生物技术前沿进展之二RTPCR
标准终点RTPCR
标准终点RTPCR实时荧光定量PCR（real-time PCR）是一种高灵敏度、高特异性的核酸检测技术，广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、遗传疾病诊断等领域。
在实时荧光定量PCR技术中，终点PCR是一种常用的PCR方法，它可以通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。
本文将介绍标准终点RTPCR的原理、方法和应用。
1. 原理。
标准终点RTPCR是一种半定量PCR技术，其原理是利用DNA或RNA模板，在PCR反应体系中进行多轮扩增，通过检测PCR反应终点的荧光信号来定量目标DNA或RNA的含量。
在PCR反应中，每一轮循环都会产生指数级增加的DNA或RNA产物，同时伴随着荧光信号的累积。
当PCR反应达到饱和时，荧光信号会呈指数级增加，最终趋于平稳。
通过检测PCR反应终点的荧光信号强度，可以确定起始模板的含量，从而实现对目标DNA或RNA的定量分析。
2. 方法。
标准终点RTPCR的方法包括PCR反应体系的准备、PCR程序的设置、荧光信号的检测和数据分析等步骤。
首先，需要准备PCR反应体系，包括模板DNA或RNA、引物、荧光探针、聚合酶等。
然后，设置PCR程序，包括预变性、PCR扩增和荧光信号采集等步骤。
在PCR扩增过程中，荧光信号会随着PCR产物的累积而增加，直至达到饱和。
最后，通过荧光检测仪器采集PCR反应终点的荧光信号，并进行数据分析，得出目标DNA或RNA的定量结果。
3. 应用。
标准终点RTPCR技术在科学研究和临床诊断中具有广泛的应用价值。
在基因表达分析中，可以利用标准终点RTPCR技术对特定基因的表达水平进行定量分析，从而揭示基因调控网络和信号转导通路。
在病原微生物检测中，可以利用标准终点RTPCR技术对病原微生物的核酸进行定量检测，实现对病原微生物的快速、准确的诊断。
在遗传疾病诊断中，可以利用标准终点RTPCR技术对患者的遗传物质进行定量分析，为临床诊断和治疗提供依据。
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR全称为逆转录聚合酶链式反应，是一种用于检测RNA的技术。
它结合了逆转录和聚合酶链式反应的步骤，可以将RNA转录成cDNA，然后进行扩增和检测。
这种技术在分子生物学和医学诊断中得到了广泛的应用，尤其在病毒检测和基因表达分析方面有着重要的作用。
RT-PCR的原理主要分为三个步骤，逆转录、PCR扩增和检测。
首先是逆转录，即将RNA转录成cDNA。
这一步骤需要逆转录酶和引物，逆转录酶能够将RNA模板转录成cDNA，引物则是用来引导逆转录酶的合成。
在逆转录的过程中，引物将与RNA模板结合，逆转录酶将在引物的引导下合成cDNA链。
这样就得到了cDNA模板，为后续的PCR扩增提供了基础。
接下来是PCR扩增，即利用聚合酶链式反应对cDNA进行扩增。
在PCR反应中，需要两种引物，分别是前向引物和反向引物。
这两种引物将在PCR反应中与cDNA模板配对，聚合酶将在引物的引导下合成新的DNA链。
通过多轮的PCR反应，可以将目标DNA序列扩增到可检测的水平。
PCR扩增是RT-PCR技术的关键步骤，它能够快速、高效地扩增目标DNA序列，为后续的检测提供了充分的材料。
最后是检测，即对扩增后的DNA进行检测分析。
常用的检测方法包括凝胶电泳、实时荧光定量PCR和测序等。
凝胶电泳是一种常规的检测方法，通过电泳将扩增后的DNA分离并观察。
实时荧光定量PCR则是一种高灵敏度和高特异性的检测方法，可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而定量分析目标DNA的含量。
而测序则是一种直接测定DNA序列的方法，可以准确地确定目标DNA的碱基序列。
这些检测方法可以根据实际需求进行选择，以满足不同的研究和临床应用。
总的来说，RT-PCR技术通过逆转录、PCR扩增和检测三个步骤，实现了对RNA的检测和分析。
它具有高灵敏度、高特异性和高效性的特点，可以广泛应用于基因表达分析、病毒检测、肿瘤诊断等领域。
随着生物技术的不断发展，RT-PCR技术也在不断完善和改进，为科研和临床诊断提供了强大的工具和支持。
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增的技术。
它是PCR技术的一个变种，常用于检测RNA病毒、研究基因表达等领域。
下面将详细介绍RT-PCR的原理。
首先，RT-PCR的第一步是将RNA转录成cDNA。
这一步需要使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）来完成。
逆转录酶能够将RNA模板上的核糖核酸序列转录成互补的DNA序列。
