基因克隆及常见问题分析 (1)
克隆常见问题指南
克隆常见问题汇总指南评价连接反应效率评价连接酶活性连接成功转化问题连接不成功连接酶失活连接酶有活性DNA 质量差DNA 末端不兼容克隆用内内切酶错误载体和插入片段均未磷酸化PCR 产物酶切不充分平末端化不充分酶污染载体自身环化载体酶切不完全非特异PCR产物被克隆酶污染抗生素浓度过低卫星克隆PCR 引物序列错误UV 损伤DNA 片段PCR 扩增保真性低详细叙述转化0.1ng的超螺旋载体DNA检测感受态细胞的转化效率。
通常情况下，感受态细胞转化产量至少为1x106转化子/ug超螺旋DNA，相当于0.1ng质粒DNA转化可能产生100个克隆。
1.1.2、T4DNA连接酶降低转化效率转化之前，用氯仿萃取或离心柱纯化使T4DNA连接酶失活。
1.1.3、连接酶没有热失活热失活连接酶可增加转化子产量。
1.1.4、转化时连接混合物过量每50ul感受态细胞最多可转化5ul连接混合物。
1.1.5、大肠杆菌无法忍受克隆的序列检查目标序列是否含有大肠杆菌强启动子或其他可能的毒性元件和反向重复等。
如果克隆基因表达产物对宿主有毒，需选择极低表达背景的启动子和使用低拷贝克隆载体。
1.1.6连接反应的连接酶过量根据载体和外源片段的浓度，选择说明书推荐用量的连接酶。
确保DNA无污染（如过量盐、EDTA、蛋白、酚等），否则会抑制连接效率。
连接前建议凝胶纯化载体和插入片段。
1.2.2、凝胶切割回收时，DNA被UV光损害凝胶切割回收DNA时请选用长波长的(UV360nm)切胶仪。
如果使用短波长的(254-312nm)切胶仪，需要缩短DNA在UV光下的曝光时间（几秒钟）。
UV光照射时，需将凝胶置于玻璃或塑料平板上。
此外，选择可见光染料可在普通光下观察标准琼脂糖凝胶中的DNA。
采用琼脂糖凝胶电泳检测载体的切割效率。
如果载体很难完全切割，可用胶回收试剂盒从凝胶中回收线性化的载体片段。
如果PCR反应有非特异性PCR产物或引物二聚体产生，需凝胶纯化目标PCR产物。
克隆点突变系列常见问题及解决方法
克隆点突变系列常见问题及解决方法一、克隆1)、平板上长不出克隆或克隆数目很少a)、感受态效率低：使用新制备或妥善冻存的感受态细胞，确保转化效率>107 cfu/μg。
每次可设置一组转化质粒的对照实验，以检测感受态细胞的转化效率。
b)、线性化克隆载体和插入片段扩增产物的使用量不足/过量，或者比例不佳：请务必预先检测线性化克隆载体和插入片段PCR产物的浓度。
常用的吸光度测量法极易受DNA纯度、DNA稀释液pH等因素影响，测定值和DNA实际浓度往往偏差非常大。
因此，我们强烈推荐您通过琼脂糖电泳来测定样品中的DNA浓度。
c)、载体和插入片段不纯，抑制反应：未纯化DNA加入重组反应体系内的总体积不应超过4 μl (反应体系体积1/5)。
尝试对线性化载体、PCR产物进行胶回收纯化。
d)、感受态细胞中加入了过多的反应产物：反应产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。
e)、当载体和片段的均大于10K时，克隆效率下降，属正常情况。
f)、少数情况：插入基因本身含细胞毒性，即便有正确克隆也因为克隆细胞无法生长导致试验失败。
