拟南芥油菜素内酯合成关键酶DWF4的功能研究
拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建
^8S^•研究报告・拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建韦春，杨莉琴，秦利军(贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室/生命科学学院,贵阳550025)摘要BRs(Brassinostcroids)是植物体内一种重要的类固醇激素，具有十分重要的生理功能。
DWF4是BRs生物合成的关键限速酶，显著影响BRs在植物体中的含量。
本研究以拟南芥(Araiidopsis thaliana)为材料，利用同源克隆技术从A.thaliana cDNA中克隆到全长为1542bp的特异性条带，测序结果表明该条带为ADWF4基因；生物学信息分析显示该基因可编码513个氨基酸(amino acid,aa),Proscalc在线预测该蛋白为亲水性蛋白，且SOPM分析表明DWF4蛋白含有c-螺旋(alpha-helix)、/?-折叠(beta-fold)、/?-转角(beta-angle)等多个二级结构。
同时，研究还构建了含AtDWF4基因的超量表达载体pRI201-RdI)wf4,并遗传转化烟草K326,已获得抗性愈伤组织及抗性芽。
本研究为进一步探究过表达ADWF4基因对烟草形态及抗逆胁迫能力的影响提供理想的实验材料。
关键词：拟南芥；BRs；DWF4基因；过表达载体构建DOI：10.16590,/ki.1001-4705.2021.01.001中图分类号：Q943.2文献标志码：A文章编号：1001-4705(2021)01-0001-06Cloning and Bioinformatics Analysis of Arabidopsis thaliana DWF4Gene and Construction of ADWF4-Overexpression VectorWEI Chun,YANG Liqin,QIN Lijun(Institute of Agro-Bioengineering,Key laboratory of Plant.Resources Conservation andGermplasm Innovation in Mountainous Region(Ministry of Education)and College ofLife Sciences,Guizhou University,Guiyang550025,China)Abstract：BRs(Brassinosteroids)is an important steroid hormone in plants,which has very importantphysiological functions.The DWF4is a key rate-limiting enzymein BRs biosynthesis,which significantly affects the content of BRs in plants.In this study,Arabidopsis thaliana was used as the material to clone the objective band.The results showed that a1542bp band from A.thaliana cDNA wascloned and the sequencing results showed that the band was AtDWF4gene.Bioinformatics analysisshowed that this gene encoded513amino acid(aa),and Proscale online predicted that this proteinwas a hydrophilic protein,and SOPM analysis showed that DWF4protein contained multiple secondary structures,including tough-helix,format-fold,and format-angle,etc.Meanwhile,the overexpression vector pRI201-RdDwf4containing AtDWF4gene was also constructed,and the resistant callus and resistant buds were obtained after the genetic transformation of tobacco variety K326.ThispaperprovidesanidealexperimentalmaterialforfurtherstudyingtheinfluenceofoverexpressionofAtDWF4on tobacco morphology and stress tolerance.Key words:Arabidopsis thaliana;BRs;DWF4gene;overexpression vector construction收稿日期2020-08-26基金项目贵州省科技计划项目“因草钾离子通道蛋白及BR对植株抗非生物胁迫研究”(黔科合LH：2016]7449号)；贵大人才培育项目“由菜素内酯介导的烟草抗TMV机理研究”(黔科合平台人才：2018]5781号)作者简介：韦春(1995—),女(壮族)广西河池人；在读硕士，主要从事植物基因工程相关研究(E-mail：*****************).通讯作者：秦利军(1982—)男(汉族)贵州遵义人；博士，副教授，硕士生导师，研究方向：植物生物技术与植物基因工程(E-nail：leequine_chin@126.com)。
