细胞毒实验

细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定
细胞毒T淋巴细胞 (CTL)活性测定是研究机体细胞免疫功 能的重要方法之一。传统的51 Cr释放法虽然有效 ,但也 存在某些不足。随着荧光标记、流式细胞分析和报告基 因等技术的广泛应用 ,促进了寻找灵敏可靠、简单易行 的非同位素法测定CTL活性的方法学研究。
LAK细胞并非是一个独立的淋巴群或亚群，而是NK细胞或T细 胞体外培养时，在高剂量IL-2等细胞因子诱导下成为能够杀 伤NK不敏感肿瘤细胞的杀伤细胞，称为淋巴因子激活的杀伤细 胞（lymphokine activated killer cells,LAK）。目前应用 LAK细胞过继免疫疗法（adoptive immunotherapy）与直接注 射IL-2等细胞因子联合治疗某些肿瘤，已获得一定的疗效。
NK细胞分离方法
• 密度梯度离心
Ficoll 密度梯度离心 Percoll密度梯度离心
• 磁化细胞分离器分离法
同位素释放法
同位素释放法
G0
Na2 51
G1
S
3 125 CrO4、 H-TdR、 I-UdR
New DNA Or Protein
cpm
试验孔cpm均值－自然释放孔 均值 cpm SI 最大释放孔cpm均值－自然释放孔 均值 cpm
1-3
4-6
7-9-1 cells+ 100ul 10% 1640 100ul YAC-1 cells+ 100ul spleen Cells 100ul YAC-1 cells+ 50ul spleen Cells + 50ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 25ul spleen Cells + 75ul 10%1640 100ul YAC-1 cells+ 100ul 1% NP-40 100ul 1% NP-40 + 100ul 10% 1640
5%CO2 37℃培养 2小时
30l /孔 1mol/L柠檬酸
离心，取100ul上清移入新 孔， 37℃孵育10min
酶标仪测吸光度值：
OD570nm
加入底物 100ul/well 结果判定： 室温避光孵育15min
实验步骤
• 单细胞悬液的制备 1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦试皮毛消毒。 2. 于超净台内取出脾组织，放入预先盛有2ml 1640培养液的平皿内。 3. 用纱网将脾组织包裹住，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣 碎。然后用1000ul加样器隔着纱网将细胞悬液吸出，放入50ml 离心管中，用剩 余2ml培养液冲洗，将细胞悬液吸出，也放入同一50ml离心管中。 4. 1000rpm，常温离心10分钟，弃上清，加1ml 1640培养液重悬细胞。 • 细胞计数： 1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中， 混匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取 20ul计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。 2. 调脾细胞浓度至1×107/ml，每组所需总量为1ml 3. 调YAC－1细胞浓度至1×106/ml，每组需2ml
• 因此多年来人们一直试图寻找可以替代51Cr释放法的 CTL活性测定方法，如采用荧光标记、流式细胞分析 和报告基因等技术的灵敏可靠、简单易行的非同位素 测定法。
MTT（或MTS）还原法
本法根据细胞代谢活动与活细胞数直接成比例的原理，通过测定靶细 胞代谢活性的减少来反映效应细胞所致靶细胞的死亡。氧化型MTT进 入细胞后被线粒体脱氢酶还原生成蓝色formazan颗粒，经溶剂溶解后 比色定量，其颜色深浅直接与活细胞数有关，与靶细胞对照孔比较可 计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便易行，无需预标靶细胞，与 51Cr释放法比较相关性好，还可测定淋巴细胞增殖活性和NK细胞活性。 MTT类似物MTS在细胞内还原的formazan产物具有水溶性，性质较稳定， 其测定简单快捷，特别适合于大批量测定。微生物污染可导致本法假 阳性结果。
1.2.1 PE-mAb/FITC-annexin V 荧光标记法 正常细胞的磷酯酰丝氨（PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡时翻转露于 膜外侧，可与annexinV高亲合力结合。研究发现PS外翻为细胞凋亡的早 期事件，先于膜通透性增加所致51Cr或其他染料的释放。将效应细胞与 靶细胞充分共育后，用PE结合的效应细胞特异性单克隆抗体（如CD8PE）标记效应细胞（不能与PE-mABA结合的细胞即为靶细胞），再用 FITC-annexin V标记凋亡靶细胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同 的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞%。本法①简单快捷，无需 预标记，直接将上二试剂加入测定管即可；②与51Cr法相关性好 （r=0.989），在早期时段更为灵敏，还可在进行分析，尤其适用于动力 学分析；③可允许效应细胞与靶细胞长时间共育，对探讨E通过合成及 分泌某些细胞因子（如TNF）而杀伤靶细胞的机理性研究特别有利；④ 可用荧光显微镜观察测定。