2)、多数克隆不含插入片段(假阳性)a)、克隆载体线性化不完全：即使是痕量未完全酶切的载体也会产生很高的转化背景。
提高限制性内切酶使用量、延长酶切反应时间、胶回收纯化酶切产物，都可以有效减少甚至消除环状质粒残留。
b)、反应体系中混入了相同抗性的质粒：PCR扩增模板(扩增克隆载体或者扩增插入片段)为环状质粒。
当扩增产物直接用于重组反应时，残留环状质粒模板会产生较高的转化背景。
尽量使用预线性化质粒作为扩增模板、扩增产物进行DpnI 消化、扩增产物进行胶回收纯化，都可以有效减少甚至消除环状模板质粒残留。
3)、克隆含有不正确的插入片段a)、PCR产物混有非特异扩增产物：优化PCR体系，提高特异性；胶回收PCR产物；鉴定更多的克隆。
b)、载体线性化不完全：如果线性化载体不是由空载体酶切或扩增制备，而是由已插入其他不同片段的载体酶切或扩增制备而成，不完全酶切或残留环状模板质粒将导致很高的转化背景，使部分克隆中含有不正确的插入片段。
克隆筛选技术的使用中常见问题
克隆筛选技术的使用中常见问题克隆筛选技术是分子生物学领域中常用的实验技术之一，它可以帮助研究人员选择特定DNA片段并扩增出来。
然而，在使用克隆筛选技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。
本文将讨论一些克隆筛选技术的常见问题，并提供相应的解决方法。
一、低转化效率克隆筛选技术中，低转化效率是常见的问题之一。
转化是指将外源DNA引入到宿主细胞中的过程，而低转化效率会降低筛选到感兴趣的克隆的机会。
解决方法：1. 优化DNA质量：使用高质量、无降解、无重组和合成错误的DNA样品。
可以通过限制酶切、纯化和鉴定DNA来确保DNA质量。
2. 优化化学转化：调整化学转化的条件，如细胞密度、含钙离子浓度、转化时间和温度等。
同时，合理选择适用的化学转化试剂，如CaCl2 或PEG方法。
3. 使用电转化：电转化可以提高转化效率。
调整电转化的条件和参数，如电压、电容、脉冲数和电极间距等。
二、错误克隆的选择在克隆筛选的过程中，有时会选择错误的克隆。
这可能是因为使用的筛选方法不够精确或特异，或者因为实验操作中的一些技术问题导致克隆选择的错误。
解决方法：1. 优化筛选方法：选择合适的筛选方法，如DNA序列比对、限制酶切分析、PCR检测等。
结合不同的筛选方法，可以提高克隆的选择精度。
2. 设计合理的筛选引物：设计筛选引物时，应确保其特异性和灵敏度。
可以利用特异性引物来筛选特定片段，提高筛选的准确性。
3. 重复实验：进行多次重复实验，并剔除出现重复错误的情况。
通过重复实验可以排除实验误差和技术问题，提高克隆的选择准确性。
三、背景杂交背景杂交是克隆筛选过程中常见的问题，它会导致背景杂交信号过多，干扰到感兴趣的克隆的筛选。
解决方法：1. 设计合适的防背景杂交措施：在实验中采取一些预防措施，如增加DNA浓度、优化杂交温度和时间、添加DNA相互竞争物等，可以减少背景杂交的发生。
2. 使用高质量探针：合理选择和设计探针，确保其特异性和灵敏度。
分子克隆实验技术的使用中常见问题
分子克隆实验技术的使用中常见问题分子克隆技术是一种常用的实验技术，被广泛应用于分子生物学研究、基因工程以及生物医学等领域。