油菜素内酯调控植物生长发育及产量品质研究进展
油菜素内酯调控植物生长发育及产量品质研究进展摘要：油菜素内酯（brassinosteroid, BR）是一类新型植物生长素，通过调控植物生长发育及产量品质发挥着重要的生物学作用。
本文综述了油菜素内酯的生物合成途径、信号转导途径，以及油菜素内酯参与植物生长发育、产量品质调控的研究进展。
研究发现，油菜素内酯通过诱导表达生长调节基因（Growth-regulating factors, GRFs）、增强省慧芝蛋白（proline-rich EXT-like receptor kinase, PERK）的活性等途径，促进茎秆和叶片的早期生长、侧枝分生、花荚的发育和产量的提高。
同时，油菜素内酯还能够提高品质指标（如粗草酸含量、芥酸含量等）和抗逆性，通过调节植物雄性生殖器官发育，可以改善花粉活力和花粉管长度，从而提高花粉对不利环境的适应能力。
Abstract:Brassinosteroids (BRs) are a novel type of plant growth hormone, which plays an important biological role in regulating plant growth and development, and improving yield and quality. This paper reviews the research progress of BR biosynthesis pathway, signal transduction pathway, and the involvement of BR in regulating plant growth, yield and quality. It was found that BR could promote the early growth of stems and leaves, lateral branch generation, pod development and yield improvement by inducing gene expression of growth regulating factors (GRFs), and enhancing the activity of proline-rich EXT-like receptor kinases (PERKs). At the same time, BR could improve quality indexes (such as crude oil acid content, erucic acid content, etc.) and stress resistance. Through regulating the development of male reproductive organs, it could improve the vitality of pollen and the length of pollen tubes, and thus enhance the adaptability of pollen to adverse environments.Key words: brassinosteroid; growth and development; yield and quality; regulation; pathway1. 引言油菜素内酯是植物体内一类新型的甾体激素，可以促进植物生长发育及提高产量品质，同时还具有提高植物抗逆性等生理效应（Wang et al., 2016）。
油菜素内酯生物合成途径的研究进展
油菜素内酯生物合成途径的研究进展一、本文概述油菜素内酯（Brassinosteroids，BRs）是一类具有广泛生物活性的植物激素，对植物的生长、发育以及适应环境胁迫等方面发挥着重要作用。
自20世纪70年代被发现以来，油菜素内酯的生物合成途径一直是植物生物学研究的热点领域。
本文将对油菜素内酯的生物合成途径及其相关研究进展进行概述，以期为进一步理解油菜素内酯在植物生命活动中的功能和应用提供理论基础。
油菜素内酯的生物合成途径是一个复杂的生物化学过程，涉及多个酶促反应和中间代谢产物的转化。
近年来，随着分子生物学和基因组学等技术的发展，油菜素内酯生物合成途径中的关键酶和调控机制逐渐被揭示。
本文将从油菜素内酯的生物合成途径及其调控机制、油菜素内酯信号转导途径、油菜素内酯在植物生长发育中的功能以及油菜素内酯的生物技术应用等方面，对油菜素内酯生物合成途径的研究进展进行综述。
本文还将探讨当前研究中存在的问题和未来的发展方向，以期为油菜素内酯的生物合成途径研究提供新的思路和方法。
二、油菜素内酯生物合成途径概述油菜素内酯（Brassinosteroids，BRs）是一类具有广泛生物活性的植物激素，对于植物的生长发育、逆境响应以及代谢调控等方面发挥着重要作用。
近年来，随着分子生物学和代谢组学等技术的快速发展，油菜素内酯的生物合成途径得到了深入的研究。
油菜素内酯的生物合成途径主要包括甾醇侧链的修饰和环化两个主要阶段。
