3 第三章 免疫原和抗体的制备

四、试血
免疫3-5次
效价测定
效价合格
采血 (末次免疫5-7天及时采血)
效价不合格 补充免疫
颈动脉采血法：家兔、绵羊、山羊
心脏采血法： 家兔、豚鼠、大鼠、鸡
静脉采血法： 家兔、山羊、绵羊
免疫血清是成分复杂的混合物，
除有特异性和非特异性抗体，还有各 种蛋白成分。 纯化目的是除去这些不相关成分， 防止抗血清中其他杂抗体及蛋白干扰
混 合
鉴定
弗氏不完全佐剂
卡介苗
终浓度2～20mg/ml
完全乳化
弗氏完全佐剂
抗原
•作用大于不完全佐剂;局部形成肉芽种和溃疡;不能用于人体
乳化方式：
• 研磨法：
易乳化，但抗原或佐剂用量大。
• 搅拌混合法：
无菌操作，节省抗原或佐剂，但不易乳化完 全。
4.脂质体
包封抗原后，可使抗原延缓释放，并且脂 质体有刺激机体免疫反应的作用。
3.冰冻干燥保存：可保存5～10年
举例：抗人白蛋白的制备
• 1、抗原的准备：
分别抽取数人全血，分离血清并混匀；
分离制备白蛋白(请问可用哪些方法？)
• 2、佐剂的准备：
福氏不完全佐剂：称取羊毛脂5g，逐滴加入石 蜡油20ml高压灭菌后4℃保存备用。 福氏完全佐剂：于不完全佐剂中加入 2~20mg/ml卡介苗，研钵中钵磨乳化后即成为完全 佐剂，冰箱保存备用。
• 方法：在一定的条件下，能消化细菌和组
织细胞。
• 特点：①此法适用多种微生物；
②具有作用条件温和；
③内含物成分不易受到破坏；
④细胞壁损坏的程度可以控制。
• 原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条
件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，
使膜的渗透性改变或使之溶解。 • 常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、 二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯 （非离子型）、新洁尔灭等。 • 应用：①破碎细菌，且作用比较温和；
适龄、健壮、无感染正常动物、体重合乎要求；
3.抗原性质:酶类—豚鼠；甾体激素—家兔 4.血清用途: R型:等价带宽,适于诊断试剂.用家兔免疫产生. H型:等价带窄,适于免疫治疗.用马免疫产生.
5.抗血清需要量选择:
三、免疫动物
二）、免疫方法
1.免疫剂量：
1)不能过大或过小，否则产生免疫耐受；
2)首次免疫剂量不宜过大
第三章
免疫原和抗体的制备
概要
• 第一代抗体：多克隆抗体 • 第二代抗体：单克隆抗体 • 第三代抗体：基因工程抗体
第一部分 多克隆抗体制备
英文全称：polyclonal antibody,PcAb 定义：它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖
分化所产生的抗体，是多种抗体的混合物。
如何制备？是通过给动物接种抗原所获得的免疫血 清或抗血清。
一) 佐剂的种类
用于人体的佐剂：氢氧化铝、明矾、poly I∶C、胞壁酰二肽、细胞因子、热休克蛋白 常用于动物实验的佐剂：弗氏佐剂
(Freund’s adjuvant)
1.氢氧化铝佐剂：
5%硫酸铝
强烈搅拌
氢氧化 NS 洗 5%氢氧化钠 二次 铝沉淀 NS 制成悬液 即为佐剂
等体积抗原
免疫接种
2.明矾佐剂
5.细胞因子
其与抗原合用，可更有效地激发机体的免
疫功能，增强免疫反应。IL－2、IL－1、
IFN等都是良好的佐剂。
1.改变抗原的物理性状，使抗原在体内滞留 或延缓释放，延长抗原与免疫细胞作用的时 间，从而增强抗原免疫原性。 2.抗原在佐剂的辅助作用下，更易被巨噬细 胞有效吞噬和有效的加工处理和呈递。 3.刺激单核－巨噬细胞活化，释放细胞因子 调节和增强淋巴细胞的应答能力。 4.刺激淋巴细胞增生分化，从而增强和扩大 免疫应答能力。
• 6、试血： 第21-24天，从耳静脉采血0.5-1ml， 分离血清，测效价达 1：16以上即可收集 血清。如效价不高，可追加免疫。
• 7、加强免疫：
耳静脉注射人血清0.5ml左右以加强免 疫，一周后再免疫，如此重复一两次，并 于最后一次注射一周后采血测效价。
法纯化抗原，极难将某一抗原成分分 离出来。 • 应用：用于少部分大分子抗原IgM、 C1q、甲状腺球蛋白、载脂蛋白A、B等。 不适于中、小分子量蛋白质。
转速大于20000r/min
•
原理：白蛋白可溶于半饱和的硫酸铵溶液中，
而球蛋白则沉淀析出；该达到饱和时，白蛋白也析 出，因此不同饱和度的硫酸铵或硫酸钠，可将白蛋 白和球蛋白分离。 • 方法：用50、33%的硫酸铵分次提取，即可获 得丙种球蛋白(含IgG 95%以上) 。
•
•
特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。
应用：在大量制备中先用此法粗提，再纯化。
3．凝胶层析法（凝胶过滤法）
•原理：利用凝胶的多孔网状结构， 大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分
子进入网孔，难于洗脱，将抗原分为
大、中、小三种。属区带分离法。
• 特点：是根据分子大小分离蛋白质 混合物最有效的方法之一。
抗原 NS搅拌 氢氧化钠校正pH值至6.5 沉淀 NS洗 二次 离心 乳状悬液
10%硫酸钾铝
防腐剂
备用
* 明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射
易引起肉芽种和脓肿。
3.弗氏佐剂(Freund adjuvant) 乳剂不散
液体石蜡
＋
1 ~ 5 1 :
羊毛脂 一滴乳剂 抗原
1:1 1:1
浮于液面 水中