然而，在使用分子克隆技术进行研究或实验的过程中，常常会遇到一些问题。
本文将就分子克隆实验技术的使用中常见问题进行探讨，希望能帮助读者更好地应对这些挑战。
问题一：选择合适的克隆载体在进行分子克隆实验之前，选择合适的克隆载体是非常重要的一步。
克隆载体通常是一种容易携带外源DNA片段的可重复扩增的质粒或噬菌体。
然而，在选择合适的克隆载体时，需要考虑多个因素：1. 大小：载体的大小要适中，不宜过大或过小。
过大的载体可能导致操作不便、扩增困难，而过小的载体则可能限制载入的外源DNA片段的大小。
2. 复制起源：克隆载体应该具有一个可靠的复制起源，这样才能确保在细胞中稳定复制。
3. 选择标记：载体通常会带有一些标记基因，例如抗生素抗性基因。
在使用克隆载体进行实验时，选择合适的标记基因很重要。
问题二：限制性内切酶消化反应优化限制性内切酶消化是分子克隆实验中的重要步骤，用于切割DNA，生成所需的片段，并为之后的操作提供合适的DNA末端。
在进行限制性内切酶消化反应时，常见问题包括：1. 酶切位点不兼容：选择合适的限制性内切酶对于成功完成限制酶切非常重要。
如果酶切位点与目标DNA不兼容，将无法成功进行酶切。
2. 消化条件优化：酶切反应的条件包括酶切酶的浓度、反应温度、反应时间等。
为了获得理想的酶切效果，有时需要进行反应条件的优化。
3. 反切和星切现象：反切是指限制性内切酶在不应该切割的位点上产生切割作用，而星切是指一个酶切酶在DNA样品中的多个不同位点发生非特异性切割。
这些现象可能影响目标DNA片段的纯化和选择。
问题三：插入片段的PCR扩增在分子克隆实验中，为了获得目标DNA片段，常常需要进行PCR扩增。
然而，PCR扩增过程中可能会遇到以下问题：1. 扩增特异性：选择合适的引物是 PCR 扩增的基础。
DNA片段的克隆及常见的问题
北京天为时代科技有限公司
内
容
第一部分：DNA 片段的克隆 第二部分：常见问题及解答
DNA 克隆的目的
目的基因的序列测定及筛选 入门的载体用于基因表达
连接克隆分类（以PCR产物克隆为例）
TA克隆
是目前广泛使用的一种借用中间载体的非定向克隆方法。由于 普通Taq酶扩增得到的PCR产物带有A末端，可以用带有T末端突 出的T载体直接连接。这个方法比较简便，不需要经过双酶切， 对引物设计也没有要求。
酶切连接克隆
PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切 后定向克隆到目的载体上。这种方法的优点是定向连接克 隆，筛选方便。缺点则是PCR产物的酶切和判断比较困难， 另外酶切连接过程本身也相当的费时费力。
TA克隆的流程
I.高纯度的基因资源 II.杂交筛选或PCR扩增目的基因
III.目的基因的纯化 IV.目的基因与T载体的连接、转化 V.目的基因的筛选及鉴定
1.
2.
3.
4.
5.
6.
对 策
6. 7. 8.
7.
8.
常见问题分析
问题三：实验组只有白色菌落（没有蓝色菌落）
原因
1. 2. 3.
未加IPTG/X-Gal或 其失效 抗生素失活，敏感 菌亦能生长 用于制备感受态的 菌株退化，丢失了 某些重要因子
1.
对 策
2. 3.