在甾醇侧链修饰阶段，植物中的甲瓦龙酸通过一系列酶促反应转化为菜油甾醇，这是油菜素内酯生物合成的前体物质。
随后，菜油甾醇经过多步氧化还原反应和甲基化修饰，生成具有C-22和C-23不饱和键的中间产物。
在环化阶段，上述中间产物通过细胞色素P450单加氧酶催化，发生C-22和C-23键的环化反应，生成油菜素内酯的核心结构。
随后，通过进一步的修饰和转化，生成具有不同侧链长度和取代基团的油菜素内酯类化合物。
油菜素内酯生物合成途径中的关键酶和调控机制也得到了广泛研究。
10_油菜素内酯生物合成与功能的研究进展zhuzq
植物学通报 2006, 23 (5): 543￣555* Author for correspondence. E-mail: hwxue@油菜素内酯生物合成与功能的研究进展储昭庆，李李，宋丽，薛红卫＊中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所植物分子遗传国家重点实验室, 上海 200032摘要 植物激素油菜素内酯广泛调节植物的生长发育及对外界环境因子变化的反应, 在作物上的应用也已引起人们的广泛兴趣。
通过遗传学等手段对相关突变体及功能基因的研究为其生物合成与功能研究提供了基础。
本文总结了油菜素内酯在植物各组织内的分布、生物合成、相关合成突变体及其编码基因的性质、生理功能以及与其它激素间的相互作用等。
关键词 油菜素内酯, 植物生长发育, 生物合成Advances on Brassinosteroid Biosynthesisand FunctionsZhaoqing Chu, Li Li, Li Song, Hongwei Xue *State Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, Institute of Plant Physiology and Ecology, ShanghaiInstitutes for Biological Sciences, Chinese of Academy of Sciences, Shanghai 200032, ChinaAbstract Plant hormone brassinosteroid (BR) acts as an important regulator in plant growth and development,and responses to environmental stimuli. BR also regulates the agritraits of many crops. Analyses on mutant phenotypes and gene functions provide the information on BR biosynthesis and physiological roles. This review focuses on the BR recent progresses of BR biosynthesis and metabolism, the underlying signaling pathways, and further the interplay with other hormones.Key words brassinosteroids, plant growth and development, biosynthesis多羟基化的甾醇类激素(steroid hormones)广泛存在于真菌类、动物和植物中。
敲除DWF4基因提高拟南芥对低温胁迫的抗性
江苏农业学报(Jiangsu J.of Agr.Sci.),2015,31(3):505~511h ttp://www.js n y x 夏金婵,何奕昆.敲除DWF4基因提高拟南芥对低温胁迫的抗性[J].江苏农业学报,2015,31(3):505⁃511.doi:10.3969/j.issn.1000⁃4440.2015.03.007敲除DWF4基因提高拟南芥对低温胁迫的抗性夏金婵1, 何奕昆2(1.河南中医学院基础医学院,河南郑州450008;2.首都师范大学生命科学学院,北京100048)收稿日期:2015⁃02⁃05基金项目:河南中医学院博士基金项目(BSJJ2010⁃35)作者简介:夏金婵(1978⁃),女,河南郑州人,博士,讲师,主要从事分子生物学研究㊂(E⁃mail)epsalon@ 摘要: 以拟南芥类固醇类C22α⁃羟化酶基因DWF4的T⁃DNA 插入缺失突变体dwf4为研究材料,通过观察突变体在低温胁迫条件下的表型,检测dwf4突变体和野生型在低温胁迫条件下的相对电导率㊁叶绿素含量㊁可溶性糖含量㊁脯氨酸含量㊁抗冷基因表达量和过氧化物酶基因表达量的区别,探讨了该基因在抗低温胁迫反应过程中的功能㊂结果表明,敲除DWF4基因能够提高拟南芥对低温胁迫的抗性㊂dwf4突变体的抗低温胁迫能力一方面源于在低温胁迫下,与野生型相比,dwf4突变体中相对较低的电导率和较高的叶绿素含量,以及更多渗透调节物质可溶性糖和脯氨酸的积累,另一方面源于低温胁迫条件下dwf4突变体中低温胁迫响应的下游基因RD29A 及COR47的高表达㊂结果还表明尽管dwf4突变体中过氧化物含量增加,但是过氧化物酶基因Prx22与Prx698的高表达对过氧化物的毒害起到了很好的抑制作用㊂说明在拟南芥中DWF4负调控拟南芥对低温胁迫的反应过程㊂关键词: DWF4基因;低温胁迫;COR47基因;RD29A 基因中图分类号: Q78 文献标识码: A 文章编号: 