在这一步中，需要加入一条引物（primer），它会与RNA模板上的特定序列结合，作为逆转录酶合成cDNA的起始点。
接下来，转录生成的cDNA会作为PCR的模板进行扩增。
PCR扩增是通过DNA聚合酶（DNA Polymerase）在不断变换的温度下进行的。
首先是变性，将双链DNA变性为两条单链DNA。
然后是退火，引物与模板DNA结合。
最后是延伸，DNA聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
这样，经过多轮循环，就可以将少量的RNA扩增成大量的DNA。
RT-PCR的原理可以通过以下几个关键步骤来概括，首先是逆转录，将RNA转录成cDNA。
然后是PCR扩增，通过多轮循环将cDNA扩增成大量的DNA。
最终，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法来检测扩增产物。
RT-PCR的原理在实际应用中有着广泛的意义。
例如，在病毒检测中，可以通过RT-PCR来检测病毒RNA，从而进行病毒的早期诊断和监测。
在基因表达研究中，可以通过RT-PCR来检测特定基因的mRNA水平，从而了解基因的表达情况。
此外，RT-PCR还可以用于克隆特定基因、分析基因多态性等领域。
总的来说，RT-PCR是一种重要的分子生物学技术，其原理简单清晰，应用广泛。
通过将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增，可以快速、准确地检测目标RNA的存在，从而在医学诊断、基因表达研究等领域发挥重要作用。
rtpcr原理
rtpcr原理RT-PCR原理。
RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种用于检测RNA的技术，它能够将RNA转录成cDNA，再进行PCR扩增，从而实现对RNA的定量和定性分析。
RT-PCR技术在医学诊断、生物学研究和疾病治疗等领域具有广泛的应用。
首先，RT-PCR的原理是基于PCR技术。
PCR技术是一种体外扩增DNA的方法，通过不断重复DNA的变性、退火和延伸，从而在短时间内扩增出目标DNA片段。
在RT-PCR中，首先需要将RNA转录成cDNA，然后再进行PCR扩增。
这样一来，就可以通过PCR技术对RNA进行扩增和分析。
其次，RT-PCR的关键步骤是RNA的逆转录。
逆转录是指将RNA模板转录成cDNA的过程，这一步骤需要逆转录酶和引物的协同作用。
首先，RNA模板与引物结合形成引物-RNA复合物，然后逆转录酶将RNA模板转录成cDNA。
逆转录过程中，逆转录酶具有RNA依赖的DNA聚合酶活性，能够合成cDNA链。
经过逆转录，就得到了cDNA，为后续的PCR扩增提供了模板。
接下来，PCR扩增是RT-PCR的另一个重要步骤。
PCR扩增是通过DNA聚合酶在一系列变性、退火和延伸的循环中，对DNA模板进行扩增。
在RT-PCR中，cDNA作为模板，与引物和DNA聚合酶一起进行PCR扩增。
引物是针对目标基因的特异性引物，能够在PCR反应中特异性地结合到目标序列上。
通过PCR扩增，可以快速、高效地获得目标基因的扩增产物。
最后，RT-PCR的结果分析是基于扩增产物的检测。
扩增产物可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法进行检测和分析。
凝胶电泳是一种常用的扩增产物分析方法，通过电泳将扩增产物分离，并通过染色剂染色后观察。
而实时荧光定量PCR则是一种精准、快速的扩增产物定量分析方法，通过实时检测PCR反应体系中的荧光信号，可以实现对扩增产物的定量分析。
RT-PCR百度百科
概念RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。
逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。
在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。
由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。
随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。
原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。
RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。
RT-P CR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。
（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。
）RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。
为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative P CR)。
实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内D NA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。
real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”[编辑本段]PCR技术相关试剂A液：变性液B液：醋酸钠溶液C液：酚／氯仿／异戊醇混合液（50：49：1）D液：异丙醇E液：75％乙醇F液：DEPC处理的灭菌去离子水G液：RNA酶抑制剂H液：反转录反应液I液：反转录酶J液：PCR反应液K液：Taq DNA聚合酶(0.5u／µl)L液：矿物油M液：50倍TAE电泳缓冲液N液：溴化乙锭溶液0液：上样缓冲液[编辑本段]PCR各步骤的目的（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。
RTpcr技术的原理
RTpcr技术的原理RTpcr技术（逆转录聚合酶链反应技术），是一种基于聚合酶链反应（PCR）原理和逆转录酶（reverse transcriptase）的技术。
逆转录是一种生物学过程，它将RNA转录成相应的DNA。
这项技术在分子生物学和生物医学研究中广泛应用，特别用于病原体检测、基因表达研究和疾病诊断。
1. RTpcr技术的基本原理RTpcr技术的基本原理是先利用逆转录酶将目标RNA转录成cDNA（亦称为反转录，即逆转录），然后以cDNA作为模板进行PCR扩增。
整个过程分为两个关键步骤：逆转录和PCR反应。
2. 逆转录过程逆转录过程是RTpcr技术的第一步，其目的是将RNA转录成cDNA。
逆转录酶是这一步的关键酶类，它能够将RNA作为模板，并合成相应的cDNA。
常用的逆转录酶有AMV逆转录酶、M-MuLV逆转录酶和Tth逆转录酶等。
逆转录过程包括以下步骤：1.首先，逆转录酶结合到引物上，在低温下发生结合反应，形成逆转录酶-引物复合物。
2.然后，复合物结合到RNA模板上，在合适的反应条件下，逆转录酶开始合成新的cDNA链。
3.在合成过程中，逆转录酶通过酶的核酸酶活性，将RNA模板逐渐降解，最终产生单链cDNA。
4.最后，通过加热反应停止并灭活逆转录酶。
3. PCR反应过程PCR反应是RTpcr技术的第二步，其目的是扩增cDNA。
PCR反应是通过三步循环反应不断倍增DNA，使其产生指数级的增加。
PCR反应包括以下步骤：1.Denaturation（变性）：将PCR反应体系加热至95℃，使DNA双链解开为两根单链。
2.Annealing（退火）：将反应体系降温至适合引物结合的温度，引物与目标序列互补结合。
3.Extension（延伸）：将反应体系温度升高至逆转录酶的最适温度，逆转录酶开始在引物的引导下合成新的DNA链。
以上三个步骤循环进行，每个循环使DNA序列倍增一倍。
通过适当的循环次数，可以将最初微小的DNA片段扩增至足够数量。
rtpcr步骤及原理
rtpcr步骤及原理RTPCR步骤及原理摘要：反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种常用的分子生物学技术，用于定量检测RNA或DNA中特定序列的数量。
本文将介绍RTPCR的步骤和原理，包括反转录、PCR扩增和结果分析等方面。
同时也会讨论RTPCR的优点、限制和在科研和临床中的应用。
引言在生物医学研究和临床实践中，准确测定RNA或DNA中特定基因或序列的表达水平或存在数量是非常重要的。
反转录聚合酶链反应（RTPCR）是一种被广泛应用的技术，能够对目标序列进行定量和扩增。
一、反转录反转录是RTPCR的第一步，也是从RNA到cDNA的转录过程。
这一步骤利用反转录酶将RNA模板转录成互补的cDNA。
反转录的关键是一条RNA模板和逆转录酶的结合，逆转录酶能够将RNA依据其互补碱基配对的原则合成cDNA。
反转录需要一些关键的试剂，如RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs等。
RNA模板是目标序列的来源，逆转录酶则是反转录的关键酶。
引物是用于使逆转录酶能够开始合成cDNA运输链的小片段，而dNTPs则是逆转录酶用来合成cDNA的原料。
二、PCR扩增PCR扩增是RTPCR的第二步，也是从cDNA扩增目标序列的过程。
PCR扩增是利用聚合酶将靶DNA序列经过多次循环扩增成数量可检测的水平。
PCR扩增需要两个引物，一个用于标记出序列的起始点，一个用于标记出序列的终止点。
PCR扩增需要通过一系列的循环反应来不断扩增目标序列。