检查平板是否含有 IPTG/X-Gal 以及是否 新鲜,如平板有问题， 重新制备新鲜平板 复查抗生素的抗性 用于制备感受态的菌 株，传代次数不能太 多（20代以内为佳）
DNA克隆的操作
转化 连接液的体积 复苏 涂布 (IPTG 及 X-gal ) 培养的温度及时间
基因操作原重难点总结
基因操作原理重难点总结1. 基因克隆的宏观策略：答：⑴已知序列同源性的基因的克隆(PCR方法克隆目标基因)：根据已知基因序列信息设计引物，以基因组DNA为模板，扩增出目标基因；⑵定位在质粒上的基因克隆：利用识别六碱基的限制性内切酶酶解质粒DNA，电泳分离，然后用特异探针进行杂交，确定基因片段进行克隆；⑶定位在染色体组上的基因克隆：①杂交方法：ⅰ.用识别四个碱基的限制性内切酶对染色体DNA进行部分酶切，建立基因文库。
再用标记特异探针进行探测，确定目标基因片断，再进行克隆。
ⅱ.利用亚基因文库进行克隆先进行分子杂交，确定基因片断范围，再进行克隆筛选。
②免疫抗体法：利用鸟枪法和表达载体建立基因表达文库；利用目标蛋白质制备抗体，对基因表达文库进行筛选，可直接获得完整的基因。
③利用简并引物的PCR方法：对目标基因的蛋白质进行N-端氨基酸残基分析。
根据氨基酸序列反推目标基因设计简并引物，以基因组DNA 为模板进行PCR扩增，获得目标基因。
④转座子插入失活克隆法：用转座子对目标生物进行突变，筛选突变株，抽提突变株基因组DNA，利用转座子序列信息设计特异探针，进行TAIL-PCR双向扩增，从而获得完整基因。
⑤质粒拯救法：利用带有复制起始位点的转座子进行诱变获得突变株，分离总DNA，酶解、连接、转化和测序。
⑥功能克隆法(基因表达产物应有明显的表型效应)：利用目标基因表达产物的表型效应，从基因文库中筛选目标基因。
⑦通过双杂交系统克隆新基因：通过靶标蛋白利用双杂交系统克隆与该靶标蛋白作用的蛋白质基因。
⑧通过蛋白质组学技术克隆基因：通过肽片断序列获得蛋白质信息，从而在基因组中找到基因位置和序列，根据序列设计引物，扩增克隆该基因。
2. 设计从某一生物中克隆某一基因的技术路线：答：原核生物：从样品中抽提总DNA，部分酶切，构建合适载体——将目标DNA片段与载体连接——转入宿主细胞培养——可以根据该目标基因所表现出的特定表型筛选，或是利用核酸探针杂交法、抗体免疫法和差异杂交法筛选。
基因克隆 操作步骤原理及注意事项
一：提质粒1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA 沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。
2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿 100微升的苯酚充分混匀 12000rpm/s 10min 离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s 离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测补充：酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
基因克隆及常见问题分析 (1)
DNA克隆常见问题之四
阳性克隆率低
原因
1. 2. 3. 4.
1. 2.
PCR产物不纯，非目的条带 亦被克隆 PCR部分产物发生A尾丢失 PCR所用酶不在产物3’端加 A或只是部分加A 片段与载体比例不适
对 策
3.
4.
重新纯化PCR产物 PCR扩增后，尽量少放置，直 接进行后续的回收连接，以防 A尾丢失 除Taq酶外，使用其它酶扩增 的产物在用于TA克隆时都建议 先加A, 再连接 调整片段与载体的比例，控制 在1:3-1:8之间
检查平板是否含IPTG/X-Gal 以及平板是否新鲜制备 复查抗生素的抗性 用于制备感受态的菌株，传 代次数不能太多（20代以内
未加IPTG/X-Gal或其失效 抗生素失活，敏感菌亦能
生长
3.
用于制备感受态的菌株退 化，丢失了某些重要
对 策
2. 3.