4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好

亲和力测定主要有平衡透析法、酶联免疫法和放射分析法。 亲和力的高低是由抗原分子和抗体分子的结合位点、抗原决定簇之间立

体构型的合适度决定的。
1.4℃保存：可保存3～6个月 2.低温保存：-20～-40℃，可保存2～3年
抗体的保存浓度为20～30mg/ml为宜，加入1/10000的硫柳汞或 1/1000的叠氮钠防腐，并加入等体积的中性甘油，分装小瓶， 置-20℃以下低温保存。
②提取核酸时，常用此法破碎细胞。
返回
蛋白质、 多糖、脂 类、核酸
蛋白质
超 速 离 心 分 离
盐 析 沉 淀
凝 胶 过 滤
离 子 交 换 层 析
亲 和 层 析
1)．超速离心法
• 原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同，使具有不同沉
降速度的颗粒,处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目 的。
• 特点：用差速离心或梯度密度离心
O菌体抗原
二、可溶性抗原制备及鉴定
•可溶性抗原:
蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、
脂多糖、细菌外毒素和核酸 •来源:
组织、细胞或血液，其成分较复杂。
制备流程：
预处理 器官组织： 组织碎块
组织细胞：
细胞的破碎
血
液：
抗原的分离 及纯化 抗原的鉴定
返回
1、组织材料的预处理
组织必须是新鲜或低温保存的 洗去血迹 及污物 去除包 膜或结 缔组织
脏器进行灌洗
NS内含0.5g／L NaN3
冷浴中组织剪碎
组织碎块
1)高速捣碎法 物理法 2)研磨法 3)超声破碎法 4)反复冻融法 5)酶处理法
化学法
6)表面活性剂处理
1000r／min
组织碎块
装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液
2000r／min
上清液
澄清
去除细胞碎片 及微小组织
离心
15000r／min
取上清液
•特点：①操作简单，无需贵重仪器； ②多用于内脏组织的破碎。
原理：利用超声波的机械振动产生的压力足以
使细胞破碎。
方法：使用的频率从1kHz～20kHz不等的超声波
处理细胞，间歇进行，避免长期超声产热，导
致抗原破坏。 特点：①操作简单，重复性较好，节省时间； ②多用于组织细胞和细菌的破碎。
2.冻融法
3）.淋巴结内注射:
适宜于微量抗原(先用完全佐剂在足掌作基础免疫)。
3.免疫时间
1）.间隔约10-20 天（宜长、否则导 致免疫耐受）； 2）二次以后每次 间隔7~10天（过 长→刺激变弱→ 抗体效价不高。）
第 一 次
第 二 次
第 三 第 次 四 次
3)一般接种5-8次 4)半抗原的免疫间隔要求较长(30~40天)。 如 8次免疫后仍不产生抗体，则应更换 动物。
人
B
体
B
Ag
Ag
Ag
Ag
B
免疫血清制备机制
人 体
免疫原(及佐剂)的制备
抗血清的保存 抗血清的鉴定
免疫动物
试血
抗血清的纯化
采血收集血清
一、免疫原的制备
免疫原(immunogen)是能诱导机体产生 抗体并能与抗体发生反应的物质
一)颗粒性抗原的制备
二)可溶性抗原制备及鉴定
三)半抗原免疫原的制备
细胞抗原：绵羊红细胞 细菌抗原：菌体抗原、鞭毛抗原 寄生虫体抗原：虫卵
• 原理：因速冻缓融，细胞内冰晶的形成及
胞内外溶剂浓度突然改变而破坏细胞。
• 方法：将待破碎的细胞置-20℃冰箱内冻 结，然后室温融化，如此反复3-4次，大部 分组织细胞及细胞内的颗粒可被融破。 • 特点：此法适用于组织细胞，对微生物细 胞作用较差。
1.酶 处理法
• 常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等
• 3、抗原-福氏完全佐剂的制备：
取混合人全血清，用生理盐水作1：4稀释。 将稀释血清与完全佐剂1：1体积的比例混合，制 成油包水状态。
研磨法：
取完全佐剂置无菌和研钵中，然后逐滴加入 稀释混合人血清，边加边研磨，直至滴一滴至水 中不散开为此，此即完全乳化的油包水状态。
• 4、动物选择： 健康成年家兔，雄性，体重2-3kg。 • 5、动物免疫： 第一次：两后足掌分别注射抗原－福氏 完全佐剂0.5ml。 第二次：第14天 在双后腿窝或蹊部可 摸到肿大淋巴结，在每侧肿大淋巴结中各 注射0.5ml。