1000⁃4440(2015)03⁃0505⁃07Improvement of cold tolerance by knockout of DWF4gene in ArabidopsisXIA Jin⁃chan 1, HE Yi⁃kun2(1.School of Basic Medicine ,Henan University of Traditional Chinese Medicine ,Zhengzhou 450008,China ;2.School of Life Science ,Capital Normal U⁃niversity ,Beijing 100048,China ) Abstract : A T⁃DNA deletion mutant dwf4of Arabidopsis was used as material to investigate the role of DWF4gene in cold tolerance in plants by comparing the phenotypic performance and physioligcal characteristics between dwf4mutant and wild type seedlings.The dwf4mutant knockout of DWF4gene exhibited an increased tolerance to cold ness resulting from lower electrical conductivity,higher chlorophyll content,and higher concentrations of soluble sugar and proline and higher expression levels of RD29A and COR47compared with wild type.The higher levels of peroxidase genes Prx22and Prx698in dwf mutant effectively inhibited the harm caused by the increased reactive oxygen species.Taken together,it was suggested that DWF4gene might play a negative role in response to cold stress in Arabidopsis .Key words : DWF4gene;cold stress;COR47gene;RD29A gene 低温是植物经常遭受的一种环境胁迫因子,它限制作物的产量,影响植物的自然分布[1⁃2]㊂剖析植物对低温的应答反应机制㊁提高其抗低温能力在农业生产上具有重要意义㊂为了适应和抵抗低温胁迫,在长期进化过程中植物形成了相应的应答保护机制㊂目前,通过筛选和克隆的方法已得到了许多与冷驯化信号途径相关的基因,例如CBF ㊁COR ㊁KIN ㊁RD 等[3],对它们的功能分析为我们绘制了植物抗冷反应的信号传递网络,其中ICE1⁃CBF⁃COR 通路在植物的冷驯化过程中起重要作用㊂在冷驯化过程中,膜是最先受到505低温影响的细胞结构[4];低温诱导的质膜硬化可导致肌动蛋白细胞骨架的重排,诱导胞内Ca2+的瞬时增加[5];IP3作为重要的信号分子介导细胞内钙库储存的Ca2+释放到胞质,从而调控CBF和COR基因的表达[6]㊂ICE1基因编码一个MYB类型的碱性螺旋⁃环⁃螺旋(bHLH)转录因子,在上游调节CBF和其他转录因子的表达,提高抗冷性[7]㊂HOS1蛋白通过泛素化介导的蛋白质降解负调控ICE1[8]㊂在不依赖于CBF 的途径中,转录因子HOS9㊁HOS10㊁RNA修饰和核质转运在调节有关抗冷基因的表达和提高植物抗冷能力方面具有至关重要的作用[9⁃10]㊂植物对冷胁迫的分子反应机制已经成为目前科学研究的热门领域,近几年的研究成果为改良作物的抗冷能力打下了坚实的基础㊂有研究结果表明,一些植物激素也参与了植物的抗逆反应过程㊂脱落酸(ABA)能够提高低温条件下植物的抗氧化能力,降低过氧化物(ROS)的积累[11],诱导CBF基因的表达,但其表达量远远低于低温诱导的表达量[12]㊂外施油菜素内酯(BR)在植物的生长发育过程中也具有重要的调节功能,例如参与光形态建成,促进植物细胞的生长㊁分裂和分化等㊂BR不仅能够阻止低温对叶绿体的破坏,提高植物的抗冷能力,还能够恢复高盐胁迫条件下幼苗的生长状况[13],但是BR在植物抗逆反应过程中所起作用的分子机制还不清楚㊂拟南芥的DWF4基因编码一个类固醇类C22α⁃羟化酶,催化油菜素内酯的生物合成过程㊂该基因在植物活跃生长的组织中表达,例如根与茎的顶端组织以及根与茎的结合部位[14],表达量受乙烯和茉莉酸甲酯的调控[15],参与植物的抗高温反应过程[16],超表达DWF4的转基因植株表现出外加BR的特征,包括较长的下胚轴等[17]㊂本试验采用反向遗传学的方法,利用拟南芥DWF4基因缺失突变体dwf4,研究敲除DWF4基因后拟南芥对低温胁迫的响应,探讨该基因在抗低温胁迫反应过程中的功能㊂1 材料与方法1.1 植物材料和生长条件试验中所用的野生型拟南芥(Arabidopsis)和dwf4突变体均为Col⁃0生态型背景㊂在培养皿中无菌培养拟南芥,先对种子进行表面消毒,4℃同步化处理2~3d后,均匀地种在含有0.8%琼脂的1/2MS 