为佳）
因子
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4）转有700bp片段的感受态细胞＋抗性平板
5）转有目的片段的感受态细胞＋抗性平板
检查载体效果
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重组子的鉴定方法
准确度高， 一般作为最终鉴定手段
抗性基因
苄青霉素、卡那霉素、 lacZ基因（蓝白斑筛选）
测序
重组子 鉴定
PCR
单酶切/双酶切，鉴定目的 基因连入方向及片段长度
共10分钟
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载体与片段的最佳比例
载体与插入片段最佳摩尔比1:3-1:8
插入片段的量 ＝ （ng）
加入载体的量 （ng）
×
插入DNA片段 长度（kb）
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感受态细胞
感受态细胞的种类：野生型、化学转化型、电转化型 感受态效率的测定： 产生菌落的总数
转化效率＝
铺板DNA的总量
保存：-70℃冻存，避免反复冻融
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TIANGEN感受态细胞
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零背景载体—实验例
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零背景载体—平末端连接
混匀内容物，离心3-5秒
室温反应5分钟
将离心管置于冰上，进行后续的转化反应
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零背景载体—粘末端连接
A
70℃反应5分钟 冰上短暂冷却
B
室温反应5分钟 冰上短暂冷却
4）转有700bp片段的感受态细胞＋抗性平板
5）转有目的片段的感受态细胞＋抗性平板
检查载体效果
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重组子的鉴定方法
准确度高， 一般作为最终鉴定手段
抗性基因
苄青霉素、卡那霉素、 lacZ基因（蓝白斑筛选）
测序
重组子 鉴定
PCR
单酶切/双酶切，鉴定目的 基因连入方向及片段长度
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DNA纯化常见问题及对策
• 凝胶回收无产物或者回收率低 • 回收DNA质量不好
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DNA纯化常见问题及对策
凝胶无回收产物或回收率低
1、胶块太大，未全部溶解 2、起始量少 3、电泳缓冲液老化，PH值 升高 4、使用去离子水进行洗脱 5、洗脱缓冲液用量过少 6、洗脱缓冲液未加在离心柱 中心 1）将胶块切小，增加溶胶时间或是溶胶 液体积 2）增加回收起始量 3）使用新配制的缓冲液进行制胶和电泳 4）最好用试剂盒配备的洗脱液进行洗脱 5）根据起始量使用合适体积的洗脱液 6）应加在离心柱正中间，并放置1～2分 钟，再离心
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克隆方法（以PCR产物克隆为例）
酶切连接克隆
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内容概要
DNA克隆技术简介 DNA克隆实验流程
DNA克隆的要素
DNA克隆常见问题与应对策略
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克隆实验的流程
网上检索 引物设计
PCR扩增 DNA制备 扩增产物 纯化 与克隆载体 连接 转化、 培养
感受态 E.coli制备
生物信息学 分析等
测序检测
PCR或 酶切鉴定
质粒提取
重组克隆 筛选
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DNA 克隆的要素
• • • • 目的DNA片段 连接酶 克隆载体 感受态细胞
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TOP10 DH5α
BL21 BL21plys
化
IPTG,X-gal
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零背景载体
• • 携带致死基因
（无需抗性筛选）
13个酶切位点
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零背景载体—特点
• 零背景：使用携带致死限制酶基因，无需蓝白斑筛选 • 高效：高效连接酶，阳性率>95% • 通用：适合平末端/粘末端PCR产物 • 快速：室温连接5分钟（平末端）/10分钟（粘末端） • 耐受力强：可插入6bp-10kb 的片段
扩增片段末端
粘末端
适合克隆类型 零背景克隆 TA克隆 零背景克隆 TA克隆
零背景克隆
克隆前处理 平端化（平端化酶） 无 无 加A（加尾酶）
平端化（平端化酶）
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目的DNA片段纯化
纯化原因：多余引物、多余dNTP、多余镁离子等，可 能会影响后续连接反应，建议纯化。
TIANGEN六种PCR耐热聚合酶
高扩增效率
高扩增、高保真
高保真
Pfu
Long Taq
长片段扩增
高扩增、高保真、 高特异性
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高特异性
不同DNA聚合酶PCR产物对比