每个循环有三个关键步骤：变性、退火和延伸。
变性是通过高温来使DNA 的两个链分离，退火是通过低温使引物与靶序列结合，延伸则是通过温度合适的聚合酶来合成新的DNA链。
三、结果分析RTPCR的结果分析可以通过几种不同的方法进行，最常见的是凝胶电泳和实时定量PCR。
凝胶电泳是一种常见的分离DNA片段的方法，可以将PCR扩增的产物根据大小分离成不同的带状，在凝胶上的迁移速率还可以推测出片段的大小，并对扩增的特定基因进行定性和定量分析。
rtpcr的作用
rtpcr的作用什么是rtpcrrtpcr（全称为逆转录聚合酶链反应，Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction），是一种基因检测技术，可以用于检测RNA分子在样本中的存在并量化。
rtpcr的原理rtpcr技术基于聚合酶链反应（PCR）的原理，通过逆转录将RNA转化为反义DNA （cDNA），然后使用一对特定的引物（primers）扩增目标基因的DNA片段。
逆转录过程中，逆转录酶将RNA模板反向转录合成cDNA，在PCR反应中，DNA聚合酶通过引物将cDNA扩增成大量的DNA。
这个过程可以使我们检测到RNA分子的存在，并量化RNA的数量。
rtpcr的应用rtpcr技术在生物医学研究和临床诊断中有着广泛的应用，特别是在疾病的诊断和治疗中起着重要作用。
1.病原体检测：rtpcr可以检测感染性疾病的病原体，如病毒和细菌。
通过扩增病原体酸核酸的特定片段，可以快速准确地诊断出病原体感染。
2.基因表达分析：rtpcr可以评估基因在不同组织或细胞中的表达水平。
通过对比不同样本中目标基因的表达差异，可以研究基因在生理和病理过程中的调控机制。
3.肿瘤检测：rtpcr可以检测肿瘤标志物，通过扩增患者体液或组织中的肿瘤相关基因，可以及早诊断出肿瘤，进行早期治疗。
4.遗传疾病诊断：rtpcr可以检测遗传疾病的突变基因，帮助医生确定患者是否携带致病基因，并进行遗传咨询和干预。
5.药物研发：rtpcr可以评估药物对特定基因的调控作用，在新药研发中有着重要的应用价值。
rtpcr的优势和局限性rtpcr技术相比传统的基因检测方法具有以下优势：•高灵敏度：可以检测到非常低浓度的目标RNA，并能够量化RNA的表达水平。
•高特异性：通过引物的设计，可以选择性地扩增目标基因，减少误报率。
•高准确性：可以重复多次扩增同一样本，并获得可重复的结果。
然而，rtpcr技术也存在一些局限性：•需要引物设计：需要针对目标基因设计特异引物，这对于一些未知基因或变异较多的基因可能存在困难。
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什么是Real Time PCR?
实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术 Technology to monitor, in real-time, the PCR
amplification of specific nucleic acid targets
2
Cycle 3 Filter A Sample 1 Bin N
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Real Time PCR是如何实现的?
最后，Real Time软件会对采集到的数据进行分析
6
Real Time PCR化学原理
荧光信号是怎样随着PCR产物的增加而增加的呢？
TaqMan®
SYBR® Green I
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TaqMan® 化学原理 (又称 5’-Nuclease )
8
TaqMan® 化学原理
• TaqMan® 中会使用到两段短片段序列，称为双向 特异引物
9
TaqMan® 化学原理
• TaqMan® 中第三段短片段序列称为探针，结合到 序列中间
10
TaqMan® 化学原理
• 探针标记两种 染料分子
报告染料 Reporter dye
淬灭染料 Quencher dye
11
TaqMan® 化学原理
• 完整的探针
报告染料 Reporter dye
淬灭染料 Quencher dye
12
TaqMan® 化学原理
• 完整的探针
光 (激发)
能量
报告染料Reporter没有荧光信号
13
TaqMan® 化学原理
• 如果探针断裂了……
光 (激发)
14
TaqMan® 放映开始
Real Time PCR是如何实现的?
在PCR混合液中含有荧光物质（fluorescence）
3
Real Time PCR是如何实现的?
随着扩增的进行, 荧光信号会随着PCR产物的增加 而增加
PCR
PCR product
Lots of PCR
PCR
4
Real Time PCR是如何实现的?