培养基上,放在培养室中培养㊂培养室的培养条件:温度为22℃,光照度为100μmol/(m2㊃s),光周期为16h光照/8h黑暗交替㊂低温胁迫处理:在培养皿中生长21d的材料不经冷驯化置于-20℃中1h,4℃解冻12h,于22℃㊁16h光照/8h黑暗中恢复7d㊂1.2 生理指标的测定将在正常培养基上生长14d的野生型拟南芥和dwf4突变体幼苗移到4℃条件下处理2d,测定野生型拟南芥和dwf4突变体在低温胁迫下可溶性糖和脯氨酸含量[18⁃19]㊂在营养土中生长21d的野生型拟南芥和dwf4突变体幼苗,移到4℃条件下2d进行低温处理,测定叶绿素含量[20]㊂相对电渗透率的测定参考Ishitani等的方法[21],其温度处理过程为:初始温度为0℃,在此温度稳定30min后降至-1℃,-1℃维持1h 后加入碎冰,而后以2℃/h速度降温至-12℃,每一个温度梯度取1个样㊂将在正常培养基上生长10d的野生型拟南芥和dwf4突变体幼苗,移到4℃条件下进行低温处理2d,测定硫代巴比妥酸反应物(TBARS)的含量,测定方法参照文献[22]㊁[23]㊂1.3 实时荧光定量PCR在正常培养基上生长10d的野生型拟南芥和dwf4突变体幼苗,移到4℃条件下进行低温处理,分别在0h㊁12h㊁24h时取样㊂用TRIZOL试剂(Sigma,USA)提取总RNA,用AMV反转录酶(TaKaRa,Dalian)合成第一条cDNA㊂利用Agilent Strata⁃gene荧光定量PCR仪(Mx3005P)进行实时荧光定量PCR㊂荧光染料试剂盒采用SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa,日本),以稀释10倍的植物cNDA为模板㊂20μl PCR反应体系中含1×SYBR Premix Ex Taq㊁上下游引物各0.2μmol/L㊁2μl稀释的cDNA,使用UBQ10(Polyubiquitin10)作为内参对目标基因进行相对定量㊂2 结果2.1 DWF4基因调节拟南芥对低温胁迫的反应过程 DWF4(基因编号AT3g50660)位于拟南芥第3条染色体上,其中包含8个外显子和7个内含子,编码513个氨基酸[14]㊂为了进一步探讨DWF4的生物学功能,从拟南芥信息资源中心(The Arabidopsis Information Resource,TAIR)获得605江苏农业学报 2015年第31卷第3期DWF4基因的T⁃DNA插入突变体(SALK_ 020761),其插入位置在第4个外显子上㊂RT⁃PCR结果显示由于T⁃DNA的插入,DWF4基因被敲除(图1),将该突变体命名为dwf4㊂将在培养皿中正常生长21d的野生型与dwf4突变体置于-20℃处理1h,之后在4℃下解冻12h,再置于正常培养条件下恢复生长7d㊂我们发现dwf4突变体在受到低温胁迫后能够继续生长出新的叶片,而野生型拟南芥在受到低温胁迫后大多数叶片的叶绿素受到破坏而白化死亡(图2)㊂低温胁迫能够导致植物的细胞受到伤害,造成相对电导率的变化㊂相对电导率能够反映低温胁迫对细胞膜的伤害程度,是细胞膜在逆境条件下生理活性高低的重要指标之一㊂相对电导率低,说明细胞膜的损伤程度小,进而细胞受到的伤害就小,抗寒能力就强㊂我们发现野生型和dwf4突变体经过低温处理后其相对电导率都表现出增加的趋势,但是dwf4突变体的相对电导率比野生型的低,例如,经过-9℃低温处理,dwf4突变体的相对电导率为62%,而野生型的为75%(图3)㊂植物中叶绿体对低温胁迫相当敏感,低温胁迫会造成叶绿素的降解㊂在正常条件下,dwf4突变体的叶绿素含量比野生型的稍低,但是经过低温处理后野生型的叶绿素含量下降比较明显,而dwf4突变体的叶绿素含量变化不大,导致dwf4突变体的叶绿素含量比野生型的还要高(图4),说明dwf4突变体抗冷能力强㊂Tubulin1为内参基因㊂图1 DWF4基因在野生型(WT)与dwf4突变体中的表达Fig.1 Expression of DWF4gene in wild⁃type and dwf4mutant plants2.2 低温胁迫下dwf4突变体可溶性糖和游离脯氨酸含量变化 在逆境条件下,植物会积累一些渗透调节物质,图2 野生型拟南芥和dwf4突变体在低温处理前(左)和低温处理后(右)的表型Fig.2 The phenotypes of wild⁃type and dwf4mutant plants be⁃fore(left)or after(right)cold stress图3 野生型拟南芥和dwf4突变体在不同低温条件下的相对电导率Fig.3 Relative electronic conductivity of wild⁃type and dwf4 mutant plants induced by coldstress图4 低温条件下野生型拟南芥和dwf4突变体的叶绿素含量Fig.4 Chlorophyll contents of wild⁃type and dwf4mutant plants induced by cold stress例如可溶性糖和脯氨酸,用于平衡渗透压对胞质的损伤,调节细胞膜的稳定性,其含量的多少反映其抗逆能力的大小[21,24]㊂因此,测定植物体在低温胁迫705夏金婵等:敲除DWF4基因提高拟南芥对低温胁迫的抗性条件下可溶性糖和脯氨酸的含量,在一定程度上可以判断植物对低温胁迫的抵抗能力㊂从图5中可以看出,正常生长条件下dwf4突变体的可溶性糖与脯氨酸的含量都比野生型的高,分别是野生型的1.29与5.10倍㊂低温处理后dwf4突变体和野生型的可溶性糖含量均有所提高,但此时dwf4突变体的可溶性糖与脯氨酸含量仍然比野生型的高,分别是野生型的1.32和6.40倍㊂低温胁迫条件下,dwf4突变体中可溶性糖和脯氨酸的快速积累可能与相关的基因表达活跃有关㊂图5 