DNA聚合酶 Taq HotMaster Taq
Pfu Taq Plus Long Taq Taq Platinum 平末端 粘末端+平末端 粘末端+平末端 粘末端+平末端 TA克隆 加A（加尾酶）
研究基因表达
其他（如点突变、SNP等）
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克隆方法（以PCR产物克隆为例）
TA克隆—蓝白斑筛选
非定向连接克隆，连接效率高，操作简单，易于长期保存。 可进行测序后对正确克隆扩大培养。
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克隆方法（以PCR产物克隆为例）
零背景克隆—无需蓝白斑筛选
• • • • 目的DNA片段 连接酶 克隆载体 感受态细胞
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T4 DNA连接酶
作用机理
催化相邻DNA链的5’-P末端和3’OH末端以磷酸二酯键结合的反应， 需ATP作辅酶。 本酶不仅可以催化粘末端/平末端 之间的DNA的连接，也可以催化 DNA与RNA之间以及少数RNA之 间的连接。
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DNA纯化常见问题及对策
回收DNA质量不好
洗脱产物含有乙醇残留 洗脱时硅胶膜上有漂洗液残留， 会使洗脱产物中含有乙醇，影
响下游操作。在洗脱前可通过
再次离心或置于50℃烤箱中5－ 10分钟，彻底去除漂洗液。
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DNA 克隆的要素
DH5a
转化效率高达108，适用于 高效DNA克隆和质粒扩增 转化效率高达108，适用于 高效DNA克隆和质粒扩增
克隆感受态细胞
Top10 Top10
BL21 ( DE3)
适合含T7启动子的载体中目 的基因的表达 适合毒性蛋白和非毒性蛋 白的表达
表达感受态细胞
BL21 ( DE3) pLysS
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DNA克隆相关产品
DNA聚合酶
目的片段
DNA纯化试பைடு நூலகம்盒
凝胶回收试剂盒 DNA Marker
DNA 克隆
载体
pGM-T连接试剂盒 pGM-T载体 pGM-T克隆试剂盒 pGM-T平末端加A试剂盒
零背景快速连接试剂盒 感受态细胞 转
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PCR特异性好（单带）
超薄/普通/大量DNA产物 纯化试剂盒 寡核苷酸DNA产物纯化 试剂盒 N96 DNA产物纯化试剂盒 通用型DNA产物纯化试 剂盒
PCR特异性差（多带）
超薄琼脂糖凝胶DNA回 收试剂盒 普通琼脂糖凝胶DNA回 收试剂盒 大量琼脂糖凝胶DNA回 收试剂盒 通用型琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒
检查平板是否含IPTG/X-Gal 以及平板是否新鲜制备 复查抗生素的抗性 用于制备感受态的菌株，传 代次数不能太多（20代以内
未加IPTG/X-Gal或其失效 抗生素失活，敏感菌亦能
生长
3.
用于制备感受态的菌株退 化，丢失了某些重要
对 策
2. 3.
为佳）
因子
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分光光度法
受缓冲体系、样品稀释度、 核酸二级结构、仪器本身等影 响
DNA marker 定量法
EB分子插入DNA分子碱基间， 50ngDNA即可显现清晰条带， 定量方便直观
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TIANGEN公司的Marker
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DNA 克隆的要素
3.
抗生素使用错误
转化后立即涂板忘 记温浴
对 策
2. 3.
使用高效率的感受态细 胞（106以上） 复查质粒抗性，使用正 确的抗生素 转化后温浴45min左右， 让抗性基因得以表达
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DNA克隆常见问题之二
白斑少
原因
1. 2. 3.
4. 5.
A或T突出端丢失 插入片段与载体比例不适 PCR 产物中含有抑制连接 的成分 连接时间不够；温度太高 PCR 产物已经插入，但未 破坏lacZ 基因的翻译框
TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.
内容概要
DNA克隆技术简介 DNA克隆实验流程
DNA克隆的要素
DNA克隆常见问题与应对策略
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DNA 克隆的目的
目的基因的序列测定及筛选 增加目的基因的拷贝，降低后续实验的难度
DNA克隆常见问题之四
阳性克隆率低
原因
1. 2. 3. 4.
1. 2.
PCR产物不纯，非目的条带 亦被克隆 PCR部分产物发生A尾丢失 PCR所用酶不在产物3’端加 A或只是部分加A 片段与载体比例不适
对 策
3.
4.
重新纯化PCR产物 PCR扩增后，尽量少放置，直 接进行后续的回收连接，以防 A尾丢失 除Taq酶外，使用其它酶扩增 的产物在用于TA克隆时都建议 先加A, 再连接 调整片段与载体的比例，控制 在1:3-1:8之间
酶切法
用特异引物以转化细胞为 模板进行扩增
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内容概要