Real-time PCR仪会纪录每个循环的荧光信号变化
15
TaqMan® 化学原理
• Denaturating of template（模板变性）
16
TaqMan® 化学原理
• Annealing of oligos（引物退火）
17
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 登场……
18
TaqMan® 化学原理
• 找到引物序列……
19
TaqMan® 化学原理
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Ct值的获得
• 基线决定阈值
− Linear图里找基线，基线 对应 曲线形状
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Ct值的获得
• 阈值决定Ct值
− Log图里找阈值，指数期 对应 阈值
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AB 支持3种技术应用
End-point 终点检测
Presence/Absence
++- +
Allelic Discrimination
Threshold
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Threshold 阈值的设置
• 最佳位置: Xn = X0 ·2n 成立（指数/对数扩增期）
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Threshold 阈值的设置
• 软件自动设定阈值
62
Threshold 阈值的设置
• 软件自动设定阈值
− 对于不同的批次的实验，需要单独设置阈值 因为不同批次的实验，会有不同的指数/对数扩增期
• 优点 − 价格便宜
− 大部分基因以及少量样品均适 用
• 缺点 − 价格稍贵
• 缺点 − 特异性稍差 − 必须要做 Melt curves − 不支持多重荧光设计 − 实验方法通常需要优化
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Real Time PCR实际状态
线形图谱Linear
半对数图谱Log
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Real Time PCR常用术语
可能产生 非特异性PCR产物信号
定量结果不准确
49
SYBR® Green I 化学原理
• 使用 Melt curve (Dissociation Curve) 检查PCR反 应产物的特异性 原始图谱
Fluorescence
Temperature
50
SYBR® Green I 化学原理
• 使用 Melt curve (Dissociation Curve) 检查PCR反应 产物的特异性 导数图谱
• Taq酶 开始降解探针
27
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
28Biblioteka TaqMan® 化学原理• Taq酶 开始降解探针
29
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
30
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
31
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
23
TaqMan® 化学原理
• Extension of primers（序列延伸）
24
TaqMan® 化学原理
• Extension of primers（序列延伸）
?
25
TaqMan® 化学原理
• Taq酶 很特别……
具有核酸外切酶活性， 可以“吃掉”结合到模板上的
DNA片段
26
TaqMan® 化学原理
Real-time 实时检测
Quantitative PCR
68
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
69 | Life Technologies Proprietary & Confidential | 11/26/2020
嗝!
43
TaqMan® 化学原理
• 新的序列，新的信号！
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SYBR® Green I 化学原理
45
SYBR® Green I 化学原理
46
SYBR® Green I 化学原理
47
SYBR® Green I 化学原理
• 新的序列，新的信号！
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SYBR® Green I 化学原理
非特异结合任意 双链DNA
• Baseline 基线
定义背景区域: cycle-to-cycle 的范围
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Baseline 基线的设置
• 通常基线起点为 Cycle 3 …
56
Baseline 基线的设置
• 通常基线终点设置在实验信号脱离噪音信号上升前
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Baseline 基线的设置
• 软件自动设置基线
软件自动为您 选定基线区域
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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TaqMan® 化学原理
• Taq酶 开始降解探针
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Real Time PCR常用术语
• Cycle threshold （又称 Ct值） 扩增曲线与阈值的焦点，对应的带小数点的循环数
This curve crosses the threshold at cycle 23.1
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Ct值的获得
• 自动分析 • 手动分析
− 基线决定阈值 − 阈值决定Ct值
• Extension of primers（序列延伸）
20
TaqMan® 化学原理
• Extension of primers（序列延伸）
21
TaqMan® 化学原理
• Extension of primers（序列延伸）
22
TaqMan® 化学原理
• Extension of primers（序列延伸）
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Baseline 基线的设置
• 软件自动设置基线
− 每个样品单独设置基线。 − 可以使每个样品拥有 “完美” 基线。 − 可以照顾到既有高浓度样品也有低浓度样品的实验。
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Real Time PCR常用术语
• Threshold 阈值 在扩增曲线上，可以调节的一条水平线 告诉软件到哪里获得分析数据
Fluorescence
51
Temperature
Real Time PCR化学原理
• 每个循环之后
− 理论上，反应管里的目标片断数会加倍。 − 荧光信号相应成比例增长。
52
Real Time PCR化学原理
TaqMan®, 还是 . . . SYBR® Green I ?
• 优点 − 更高的特异性 − 不会有引物二聚体干扰 − 支持多重荧光实验设计 − 实验方法易于优化