野生型拟南芥和dwf4突变体在低温胁迫下可溶性糖(A)和脯氨酸(B)含量Fig.5 Soluble sugar(A)and proline(B)contents of wild⁃type and dwf4mutant plants induced by cold stress2.3 DWF4负调控RD29A基因和COR47基因的表达 为了进一步探讨dwf4突变体抗低温胁迫的分子机制,选择参与低温胁迫反应的CBF转录因子与下游基因RD29A和COR47,对它们的表达量进行分析㊂实时荧光定量PCR检测结果表明,CBF1㊁CBF2㊁CBF3的表达量在低温处理条件下升高,但在dwf4突变体与野生型中的表达量并没有明显区别(图6)㊂RD29A的表达量在突变体和野生型中都受低温胁迫的诱导,而且在突变体中的诱导表达量高,表达时间早㊂例如,在正常生长条件下,dwf4突变体中RD29A 的表达量是野生型的1.22倍,在低温处理12h时, dwf4突变体中RD29A的表达量是野生型中的1.40倍㊂在低温胁迫条件下dwf4突变体中COR47的表达量也高于野生型(图7),因此推测DWF4基因负调控RD29A和COR47的表达㊂2.4 野生型和dwf4突变体中过氧化物酶基因的表达差异 低温胁迫能引起植物体内活性氧的积累,从而对细胞造成伤害,抑制生长[11]㊂硫代巴比妥酸反应物(TBARS)含量是测定植物体内脂质过氧化和自由基形成的一个重要指标㊂为了验证低温胁迫条件下dwf4突变体抗氧化能力的强弱,我们检测了在不同条件下野生型和dwf4突变体中TBARS含量㊂结果表明,在正常生长条件下dwf4突变体中TBARS(以UBQ10作为内参)Fig.6 The expression levels of CBF gene of wild⁃type and dwf4 mutant plants induced by cold stress(UBQ10internalcontrol)含量比野生型中的高,低温胁迫能使拟南芥植株中TBARS含量升高,但dwf4突变体中TBARS含量仍高于野生型,即dwf4突变体中过氧化物的积累比野生型中的多(图8)㊂但是,dwf4突变体抵抗低温胁迫的能力却比野生型强,为此我们用实时荧光定量PCR检测了抗氧化防御系统相关基因表达水平的变化㊂过氧化物酶在清除植物体内过氧化物毒害方面起着重要作用,是植物抗氧化防御体系中的一个重要组成成分,参与抗逆反应㊂我们检测了过氧化物酶基因Prx22(AT2g38380)和Prx69(AT5g64100)805江苏农业学报 2015年第31卷第3期表达量的变化,发现在正常生长条件下,dwf4突变体中Prx22和Prx69的表达量就比野生型中的高(图8),这对低温条件下dwf4突变体中高含量的过氧化物所产生的毒害起到了很好的抑制作用㊂图7 野生型和dwf4突变体在低温处理下RD29A基因(A)和COR47基因(B)的表达量(以UBQ10作为内参)Fig.7 The expression levels of RD29A gene(A)and COR47gene(B)of wild⁃type and dwf4mutant plants induced by cold stress(UBQ10 as internal control)图8 野生型和dwf4突变体中低温条件下的TBARS含量(A)以及过氧化物酶Prx22与Prx69表达量(B)(以UBQ10作为内参)Fig.8 TBARS content(A)and the expression levels of peroxidase genes Prx22and Prx69(UBQ10as internal control)(B)in wild⁃type and dwf4mutant plants under cold stress3 讨论在世界范围内,低温是一个重要的环境因子,影响植物的分布,限制作物的产量㊂低温不仅能直接对细胞产生伤害导致植株的死亡,还可以造成氧化与渗透胁迫㊂为了克服这种限制因素提高农作物产量,研究植物抗冷反应分子机制,进而通过分子生物学手段提高农作物的抗冷能力,显得至关重要㊂本研究中我们第一次发现敲除DWF4基因能够提高拟南芥的抗冷能力㊂拟南芥dwf4突变体中,油菜素内酯(BR)合成过程中的一个限速酶C22α⁃类固醇水解酶发生缺失突变,导致突变体内油菜素内酯含量减少[17]㊂dwf4突变体表现为极度矮化㊁叶片圆而短小卷曲㊁侧根多且短㊁叶色深绿㊁下胚轴短且开花晚等特征㊂本试验发现缺失突变体dwf4的抗冷能力明显高于野生型㊂低温胁迫条件下dwf4突变体中高含量的可溶性糖和脯氨酸降低了细胞水势,有利于减少低温条件下渗透胁迫对植物的损伤㊂特别是脯氨酸含量,在正常生长条件下,dwf4突变体中脯氨酸的含量就是野生型的6.4倍,这与Strizhov等[25]的发现一致㊂油菜素内酯能够模拟黑暗对P5CS1⁃GUS表达的抑制,从而导致ABA处理或干旱胁迫下植株脯氨酸含量下降[25],而dwf4突变体中油菜素内酯含量低而导致细胞中脯氨酸含量升高㊂BR是一种新型植物激素,在植物体内含量极低,但生理活性很高,不仅对905夏金婵等:敲除DWF4基因提高拟南芥对低温胁迫的抗性植物的生长发育有影响,与植物抗性也有一定的关系,外用BR处理油菜和番茄植株可以增强它们的耐热性[26],还可以增强油菜和拟南芥的抗干旱和抗冻能力[27]㊂dwf4突变体体内油菜素内酯含量低而抗冻性