、将DNeasy Mini spin column放入另一2mL的收集管中（本试剂盒提供），加入500μLbuffer AW1，6000×g (8000 rpm)离心1min，收取管子，弃去滤液。
6、将DNeasy Mini spin column 放入另一2mL的收集管中（本试剂盒提供），加入500μLbuffer AW2，20,000 ×g (14,000 rpm)离心3min，使Dneasy膜干燥，收取管子，弃去滤液。
（使DNeasy Mini spin column膜干燥是非常重要的，因为残留的乙醇会影响下面的反应。
这个离心步骤就是为了确保没有残留的乙醇影响下步的洗脱。
离心后，小心地取出DNeasy Mini spin column防止其与下边的滤液接触。
如果与下边的滤液接触沾了少量乙醇则需要再次20,000×g(14,000rpm)离心1mim）
7、向DNeasy Mini spin column膜移入1mL或2mL的微量离心管中（本试剂盒不提供）直接加入200μL buffer AE，清洗DNeasy Mini spin column膜，室温孵育1min，然后6000 × g(8000 rpm)离心1min。
（为了DNA浓度可将200μL buffer AE改为100μL，但是这样会减少DNA的总产量）
8、推荐：如果需要获取最大量的DNA，可将步骤7重复1次。
（使用一个新的1mL或2mL的微量离心管，这样可防止降低前者DNA浓度。
当然也可以使用前者离心管）
注意：洗脱液不要多于200μL，以防止滤液过多与DNeasy Mini spin column发生接触。