同位素释放法
• 应用放射性同位素（ 如51Cr）标记靶细胞， 当靶细胞受到NK细胞攻击，靶细胞被破坏， 释放出51Cr。51Cr辐射γ射线，通过测定受损 伤或死亡靶细胞释放到上清中51Cr的放射脉 冲数 （cpm)，即可计算出NK细胞活性。
同位素释放法
NK细胞
攻击
Cr标记靶细胞
利用测Cr的放射脉 冲得效应细胞活性
培养YAC－1细胞 ＋10%FBS 1640培养液
操作流程
无菌取脾 研磨成单细胞悬液+2ml 1640
调细胞浓度 6 1×10 /ml
（无FBS)
加板(三复孔) 细胞计数 【?/ml】 取20ul细胞+980ul的1640 混匀后取出20ul细胞+20ul台盼蓝
调细胞浓度 7 1×10 /ml
(加法见附图)
细胞毒实验的分类、原理性 检测方法与应用
可健吉70090310 季敏70090312 李壮70090313
2011年11月
分类
原理
检测方法
应用
分类
细胞毒检测技术主要根据原理 不同进行区分
补体依赖细胞毒实验 细胞介导细胞毒实验 抗体依赖性细胞介导细胞毒实验（ADCC) 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）活性测定 淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测定
B
(E:T=100:1）
C
(E:T=50:1）
D
(E:T=25:1）
E
最大释放孔
F
最大释放对照孔
加 法板 方
G
培养基对照孔
200ul 10% 1640
SI=
B,C,D A 实验孔值-自然释放孔值 Max- S自发 ×100%
Max=E-F S自发=A-G
结果处理
算出不同E:T时的SI值，用Excel作图，横坐标 为E:T,纵坐标为SI值。 把用酶标仪读出的原始数据（每人一份）和用 Excel作的图一起贴到实验记录本上。
淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性测 定
肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）活性测定
从肿瘤组织中分离到的淋巴细胞称为“肿瘤浸润性淋巴细胞” （TIL细胞），并发现这种细胞在体外经白细胞介素2刺激后可 大量增殖。这种刺激后增殖的TIL细胞又称之为“肿瘤来源的 激活细胞”。它具有比LAK细胞更强的特异的杀瘤活性。由于 其特异高效的杀瘤活性，在实验研究及临床应用中，已展现出 用于临床治疗肿瘤的良好前景。
1.1.2 Calcein-AM荧光扫描测定法 Calcein acetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一种胞浆荧光标记物，本 身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透 出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共充，再加Fluoro-Quench试剂 （一种以Ca2+螯合的小牛血红蛋白主要成分、还含溴化乙啶试剂，它对 细胞无毒，不能进入活细胞但可能进入膜已破损的死细胞），淬灭培养液 中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞 对照孔（代表细胞100%存活）比较。即可计算效应细胞杀伤靶细胞%。 本法简便可靠，无南收集和转移培养上清，重复性高，变异性小，测定数 据自动输入计算机，适于大批量测定；可测CTL、LAK及NK细胞活性，还 可在光学显微镜或荧光显微镜下直接观察细胞。不足的是对某些高核浆比 的细胞染色效果不太好；Calce-in-AM在高浓度时可能损害细胞功能。
NK细胞可非特异直接杀伤靶细胞，这种天然杀伤活性既不需要预先由抗
YAC-1细胞为Moloney鼠科白血病毒(Mo-MuLV)感染的鼠T淋巴瘤细
胞，对NK细胞敏感，可用于检测NK细胞的杀伤活性。 原致敏，也不需要抗体参与，且无MHC限制。
系统中主要的效应细胞，是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞。
检测方法
• 血红蛋白酶释放法（HbE-Assay）
• 同位素释放法：
51Cr、125I-UdR
、3H-TdR 等
• 乳酸脱氢酶释放法 • MTT比色法 • 测定法
NK细胞介导的细胞毒试验
同位素释放法 乳酸脱氢酶释放法 MTT比色法
原理
NK（natural killer ）细胞属非特异性免疫细胞，为机体的天然免疫
死亡靶细胞 Cr释放
未死亡靶细胞
同位素释放法
• 本法结果准确、重复性好，但存在以下不足：
• ①使用放射性的51Cr不利于安全操作及废物处置，且需特殊测 定仪器； • ②51Cr自发释放率高，常因不同靶细胞标记效率变化差别大而 影响结果判定； • ③51Cr半衰期（27.8天），无法用于需多次测定的动物试验。 • ④细胞共育时间短而试验操作步骤多，不能在单个细胞水平进 行测定。
LDH底物：
2.
3. • 1.
室温避光保存15min。
取出，加入1mol/L柠檬酸， 30l /孔。酶标仪读数前保证没有气泡。 结果测量：用酶标仪测定光密度值：OD570nm。记录结果。