强的分子机制可能与外施油菜素内酯后植株抗性增强的分子机制不同㊂Kagale等用BR处理拟南芥和油菜,发现CBF的表达量在拟南芥中只有微量变化,在油菜中根本没有变化,下游的RD29A㊁COR47基因表达明显高于对照[27]㊂我们也发现在低温条件下dwf4突变体中CBF基因的表达量与野生型中的并没有明显区别,而RD29A和COR47的表达则高于野生型,说明BR对植物抗冷能力的调控可能不依赖CBF转录因子而是通过其他因子影响下游基因RD29A和COR47㊂许多非生物胁迫,例如干旱㊁高盐㊁低温等,都可以诱导过氧化物的产生,对植物体造成氧化胁迫,损伤DNA和蛋白质分子,抑制植物正常的生长和发育[28]㊂研究发现,尽管DWF4缺失导致突变体中过氧化物含量的增加,但是dwf4突变体中高表达的过氧化物酶Prx22与Prx698,对过氧化物的毒害起到了很好的抑制作用,这2个基因都属于植物特有的过氧化物酶(Ⅲ)家族,我们推测该家族基因的高表达可能是dwf4突变体具有强抗冷能力的重要原因㊂同时,我们也注意到dwf4突变体的一些表型特征,例如下胚轴短㊁叶片圆而肥厚㊁叶色深绿等,一般在抗冻植物中多见,例如,过量表达CBF转录因子的植株[29]㊂野生型植株在低温下生长数日到数月也会表现出矮化㊁叶色深绿并且叶片增厚的特征[18],这也说明在正常生长条件下dwf4突变体中可能有抗冷相关基因的表达,我们的研究也证明在正常情况下dwf4突变体中RD29A基因的表达量就高于野生型㊂参考文献:[1] 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油菜素内酯的生物合成及信号转导研究进展
胞在形 成层 以外形 成 ， 与拟南芥 ｄ ｗ ｆ ７ — １ 突变体 的表型
种子发 芽 、 根茎 伸长生长 、 光形态 建成 、 维管束 分化 、 向性建 成和生殖 发育等发 育和生 长过程 中起 到重 大 的作用 ， 同时Ｂ Ｒ 还 具有增强植物抵 抗高温 、 低温和 高 盐等不 利生长条件 的功能 。
关键词 ： 油菜素 内酯； 生物合成 ； 信号转导 ； 进展 中图分类号 ： Ｑ９ ４ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ ４ — ９ ３ ２ ４ （ ２ Ｏ １ ５ ） １ ９ － ０ １ １ １ － ０ ２
油 菜 素 内酯 （ ｂ ｒ ａ ｓ ｓ ｉ ｎ ｏ ｓ ｔ ｅ ｒ ｏ ｉ ｄ ｓ ， Ｂ Ｒ） 作 为 一类 甾醇 类 激素 ， 在植物体 内广泛分布 。油菜 素内酯在植物 的
一
相 同。 另外突变体维管束 的数 目减少到６ 个， 而野生型 有８ 个。 Ｃ ａ ｎ ｏ — Ｄ ｅ ｌ ｇ ａ ｄ ｏ 等报道两个Ｂ Ｒ 受体Ｂ Ｒ Ｌ １ 和Ｂ Ｒ Ｌ ３ 在 导管组 织 中特异性表达 ，而且 突变体ｂ ｒ ｌ ｌ 表 现出异 常 的韧皮部／ 木质部分化 比率 。
１ ． 细胞伸长 。Ｂ Ｒ 可促进黄瓜 的下胚 轴 、 豌豆和绿 豆的上胚轴 、 单子 叶植物 的中胚轴 和胚 芽鞘及幼苗茎 的伸长 ， 植物幼嫩 的营养器官对Ｂ Ｒ 响应尤其 明显 。 Ｂ Ｒ
通 过调控植物细胞液泡膜Ｈ ＋ － Ａ Ｔ Ｐ ａ ｓ ｅ 的组装 ，促进液 泡吸收水分 ， 从而引起细胞 的快速伸 长生长 。Ｙ ａ ｎ ｇ 等
的研究 表明 ， 油菜素 内酯 的转 录因子 Ｂ Ｅ Ｓ １ 可直接与全 部 的拟南芥纤维素合成酶基 因的启 动子区域结合 ， 开
启这些基 因表达 。
胡杨油菜素类固醇激素合成酶基因DWF4(PeDWF4)和CPD(PeCPD)在拟南芥生长发育中的作用
胡杨油菜素类固醇激素合成酶基因DWF4（PeDWF4）和CPD（PeCPD）在拟南芥生长发育中的作用胡杨油菜素类固醇激素合成酶基因DWF4（PeDWF4）和CPD （PeCPD）在拟南芥生长发育中的作用背景:植物生长和发育过程中，激素扮演着重要的调控角色。
素类固醇激素是一类重要的植物细胞分化和生长激素。
它们通过一系列酶催化反应合成，并通过调控基因表达来实现其功能。
在素类固醇激素的合成途径中，基因DWF4和CPD被认为是关键的调控因子。
然而，胡杨油菜植物中这两个基因的功能还不清楚。
因此，本研究旨在探究胡杨油菜中基因DWF4和CPD在拟南芥生长发育中的作用。
材料与方法:通过RT-PCR技术从胡杨油菜中克隆得到DWF4和CPD基因的全长cDNA序列。
然后利用农杆菌介导法将克隆的基因片段转入拟南芥中。
转基因拟南芥经过筛选和鉴定之后，进行了一系列生长和发育相关的观察和实验。
结果:通过RT-PCR分析，我们成功获得了胡杨油菜中DWF4和CPD基因的全长cDNA序列。
经过转基因拟南芥的筛选和鉴定，我们成功地获得了DWF4和CPD基因过表达和抑制的转基因植株。
我们对这些转基因植株进行了一系列的实验观察。
首先，我们分析了DWF4和CPD基因在拟南芥中的表达水平。
结果显示，DWF4基因过表达植株的素类固醇激素含量显著增加，而CPD基因抑制植株中素类固醇激素含量显著降低。
这表明DWF4和CPD基因在拟南芥中确实参与了素类固醇激素的合成调控。
其次，我们观察了DWF4和CPD基因调控的拟南芥植株的生长和发育特性。
实验结果显示，DWF4基因过表达植株的株高和根长显著增加，叶片的面积也明显增大。
与之相反，CPD基因抑制植株的株高和根长明显减少，叶片的面积也较小。
这些结果表明DWF4和CPD基因调控了拟南芥的生长发育过程。
最后，我们还对DWF4和CPD基因调控的拟南芥植株进行了染色体末端长度测定（TLAS）实验。
结果显示，DWF4基因过表达植株的染色体末端长度略长于野生型植株，而CPD基因抑制植株的染色体末端长度略短于野生型植株。
油菜素内酯调控植物生长发育及产量品质研究进展
油菜素内酯调控植物生长发育及产量品质研究进展油菜素内酯（brassinosteroid，BR）是一类植物内源性类固醇激素，广泛参与植物的生长发育和逆境应答。
近年来，随着BR生物学研究深入，人们对BR的调控植物生长发育和产量品质的作用也越来越关注，本文将从BR生物学基础、BR作用机理、BR对植物生长发育的调控、BR对产量品质的调控这四个方面进行论述。
1. BR生物学基础BR最早发现于油菜籽中，故得名为油菜素内酯。
BR主要存在于植物的茎、叶、花和果实等部位中，具有脱落酸核苷酸（castasterone，CS）、油菜酮（brassinolide，BL）和古铜酸（teasterone，TE）等几十种结构异构体。
BR合成途径复杂，涉及多个酶催化步骤，其中最重要的是保加利亚大麦单胺氧化酶（DWF5，在BR分子结构的合成中发挥关键作用，BR的合成过程就是一系列的氧化还原反应，涉及多个氧化酶和还原酶的作用。
2. BR作用机理BR的作用机理分为两个方面：BR受体和BR信号转导。
BR受体主要为BRI1（BR insensitive 1）和BRI1-like（BRL）家族成员，BRI1为BR生物合成过程中的受体样激酶，可以在细胞膜上通过结合LRR蛋白（Leucine-rich receptor-like protein kinase）作为配体，进而使其激活并产生反应。
BRI1信号转导过程中，BZR1（BRASSINAZOLE-RESISTANT 1-like）和BES1（BRI1-EMS-SUPPRESSOR 1-RELATED）是启动子结合蛋白家族成员，它们参与BR途径下游基因的激活及阻遏，影响植物生长和发育的调节。
4. BR对产量品质的调控BR通过调控植物的生长发育和相关基因的表达来影响产量和品质。
BR的应用可以显著提高水稻、小麦、马铃薯、黄瓜、苹果和葡萄等作物的产量和品质。
例如，应用BR预处理可以提高水稻的光合作用效率和小麦的灌浆期、增加干物质积累率和籽粒的产量品质。
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拟南芥油菜素内酯合成关键酶DWF4的功能研究
拟南芥油菜素内酯合成关键酶DWF4的功能研究
摘要：
油菜素内酯（brassinosteroids，BRs）是一类植物内源性类
固醇类激素，调控植物生长发育过程中起到关键作用。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为模式植物，DWF4被鉴定为油
菜素内酯合成的关键酶。
本研究通过对DWF4功能进行深入研究，揭示了DWF4在拟南芥BRs生物合成途径中的重要作用。
引言：
拟南芥是一种广泛运用于植物生物学研究的模式植物，因其基因组已被完整测序，而受到研究者的广泛关注。
油菜素内酯是一类重要的植物生长素，通过调节植物的生长发育过程发挥着重要作用。
而DWF4作为油菜素内酯合成途径中的一个关键酶，是了解和揭示油菜素内酯合成和信号传递途径的关键。
因此，对DWF4功能的研究具有重要意义。
材料与方法：
本研究选取拟南芥作为研究对象，通过构建DWF4基因敲除突
变体进行功能分析。
首先，利用PCR扩增技术获得DWF4基因
敲除突变体。
然后，通过分析突变体的表型特征进行相关功能研究。
最后，通过基因表达差异分析、蛋白互作研究和代谢物分析等手段阐述DWF4在拟南芥BRs生物合成途径中的功能。
结果与讨论：
通过观察和对比DWF4基因敲除突变体和野生型拟南芥的生长
发育情况发现，DWF4基因敲除突变体在植株高度和花期等方
面表现出显著的差异。
进一步的研究发现，DWF4基因敲除突
变体的花序较为紧凑，雄蕊和雌蕊的数量也有所减少，而野生型则表现出较正常的生长发育特征。
通过基因表达差异分析发现，DWF4的敲除导致了与油菜素内酯生物合成途径相关的其他基因的表达变化，如ABA合成相关基因和赤霉素合成相关基因。
这表明DWF4通过调控其他基因的表达参与BRs合成途径的调控。
通过蛋白互作研究，发现DWF4与其他BRs合成途径相关的酶存在相互作用关系，如DWARF1、DWARF7等。
这些发现进一步支持了DWF4在BRs合成途径中的关键作用。
通过代谢物分析，发现DWF4基因敲除突变体中BRs的含量显著下降。
这进一步证明DWF4是油菜素内酯合成关键酶。
结论：
本研究揭示了拟南芥油菜素内酯合成关键酶DWF4的功能。
通过对DWF4基因敲除突变体的研究，证明DWF4在拟南芥BRs合成途径中发挥着重要的调控作用。
DWF4调节其他BRs合成途径相关基因的表达，与其他酶发生蛋白互作，并直接影响BRs 的合成。
这些发现对进一步研究油菜素内酯的生物合成途径和信号传递机制具有重要的理论和实践意义。
致谢：
感谢本研究的资助单位和参与者的辛勤工作和支持。
感谢论文中所提到的其他研究成果的作者们的努力与奉献。
本研究通过基因表达差异分析、蛋白互作研究和代谢物分析，揭示了拟南芥油菜素内酯合成关键酶DWF4的功能。
研究发现DWF4通过调控其他基因的表达参与了BRs合成途径的调控，并与其他BRs合成途径相关的酶发生蛋白互作。
此外，DWF4的敲除导致BRs含量显著下降，进一步证明了其作为油
菜素内酯合成关键酶的重要性。
这些发现对油菜素内酯的生物合成途径和信号传递机制的研究具有重要的理论和实践意义。
感谢所有支持和参与本研究的单位和个人的辛勤工作与贡献。